Summary
抵抗血管の細胞培養モデルを説明することで、シグナル伝達経路の内皮細胞、平滑筋や内皮細胞と平滑筋 (myoendothelial ジャンクション) 間の解剖を可能にします。アゴニストまたは蛋白質の隔離、電子顕微鏡、蛍光抗体の選択的なアプリケーションは、この細胞培養モデルを使用して利用できます。
Abstract
Myoendothelial ジャンクション (MEJ) 小径抵抗血管でユニークなシグナリングの創製は、血管緊張や血圧を制御することができますシグナリング プロセス特定の蛋白質の局在を展示します。内皮細胞や平滑筋細胞からの投影は、その小型のためサイズ (〜 1 μ m2の面積平均)、上、MEJ と単独で勉強することは困難です。ただし、我々 は MEJ 形成体外、内皮細胞の極性形成とシグナル伝達タンパク質と抵抗の血管壁内のプロセスの郭清では、血管細胞共培養 (VCCC) と呼ばれる細胞培養モデルを開発しました。動脈。VCCC 多数のアプリケーションには、異なる種類の細胞に合わせて適応することができます。モデルは、0.4 μ m 孔体外でMEJs することができますフォームをフィルターの両側に成長して 2 種類の細胞で構成されています。ここでセルのめっきと内皮細胞の分離を介して VCCC を作成する方法について述べる MEJ、および蛋白質の隔離や活動のため使用することができます平滑筋分数の試金。埋め込み、および免疫蛍光分析用断面、そのまま細胞層でフィルターを固定できます。重要なは、このモデルからの発見の多くは生理学的な関連性を強調し、そのまま抵抗動脈を使用して確認されています。
Introduction
小径抵抗血管の薄い内弾性板 (IEL) は、内皮細胞 (EC) と平滑筋細胞 (SMC) を分離します。セルはこの弾性マトリックスの穴を介して投影し、ギャップ結合チャネル1,2経由でダイレクトに細胞質接続できます。このユニークな構造は、myoendothelial のジャンクション (MEJ) と呼ばれます。MEJ です小 (血管床によって、0.5 μ m x 約 0.5 μ m)、細胞突起主に内皮細胞から成る3,4同様の平滑筋から発生させてよい。調査官の数はシグナル伝達 MEJ、内皮細胞と平滑筋5 間双方向のシグナル化を促進するため特に重要な場所、それはレンダリングに選択的に発生するネットワークの巨大な複雑さを示しています。 ,6,7,8,9,10。
ただし、そのまま動脈、MEJ のシグナル伝達経路の機構的郭清はむずかしい。MEJ から細胞の投影こそ体内MEJ 血管壁から分離することは現在はないです。このため、VCCC モデル1が開発されました。重要なは、VCCC 複製生理的血管内皮形態11 ・頂間の信号の偏波とセル12MEJ 部分。アルファのヘモグロビンは、血管内皮細胞、MEJ に偏光の発見を容易にするこのユニークなモデルだった。これはアルファのヘモグロビン13を表現しない従来培養内皮細胞とは対照的です。微小血管内皮細胞に興味がある研究者は、特に小径抵抗血管で発生するシグナル伝達経路を分析することが目的の場合、VCCC で培養した血管内皮細胞を使用するより適切な場合があります。
2 つ共培養細胞型に小径孔 (直径 0.4 μ m) を持つフィルターを含む頑丈なプラスチック製の挿入を使用すると、セルで層間の移行できなくなります。それはin vivoよりはるかに時間がまだ MEJs、蛋白質のローカリゼーション、シグナルの1二次メッセンジャーなどの生体内の特性の多くを複製セル間の 10 μ m 間隔の結果します。,14します。 さらに、、VCCC セル アゴニストまたは特定の細胞内コンパートメントに拮抗薬の追加を介して信号の種類に固有のターゲットにできます。たとえば、カルシウムをキレート化するためこれら AM で EC を読み込みとフェニレフリン14SMC を刺激します。これにより、共培養モデル15,16,17,18,19,20,21の他の記述と対照をなしてmRNA および蛋白質、分数を含む、異なる MEJ フィルター孔内の異なる画分を分離することについて説明します。この手法、VCCC を添加できます蛋白質活動12蛋白質のリン酸化の12,23, や転写22mRNA の局在の変化の具体的な調査。異なる立体構造11,18,242 つの細胞の種類の培養が可能だが、底部には、フィルターと SMC の上に EC のめっきが、この資料に記載されます。
