Summary
En celle kultur modell av motstand arterier er beskrevet, slik at dissection signalnettverk trasé i endotelet, glatt muskel, eller mellom endotelet og glatt muskel (myoendothelial krysset). Selektiv bruk av agonister eller protein isolasjon, elektronmikroskop eller immunofluorescence kan utnyttes ved hjelp av denne cellen kultur modellen.
Abstract
Myoendothelial krysset (MEJ), en unik signalnettverk microdomain i liten diameter motstand arteriene, utstillinger lokalisering av spesifikke proteiner og signalnettverk prosesser som kan styre vaskulær tone og blodtrykk. Som det er en projeksjon fra enten endothelial eller glatt muskel cellen, og på grunn av sin lille størrelse (i gjennomsnitt, et område ~ 1 µm2), MEJ er vanskelig å studere i isolasjon. Men har vi utviklet en celle kultur modell kalles vascular celle co kultur (VCCC) som tillater i vitro MEJ formasjon og endothelial celle polarisering disseksjon signalnettverk proteiner og prosesser i vaskulære veggen motstand arteriene. VCCC har en rekke programmer og kan bli tilpasset ulike celletyper. Modellen består av to celletyper dyrket på motsatte sider av et filter med 0,4 µm porene som den i vitro MEJs kan danne. Her beskriver vi hvordan du oppretter VCCC via plating av celler og isolering av endothelial, MEJ, og glatt muskel fraksjoner, som kan brukes for protein isolasjon eller aktivitet analyser. Filteret med intakt celle lag kan være faste, innebygde og inndelte for immunofluorescent analyse. Mange av funnene fra denne modellen har viktigere, bekreftet bruker intakt motstand arteriene, understreker relevansen fysiologiske.
Introduction
I liten diameter motstand arteriene skiller en tynn indre elastiske lamina (IEL) endothelial (EC) og glatt muskelceller (SMC). Cellene kan prosjektet gjennom hull i denne elastisk matrise og foreta direkte cytoplasmatiske tilkoblinger via gapet krysset kanaler1,2. Denne unike strukturen kalles myoendothelial krysset (MEJ). MEJ er en liten (ca 0,5 µm x 0,5 µm, avhengig av vaskulær sengen), mobilnettet projeksjon består hovedsakelig av endotelceller, men kan stamme fra glatt muskel samt3,4. En rekke etterforskere har vist enorm kompleksiteten signalnettverk nettverk som forekommer selektivt MEJ, gjengi det et spesielt viktig sted for tilrettelegging toveis signalering mellom endotelet og glatt muskel5 ,,6,,7,,8,,9,,10.
Men er en mekanistisk Disseksjon av signalveier på MEJ vanskelig i en intakt arterie. MEJ er en mobilnettet projeksjon, er det ikke mulig å isolere en i vivo MEJ fra vaskulære veggen. Derfor utviklet VCCC modell1 . Viktigere, VCCC replikerer fysiologiske endothelial morfologi11 og polarisering signalnettverk mellom apikale og MEJ deler av cellen12. Det var denne unike modellen som lettere funnet som alfa hemoglobin er på endothelial celle, polarisert til MEJ. Dette er konvensjonelt kulturperler endotelceller som ikke uttrykker alfa hemoglobin13. For forskere interessert i mikrovaskulær endotelet, kan det være mer hensiktsmessig å bruke endotelceller som har vært kultivert i VCCC, spesielt hvis hensikten er å dissekere signalveier som forekommer i liten diameter motstand arterier.
Bruke en solid plast setter som inneholder et filter med liten diameter porene (0,4 µm i diameter) å co kultur to forskjellige celletyper hindrer cellene migrerer mellom lagene. Det resulterer i en 10 µm avstand mellom celler som er vesentlig lenger enn i vivo, men fortsatt replikeres mange i vivo kjennetegner MEJs, inkludert protein lokalisering og andre messenger signalering1 , 14. I tillegg til VCCC tillater for målretting cellen spesifikk signalering via tillegg av en Agonistiske eller antagonist bestemt mobilnettet rommet. For eksempel lasting EF med BAPTA-AM til chelate kalsium og stimulere SMC med phenylephrine14. I motsetning til andre beskrivelser av co kultur modeller15,16,17,18,19,20,21gir dette instruksjoner isolerer forskjellige fraksjoner mRNA og protein, inkludert forskjellige MEJ brøken i filteret porene. Tillegg av denne teknikken til VCCC gir spesifikke undersøkelse av endringer i mRNA lokalisering eller transkripsjon22, protein fosforylering12,23og protein aktivitet12. Denne artikkelen vil beskrive plating av EC oppå filteret og SMC på bunnen, men det er mulig å kultur de to celletyper i forskjellige konformasjonen11,18,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plating celler for VCCC
- kultur store 225 cm 2 flasker av EC og SMC under sterile forhold ved 37 ° C, inntil 70-90% confluent. Sikre at brukes mer EU enn SMC; Hvis bruker primære menneskelige EC og SMC, vanligvis 3 store flasker av EU til 1 stor bolle med SMC.