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Protocol
1.、VCCC のめっきセル
- 文化大 225 cm 2 のフラスコ EC と SMC 70-90% 合流までの 37 ° C で滅菌条件の下で。SMC よりより多くの EC が使用されていることを確認します。プライマリ人間 EC と SMC、SMC の 1 大規模なフラスコに EC の通常 3 の大きなフラスコを使用して場合。
- 下通路で一次電池を使用して、過去の 10 の通路を使用しないでください。共培養する細胞に基づく文化メディアを選択します。主なひと冠動脈 EC、EGM2 MV 成長因子と EBM 2 EC 基底メディアを使用します。プライマリのひと冠動脈 SMC SmGM 2 成長因子と SmBM SMC 基底メディアを使用します。培養細胞で使用する前に、メディアに成長因子を追加します 。
- VCCC 日 1 の構築: 消毒剤 (例えば Cavicide) と大 (150 mm) ペトリ皿と蓋をスプレーし、ペーパー タオルや糸くずのおしりふきで拭いて。70% エタノール (エタノール) ペトリ皿をスプレーし、乾燥空気にフードにそれらを置く 。
- は無菌条件下でフィルター挿入 (材料の表 を参照してください) のプレートを開き、フィブロネクチン溶液で挿入の SMC 側 (フィルターの底側) をコートします。提供 6 ウェル プレートの挿入を維持する、ピペット、フィブロネクチン溶液側フィルターの半分は下カバー (1 mL 以上) であることを確かめて、プレートの底にスリットします 。
- 細胞文化フードでは、室温でフィブロネクチン溶液の後 30 分は、過剰なソリューションや反転、きれいなペトリ皿の半分を下部に配置する真空プレートから挿入を取る。脇を設定します。余分な溶液を吸引するときにフィルター挿入膜を邪魔しないようにこれはプレートの傾斜および挿入の端からソリューションを掃除機をゆっくりによって回避できます 。 SMC のセルが、プレートを持ち上げた後のあらかじめ加温の 2 X トリプシン-EDTA 溶液 3 ml Trypsinize 225 cm 2 フラスコを
- は、トリプシン (3:1、メディア: トリプシン) を中和するために 9 mL SMC メディアを追加します。円錐管に転送、まあと携帯番号を確認する検定にピペット 10 μ L をミックスします 。
- 5 × 5 のセルの個数のカウント ボックス (すなわち 18)、掛けて 10,000 1 mL (180,000) 内のセルの数を取得します。12 mL (216 万 SMC 細胞懸濁液の容量) を乗算します。十分な SMC プレートに井戸の数があることを確認します
。 注: たとえば、1 よくべきである 75,000 SMC を有し従って 18 井戸だろう 135 万合計 SMC。1 mL あたり 180,000 細胞によって必要な 135 万セルを分割してめっきに必要となる細胞の懸濁液の 7.5 mL でこの結果します。必要な最終巻を計算 (18 井戸 x 750 μ L = 13.5 mL)。したがって、細胞懸濁液の 7.5 mL を取る、ボリュームをもたらすに予め温めておいた SMC メディアとよく混ぜるまで 13.5 mL 。
- セル ・ メディア ソリューションのいずれかをこぼさないように注意しながら各フィルターの下側に約 75,000 SMC を含む細胞懸濁液のプレート 750 μ L。上ふたを閉めて一晩 37 ° C の定温器に挿入でシャーレを慎重に転送します
。 注: 他の細胞型の最適なセル密度が経験的に決定される必要があります 。
- 2 日目、2 ml の新鮮な予め温めておいた SMC メディアのきれいな 6 よく料理を埋めます。インキュベーターからプレートを削除します。1 つずつ挿入を取ると吸引、メディアを削除し、SMC メディア 6 よく皿に配置します 。
- 37 で少なくとも 30 分間 0.5% 牛ゼラチン溶液の 1 ml フィルター (EC 側) の反対側のコート ° C
- Trypsinize 3 ml に予め温めておいた 2 の EC の 225 cm 2 flask(s) X トリプシン-EDTA (10 倍希釈滅菌ダルベッコの ' s PBS) ソリューション、プレートから細胞を持ち上げるためにフラスコの穏やかなタップで
。 注: 場合によっては、フラスコを 37 ° C で 1 〜 3 分のためのインキュベーターに配置する必要があります。 トリプシン (3:1) を中和するために 9 mL EC メディアを追加- 一度細胞が、プレートを持ち上げた。円錐管、プールに一緒に転送、まあと携帯番号を確認する検定にピペット 10 μ L をミックスします。
- 5 × 5 のセルの個数のカウント ボックス (すなわち 60)、掛けて 10,000 1 mL (600,000) 内のセルの数を取得します。12 mL (720 万 EC 細胞懸濁液の容量) を乗算します。十分な EC プレートに井戸の希望の番号があることを確認します
。 注: 約 360,000 EC は、ウェルあたり必要があります。たとえば、18 の井戸は 648 万理事会を必要と1 mL あたり 600,000 EC に必要な 648 万セルを分割し、10.8 mL めっきに必要となる細胞の懸濁液のこの結果します。必要な最終巻を計算 (18 の井戸 1 mL = 18 mL x)。したがって、細胞懸濁液の 10.8 mL を取る、最大ボリュームをもたらす 18 mL EC メディアで加温し、優しく再懸濁します 。
- 5 × 5 のセルの個数のカウント ボックス (すなわち 60)、掛けて 10,000 1 mL (600,000) 内のセルの数を取得します。12 mL (720 万 EC 細胞懸濁液の容量) を乗算します。十分な EC プレートに井戸の希望の番号があることを確認します
- 一度細胞が、プレートを持ち上げた。円錐管、プールに一緒に転送、まあと携帯番号を確認する検定にピペット 10 μ L をミックスします。
- 1 mL 各挿入フィルターの上側に 360,000 EC のプレートします。4 日目に 24 時間交換媒体のための 37 ° C で邪魔されずインキュベート細胞ができます。5 日目で収穫 。
2。収穫、VCCC から分数
- 4 ° C の部屋の分離を行い氷のすべての楽器を維持
- は隔離される個々 の挿入数を留意し、MEJ (分離フィルター) のラベル 50 mL チューブに換散バッファーを追加します。その後、ラベル 2 つの 10 mm の料理;EC と smc 。
- 調整方法集中ライセートする必要があります; 15 挿入によっては換散バッファーのボリューム、MEJ 管の換散バッファーを 500 μ l 添加し、シャーレあたり 250 μ L をお勧めします 。
- 作業時間での挿入 1 つ 6 ウェル プレートで。細胞文化フードとし、氷の冷たい部屋への輸送中に吸引
メモ: 次の手順は、1 挿入分離します 。
- ピペット 10 μ L の挿入の SMC 側に 1 × PBS 。
- こすりに挿入の一方の端のセルをセル リフターを使用し、換散バッファーの品詞がある SMC ペトリ皿にリフターからセルを転送
- セル リフターは、皿の中の換散バッファーに触れた後はそれまで完全に一掃し、ペーパー タオルで乾燥した挿入フィルターに触れることを許可しません。スクレイピング SMC フィルターの少なくとも 1 ~ 2 回残りの SMC 細胞の残骸を完全に削除するを繰り返します 。
- は、挿入フィルターの上部/EC 側に上の挿入および 1x PBS のピペット 10 μ L を回します。2.6 および 2.7 細胞スクレーパーと EC のペトリ皿の手順を繰り返します 。
- は、換散バッファーと EC ペトリ皿に、ピペットと転送フィルターの EC 側から残りのセルと PBS スラリーを収集します。MEJ 分数で EC/SMC 混入を最小限にしてフィルターの両側から細胞をこするの非常に徹底的な 。
- は、メスを使って慎重にプラスチック製の挿入からフィルターをカットします。プラスチックからそれの切断 70-80% がこれを行うし、鉗子を使用して、プラスチック製の挿入構造完全にフィルターを引き出します。換散バッファー付け MEJ 50 mL の円錐管にフィルターをかけるし、それは換散バッファーに常駐し、ウェットのままを確認します 。
- の挿入をすべてが処理されるまで、6 のグループで、分離手順を繰り返します 。