- Bruker primære celler på lavere passasjer og bruker ikke siste passasje 10. Velg kultur media basert på cellene skal co kulturperler. For primære menneskelige coronary arterien EC, kan du bruke EBM-2 EC basale media med EGM2 MV vekstfaktorer. For primære menneskelige koronar SMC, kan du bruke SmBM SMC basale media med SmGM-2 vekstfaktorer. Før bruk med kulturperler celler, legge vekstfaktorer til media.
- Bygging av VCCC dag 1: Spray store (150 mm) Petri retter og lokk med desinfiserende (f.eks Cavicide) og tørk vekk med et papirhåndkle eller lofri kluter. Deretter spray Petri retter med 70% etanol (EtOH) og plassere dem i panseret til luft tørr.
- Åpner platen av filter setter inn (se Tabell for materiale) under sterile forhold og pels SMC siden (undersiden filter) av sette fibronectin løsning. Holde innsatsen i gitt 6-vel plate, Pipetter fibronectin løsningen gjennom side åpninger til bunnen av platen, sørge for at bunnen halvparten av filteret er dekket (mer enn 1 mL).
- Etter 30 min behandling med fibronectin løsning i romtemperatur i celle kultur panseret, ta setter av platen, vakuum alle overflødig løsning, og inverter, plassere i bunnen halvparten av ren Petriskål. Avsatt. Sørg for ikke å forstyrre filteret sett inn membranen når utsuging overflødig løsning; Dette kan unngås ved forsiktig vippe platen og støvsuging løsningen utenfor kanten av sette.
- Trypsinize en 225 cm 2 kolbe av SMC med 3 mL forvarmes 2 X Trypsin-EDTA løsning, og når cellene har løftet av platen, legge til 9 mL SMC medier å nøytralisere trypsin (3:1, media: trypsin). Overføre til en konisk tube, bland godt og Pipetter 10 µL på en hemocytometer å finne celle nummer.
- Antallet celler i 5 x 5 bokser (dvs. 18), multiplisere dette med 10 000 for å få antall celler i 1 mL (180.000). Deretter multiplisere med 12 mL (totalt volum av cellen suspensjon 2,16 millioner SMC). Kontroller at det er nok SMC til plate ønsket antall brønner.
Merk: For eksempel 1 godt bør ha 75 000 SMC og dermed 18 brønner ville ha 1.35 millioner totalt SMC. Dele 1.35 millioner cellene trengs av 180.000 celler per 1 mL og dette resulterer i 7,5 mL av cellen suspensjon som trengs for plating. Deretter beregne det siste bindet nødvendig (18 brønner x 750 µL = 13,5 mL). Dermed ta 7,5 mL av cellen suspensjon, bringe volumet opp til 13,5 mL forvarmes SMC media og bland godt.
- Antallet celler i 5 x 5 bokser (dvs. 18), multiplisere dette med 10 000 for å få antall celler i 1 mL (180.000). Deretter multiplisere med 12 mL (totalt volum av cellen suspensjon 2,16 millioner SMC). Kontroller at det er nok SMC til plate ønsket antall brønner.
- Plate 750 µL av cellen suspensjon som inneholder ca 75 000 SMC på undersiden av hvert filter, være forsiktig så du ikke søler noen av media og celle løsningen. Sett lokket på toppen og nøye overføre Petriskål med skivene i inkubator på 37 ° C over natten.
Merk: Optimal celle tettheten for andre celletyper må bestemmes empirisk. - På dag 2, fylle ren 6-og retter med 2 mL frisk, forvarmes SMC medier. Fjern platene fra inkubator. Ta setter ut én om gangen og fjerne media ved å suge, deretter plassere i 6-vel parabolen med SMC media.
- Coat motsatt side av filteret (EC siden) med 1 mL av en 0,5% bovin gelatin løsning for minst 30 min på 37 ° C.