- の個別のチューブや料理別の治療グループを維持します 。
- 渦 15 の完全な強さの 50 mL MEJ 円錐管 s またはよく混合されるまで。鉗子、管にタンパク質と液体の最大量を残す、チューブの側の壁に沿ってドラッグすることで円錐 MEJ からフィルターを削除します。このポイントの後、フィルターを破棄します 。
- MEJ 円錐管からすべてのフィルターを取り外した後は、チューブの底にすべての液体とタンパク質をプルする遠心分離機のクイック スピン (最大速度 〜 16,000 x g で 10-15 秒)。独立した小さい遠心チューブに MEJ チューブと EC と SMC ペトリネットの料理の内容を転送します 。
- オプション: MEJ/SMC/EC チューブの内容を超音波氷上 4 3 10 s のパルスを設定または手で優しくホモジナイズしてください 。
- 4時 15 分最大速度 (~ 16,000 x g) 遠心 ° C. ピペット上清しビシンコニン アッセイ法を用いたタンパク質含有のライセート アッセイします 。
3。アン顔 蛍光の収穫をして、VCCC
- 日 5 の VCCC の孵化はインキュベーターからドライブベイ カバーを取り外します。各 1 × PBS で 2 回すすぎ挿入フィルターの下の井戸から SMC メディア オフ吸引細胞文化フードで作業している。EC 側と繰り返し 。
- 穏やかなシェーカーでウォークイン 4 ° C の部屋で 10 ~ 20 分 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加そのままに、プレートの挿入を維持します。5 分の 1 × PBS で挿入フィルターの両側を洗って、2 回繰り返します
。 注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります 。
- プレート、抗体でフィルターの両方の側面を保つ + ソリューションをブロックでブロック、第一次および二次抗体の孵化を実行 (9 mL PBS、25 μ L トリトン X100、50 mg ウシ血清アルブミン、血清 500 μ L)
- メスとプラスチック製の挿入からフィルターをカット、スライドにフィルターをマウントするマウント ハンドルとメディアをマウントを顕微鏡スライド上の場所 。
4。横の蛍光の収穫をして、VCCC
- 日 5 の VCCC の孵化はインキュベーターからドライブベイ カバーを取り外します。細胞文化フード挿入フィルターの両側からメディアを吸引し、1x PBS で 2 回フィルターの各側面をすすいでください 。
- そのまま 6 ウェル プレートの挿入を維持追加 4 %pfa 穏やかなシェーカーのウォークイン 4 ° C の部屋で一晩インキュベートと
。 注意: PFA は毒性があり慎重に処理する必要があります 。
5。埋め込み、VCCC 横の蛍光
- フィルター後の挿入は、およそ 4% で 24 h のため修正されている PFA、70% への転送 EtOH、少なくとも 24 時間は数週間まで 。
- は、自動化されたティッシュ プロセッサ上で実行 (一晩) 長い上フィルターを処理します。プログラムを使用して、次のように: 70% EtOH 30 分、85% エタノール 30 分、95% エタノール 30 分、100% エタノール 30 分、100% エタノール 45 分、100% エタノール 45 分、キシレン 30 分、キシレン 30 分、キシレン 45 分、60 ° C のパラフィン 30 分、60 ° C パラフィン 30 分、60 ° C パラフィン 45 分
- 処理後、収穫されたフィルターを埋め込み駅流動パラフィン、カセット フィルターを維持するのに転送します 。
- は、慎重に鉗子を使用して端にちょうどそれを保持するために、カセットからフィルターを削除します。ハサミで半分にカット フィルター 2 つの半円形の半分の形を形成します。液体パラフィンが付いて金型埋め込みを埋めるのに十分な長いだけ埋め込み駅のコールド プレート部分に 2 の半分の各レイアウトします 。 こうと、断面、中に 1 つ切断されるエッジに向かってフィルターの中心から
- 一度流動パラフィンで満ちている非常に簡単にコールド プレートに埋め込み型に触れる、フィルターの各半分埋め込む埋め込み型 (側をカット);.
- 埋め込み、中にパラフィンが単独でする彼らのために十分に涼しいまでお互いに落ちるから半分を防ぐためにフィルターを保持するために鉗子を使用します。完全に固化するまでのコールド プレートに埋め込み型に移動します
。 注: 製氷皿上のブロックを冷却しわセクションを防ぐことができます 。
6。区分および横の蛍光染色、VCCC
- パラフィン ブロックの区分およびマウント スライド: 5 μ m のセクションをカット、42 ° C の水浴にセクションを配置および正荷電を使用してセクションを拾うスライド。乾燥する 42 ° C のオーブンで一晩のスライドを維持します 。
- 復元手順を開始する前にパラフィンを溶かすための 60 ° C でスライドを焼くし、スライドの VCCC セクションの付着を助けます。簡単に言えば、冷却し、キシレン、100% の 2 つの変更をスライドを水分補給 95% エタノール エタノール、70% の 1 つの変更 EtOH との 2 つの変更蒸留水します 。
- マイクロ波またはスライドの外セクションが落ちることがあります暖房を含む抗原検索方法を避けてください 。
- 実行は 4 ° C で一次抗体と一晩インキュベートし、常温で 1 h の標準ブロック常温洗浄の手順と 1 h の二次抗体が続きます。メディアをマウントと coverslip マウントします 。
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Representative Results
VCCC 用フィルター挿入が小、0.4 μ m 穴。図 1 a、VCCC フィルター挿入の正面ビューは、毛穴、MEJ が生体外で形成できますを示しています。回路図は、一日前に、内皮細胞を反対側 (図 1 b) めっきフィルターの下側にメッキの平滑筋細胞を示しています。セルはメッキ後、EC、MEJ、および SMC の成分は分離の 3 日後にできます。図 2 a、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) が生体内でMEJs25見ても EC の残りの部分を基準にして MEJ 分数で表されます非常にこの例を示します。これらのデータは、そのままの細動脈の血管壁をさたに VCCC の有用性を示しています。
次に, 蛍光抗体法および電子顕微鏡で VCCC が示されています。VCCC はそのままで、横の蛍光の PFA で固定になっています。図 3 aは、平滑筋特定 α 1 アドレナリン受容体と内皮特定ブラジキニン受容体を示しています。ファロイジン染色 F アクチンのまま動脈26に見られる表現を複製し 2 つのセル間 MEJ (白い矢印) でアクチン橋を示しています。図 3 b透過型電子顕微鏡で見た VCCC の断面図に示します、図 3で 3 D のレンダリングされます。VCCC のこれらのビューは、特に蛋白質、受容体、および体外MEJs 微細構造をローカライズする能力を発揮します。
図 1: 血管細胞共培養 (VCCC) のめっきします。(A)正面光挿入フィルター孔の顕微鏡写真。黒い矢印は、個々 の穴を示します。(B)、VCCC をめっきの模式図。日 1 の反転フィルター挿入や下部に SMC をめっきを示しています。2 日目、EC がフィルターの反対側にメッキし、VCCC 収穫まで 6 ウェル プレートでこの構造のままになります。白い矢印は、セルがメッキが成長するフィルターの側を示します。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: タンパク質の濃縮、MEJ で。(A) MEJ (黒いドットとして表示されるゴールド ビーズ) で α グロビンの式を持つマウスの動脈の免疫透過電子顕微鏡像。(B) 式は、EC または SMC 分数対 MEJ 画分に濃縮されてプラスミノゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) を示す西部のしみ。プラスチックの EC はプラスチックの皿上に成長した EC MEJ を形成しないことを示します。スケール バー = 1 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 横蛍光免疫染色及び電子顕微鏡、VCCC の横断面の。(A) 平滑筋や内皮細胞の特定タンパク質の染色。両方の細胞型と体外MEJ (白い矢印) では F-アクチン染色です。電子顕微鏡観察体外2 D (B) の両方の MEJs の微細構造を研究するために使用の例と 3 D. (C)スケール バー = 10 μ m (A);2.5 μ m (B);垂直方向約 2.5 μ m、0.5 μ m 水平方向 (C)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