- Trypsinize 225 cm 2 flask(s) av EU med 3 mL forvarmes 2 X Trypsin-EDTA (10 x fortynnet i sterilt Dulbecco ' s PBS) løsning, med milde tappe av flasken for å løfte cellene av tallerkenen.
Merk: Det kan være nødvendig å plassere kolbe tilbake i inkubator på 37 ° C i 1-3 min.- Når cellene har løftet av platen, legge til 9 mL EC medier å nøytralisere trypsin (3:1). Overføre til en konisk tube, bassenget sammen, bland godt og Pipetter 10 µL på en hemocytometer å finne celle nummer.
- Antallet celler i 5 x 5 bokser (dvs. 60), multiplisere dette med 10 000 for å få antall celler i 1 mL (600 000). Deretter multiplisere med 12 mL (totalt volum av cellen suspensjon 7.2 millioner EU). Kontroller at det er nok EC til plate ønsket antall brønner.
Merk: Ca 360000 EC kreves per brønn. For eksempel kreve 18 brønner 6.48 millioner EC. Del 6.48 millioner cellene trengs av 600000 EC per 1 mL og dette resulterer i 10,8 mL av cellen suspensjon som trengs for plating. Deretter beregne det siste bindet nødvendig (18 brønner x 1 mL = 18 mL). Dermed ta 10,8 mL av cellen suspensjon, få volumet 18 mL med pre varmet EC media og forsiktig resuspend.
- Antallet celler i 5 x 5 bokser (dvs. 60), multiplisere dette med 10 000 for å få antall celler i 1 mL (600 000). Deretter multiplisere med 12 mL (totalt volum av cellen suspensjon 7.2 millioner EU). Kontroller at det er nok EC til plate ønsket antall brønner.
- Når cellene har løftet av platen, legge til 9 mL EC medier å nøytralisere trypsin (3:1). Overføre til en konisk tube, bassenget sammen, bland godt og Pipetter 10 µL på en hemocytometer å finne celle nummer.
- Plate 1 mL av 360000 EC på oversiden av hvert sett inn filter. La cellene ruge uforstyrret ved 37 ° C i 24 h. Erstatt medium på dag 4. Harvest på dag 5.
2. Høsting fraksjoner av VCCC
- utføre isolasjon i et 4 ° C rom og holde alle instrumenter på ice.
- Vær oppmerksom på antall individuelle innlegg blir isolert og legge lyseringsbuffer til en 50 mL tube merket MEJ (til isolerte filtre). Så merke to 10 mm retter; for EU og én for SMC.
- Juster volumet av lyseringsbuffer avhengig av hvordan konsentrert i lysate må være; 15 setter, 500 µL av lyseringsbuffer for MEJ røret og 250 µL per Petriskål anbefales.
- Arbeidet med en 6-vel plate av innstikk samtidig. Inntaks av mediet i celle kultur panseret og deretter transport til en kald rom på ice.
Merk: Instruksjonene nedenfor er for 1 sett isolasjon. - Pipetter 10 µL av 1 x PBS ved SMC siden av sette.
- Bruk cellen lifter å skrape ned cellene til den ene enden av sette, og overfører cellene fra lifter til SMC Petriskål som har lyseringsbuffer i det.
- Når cellen lifter har rørt lyseringsbuffer i fatet, ikke la den ta sett inn filteret før det er helt tørket og tørket på papirhåndklær. Gjenta skrape SMC filter minst en til to ganger å helt fjerne gjenværende SMC celle rusk.
- Slå sett inn over og Pipetter 10 µL av 1 x PBS i øvre/EC siden av sett inn filteret. Gjenta trinn 2.6 og 2.7 med cellen skraper og EC Petriskål.
- Samler gjenværende celle- og PBS slurry fra siden EC filter med Pipetter og overføring til EC Petriskål med lyseringsbuffer. Være nøye skraping cellene på begge sider av filteret som la minimal EC/SMC forurensning i MEJ fraksjonen.
- Bruk nøye på skalpell for å kutte ut filteret fra plast innsatsen. Gjør dette ved å kutte 70-80% av det fra plast og bruk tang til å trekke filteret helt av plast sett struktur. La filteret i 50 mL konisk røret merket MEJ med lyseringsbuffer, og sikre at det sitter i lyseringsbuffer og fortsatt våt.
- Gjentar isolasjon, grupper av 6, til alle skivene er behandlet.
- Sikrer at ulike behandlingsgrupper holdes eget rør og retter.