VCCC は MEJsの in vitro、さたの面で利点の数が特定のアプリケーションのため、VCCC を利用できるかどうかを決定する際の議論のポイントがあります。たとえば、異なる種類の細胞をこのモデルで使用される場合は、最適化するそれ必要があります。ひと初代細胞を用いてウシ大動脈24、または野生型やノックアウト マウスから細胞を分離し、VCCC1,5,14でそれらを使用することが可能です。
MEJ の分離のため、VCCC を使用して、マスターに最も重要な技術は MEJ 分数の純度が過剰な内皮細胞や平滑筋細胞によって変更されていないことを確認するフィルターの徹底的な削りです。私たち西部にしみが付くことであることを示したアルファ ヘモグロビン「純粋な」MEJ 分離13、最高のマーカー内皮細胞画分対 MEJ 分数で強く表現する必要があります。もう一つはパイ-1、25MEJ (図 2) の形成を調節します。これらの堅牢な MEJ 分離の特に良いマーカーありますと感じます。収穫技術で余分な自信は、フィルターが収穫、削り過ぎるし、EC/SMC マーカー25のステンド グラスします。
2 つの主要な方法で実行できる、VCCC におけるタンパク質発現のイメージング:アン顔(図 1 a) または横 (図 3)。2 つの異なる視点からフィルターの穴内のタンパク質の可視化を可能にする両方の準備。アン顔テクニックには、縦を開いてカットし、フラット アウト EC EC 膜と IEL、MEJ が形作ることができる唯一の場所の穴を視覚化する、上向きで固定して動脈が含まれます。蛍光信号、IEL の穴内 MEJ10,27内蛋白質の局在化を示します。これと同じ原理は、パラフィンに埋め込んだり、セクションを作ることがなく、上から EC 膜をイメージングによって、VCCC に翻訳できます。横のメソッドは、マスターにより複雑が SMC 単分子膜 (図 3) 対 EC におけるタンパク質の異なる可視化にとって重要です。
フローやシステムでストレッチの欠如は潜在的な制限が内皮細胞-平滑筋細胞共培養16,19のフローを追加することが可能。それは heterocellular お問い合わせは MEJ シグナル伝達経路の郭清で最も重要な因子であることがありますのでにまだ、生理学的に正確な蛋白質の発現と活性化、静的な条件ができるように表示されます。
抵抗動脈シグナリング、VCCC、特定の細胞型に必ずしも限定されないようを越えてこの技術の複数のアプリケーションがあります。他の共培養モデルが由来内皮細胞や骨芽細胞17、利用または内皮細胞と血液脳関門をモデル化、周皮細胞・ グリア共培養21。血管内皮細胞による腫瘍細胞の転移はまたこのモデル21を使用して定量化することができます。また、フィルターと文化別のセル パラクリン シグナル伝達、テストする 6 ウェル皿の底に入力するかを見て (未発表察) セルの偏光膜の上部に血管内皮細胞を成長細胞を育てることは可能です。白血球や他の循環の細胞は、EC メディアに追加することができ、細胞の接着性が定量化された12をすることができます。さらに、血管内皮細胞障害15,18への応答における増殖と平滑筋移行24などの病態を検討する、VCCC を使用できます。
結論として、我々 は、体外で細胞培養系、信号結合セルの 2 つのタイプ間のプロセスの調査を可能にするから MEJ を分離する方法を提案しました。重要なは、共培養システムは、MEJ の研究に限定されていないと、数 heterocellular 通信を含む特にそれらの質問に答えるに役立つことがあります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、各国用の中心によって支えられた、肺、血液研究所 R01088554、T32HL007284、アメリカの心臓協会の交わりを経て 14PRE20420024 を付与します。我々 は特に、聖ジュード細胞イメージング共有研究コア、ランドール ウェイク フィールドと電子顕微鏡画像のリンダ ・ ホーナー、アダム ストラウブについては代表的な蛍光画像彼女の地下鉄 Bagher などを感謝します。原稿プロトコルに関する貴重なフィードバック。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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