- Vortex 50 mL MEJ koniske røret på full styrke for 15 s eller til blandet godt. Fjerne filtrene fra MEJ koniske med tang, å dra dem langs vegger av røret å la maksimale proteiner og væske i røret. Etter dette tidspunktet, kaste filtrene.
- Når alle filtrene er fjernet fra MEJ koniske røret, gjøre en rask spinn (10-15 s maks hastighet ~ 16.000 x g) i en sentrifuge å trekke alle flytende og proteiner til bunnen av røret. Overføre innholdet i MEJ røret og EC og SMC Petri retter til separate, mindre sentrifuge rør.
- Tilleggsutstyr: Sonicate innholdet i MEJ/SMC/EC rør sette 4 for tre 10 s pulser på is eller homogenize forsiktig hånd.
- Sentrifuge på maks fart (~ 16.000 x g) 15 min 4 ° C. Pipetter ut nedbryting og analysen av lysate protein innhold med metoden bicinchoninic analysen.
3. Høsting av VCCC for En Face Immunofluorescence
- på dag 5 av VCCC inkubasjon fjerne skivene fra inkubator. Arbeider i celle kultur panseret, enkel sugeevnen av SMC media fra hver av lavere sett inn filter og skyll to ganger med 1 x PBS. Gjenta med siden EC.
- Holde skivene intakt og i platen, legge til 4% paraformaldehyde (PFA) i 10-20 min i et walk-in 4 ° C rom på en mild shaker. Vask begge sett inn filteret med 1 x PBS i 5 minutter og gjenta to ganger.
FORSIKTIG: PFA er giftig og må behandles forsiktig. - Utføre de blokkerer, primære og sekundære antistoff incubations på plate, å sikre at begge sider av filteret holdes i antistoffer + blokkerer løsning (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg bovin serum albumin, 500 µL normal serum)
- Montere filteret på et lysbilde, kutt filterene av plast innsatsen med skalpell montert på et håndtak og sted på et mikroskop lysbilde med montering medium.
4. Høsting av VCCC for tverrgående Immunofluorescence
- på dag 5 av VCCC inkubasjon fjerne skivene fra inkubator. Enkel sugeevnen av media fra begge sider av sett inn filteret i celle kultur panseret og skyll hver side av filteret to ganger med 1 x PBS.
- Holder skivene intakt og på 6-vel plate, legge til 4% PFA og ruge over natten i et walk-in 4 ° C rom på en mild shaker.
FORSIKTIG: PFA er giftig og må behandles forsiktig.
5. Innebygging av VCCC tverrgående Immunofluorescence
- etter filter setter er løst rundt i 24 timer i 4% PFA, overføring til 70% EtOH minst 24 h, men opptil flere uker.
- Behandle filtrene på en lang (overnatting) kjøre på en automatisert vevsprosessor. Bruke programmet som følger: 70% EtOH for 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xylen 30 min, xylen 30 min, xylen 45 minutter, 60 ° C parafinen 30 min, 60 ° C parafinen 30 min , 60 ° C parafinen 45 min.
- Etter behandling, overføre høstet filtrene til innebygging stasjonen til flytende parafin, holde filteret i kassetten.
- Fjerne filteret fra kassetten, forsiktig med tang for å holde den bare på kanten. Med saks, halvert filteret, danner to semi-sirkulære formet halvdeler. Lay av 2 halvdelene på kjøleplaten delen av innebygging stasjonen bare lenge nok til å fylle innebygging mold med flytende parafin.
- En gang fylt med flytende parafin, veldig kort trykk innebygging mold å kjøleplaten, deretter legge inn hver halvdel av filteret i innebygging mold (kuttet side), Dette sikrer at under snitting, vil man kutte av filteret mot kanten .
- Under innebygging, bruk tang til å holde filteret å hindre halvdelene falt hverandre før parafinen er kult nok for dem å stå alene. Flytte innebygging mold til en kjøleplate før helt befestet.
Merk: Kjøling blokker på ice skuffer bidrar til å hindre rynkete delene.
6. Skjæring og flekker på VCCC for tverrgående Immunofluorescence
- For parafinblokkene snitting og skyv Montering: kutte 5 µm seksjoner, plassere inndelingene i et vannbad 42 ° C og hente delene bruke positivt ladede lysbilder. Så holde lysbilder overnatting i 42 ° C ovn til tørk.
- Før du starter rehydration foranstaltningene, bake skliene i 60 ° C til å smelte parafinen og å overholde delene VCCC i lysbildet. Cool kort, så rehydrate lysbildene gjennom to endringer av xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, en endring på 70% EtOH, og to endringer av destillert vann.
- Unngå antigen henting metoder som innebærer mikrobølgeovnen eller oppvarming som deler kan falle ut av lysbildet.
- Utføre standard blokkering 1t i romtemperatur, deretter den natten inkubering med det primære antistoffet ved 4 ° C, etterfulgt av vaske trinn og sekundære antistoff 1t ved romtemperatur. Montere med montering media og dekkglassvæske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Filteret skivene brukes for VCCC har liten, 0.4 µm hull. Figur 1A, en no ansikt visning av VCCC filteret senket, viser porene som MEJ kan danne i vitro. Skjematisk viser den glatte muskelcellene belagt på undersiden av filteret en dag før endotelceller er belagt på motsatt side (figur 1B). Når cellene er belagt, kan EF, MEJ og SMC fraksjoner være isolert tre dager senere. Et eksempel på dette er vist i figur 2A, der plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) er svært uttrykt i MEJ fraksjonen i forhold til resten av EU, som er også sett på i vivo MEJs25. Disse dataene viser nytten av VCCC i recapitulating intakt arterioler blod fartøyet veggen.
Neste er VCCC i immunofluorescence og elektronmikroskop demonstrert. VCCC er igjen intakt og fast med PFA for tverrgående immunofluorescence. Figur 3A viser glatt muskel bestemt alfa-1 adrenerge reseptoren og endothelial bestemte bradykinin reseptoren. Phalloidin farging av F-utgangen viser begrepsordbok broene i MEJ (hvit pil) mellom to celler som replikerer uttrykket i en intakt arterien26. I figur 3B, er et tverrsnitt av VCCC idet sett av overføring elektronmikroskop vist, som er gjengitt i 3D i Figur 3 c. Disse visningene av VCCC demonstrere spesielt lokalisere proteiner og reseptorer ultrastructure i vitro MEJs.
Figur 1: Plating av Vascular celle co kultur (VCCC). (A) En face lys mikroskop-bilde av porene i sett inn filteret. Svarte piler betegne individuelle hull. (B) skjematisk for plating på VCCC. Dag 1 viser inversjon filterinnlegget og plating SMC på bunnen. På dag 2, EF er belagt på motsatt side av filteret og VCCC forblir i denne konformasjon i en 6-vel plate før innhøsting. Hvite pilene angir siden av filteret hvor cellene er belagt og vil vokse. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Protein berikelse i MEJ. (A) Immuno-overføring elektronmikroskop bildet i musen arteria med uttrykk i alfa globin på MEJ (gull perler som vises som svarte prikker). (B) Western blot viser plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) uttrykket er beriket i MEJ fraksjonen versus EF- eller SMC fraksjoner. Plast EC angir EC dyrket på en plast rett, som utgjør ikke MEJ. Skala bar = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tverrgående immunofluorescence og elektronmikroskop tverrgående deler av VCCC. (A) Beising for glatt muskel og endothelial spesifikke proteiner. F-utgangen flekker er gjennom både celletyper og i vitro MEJ (hvit pil). Et eksempel på elektronmikroskop brukes til å studere ultrastructure for vitro MEJs både i 2D (B) og 3D (C). Skala bar = 10 µm (A); 2,5 µm (B); og ca 2,5 µm loddrett og 0,5 µm vannrett (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VCCC har mange fordeler i forhold til recapitulating MEJs i vitro, men det er poeng diskusjon når avgjøre hvis VCCC kan benyttes for bestemte programmet. For eksempel hvis forskjellige celletyper skal brukes med denne modellen, må det optimaliseres. Vi har brukt primære menneskelige celler, men det er mulig å isolere celler fra bovin aortas24eller wildtype eller knockout mus, og bruke dem i de VCCC1,5,14.
Hvis bruker VCCC for MEJ isolasjon, er den viktigste teknikken å mestre grundig skraping av filteret for å sikre at renheten av MEJ brøk ikke endres av overflødig endothelial eller glatt muskel celler. Vi har vist via Western blotting at alfa hemoglobin beste markøren i et "rent" MEJ isolasjon13, som det sterkt bør uttrykkes i MEJ fraksjonen versus endothelial celle brøken. En annen er PAI-1, som regulerer dannelsen av MEJ (figur 2)25. Vi føler dette kan være spesielt god markører for en robust MEJ isolasjon. For ekstra tillit i harvest teknikken, kan filtre etter skraping for innhøsting, og farget for EC/SMC markører25.
Imaging protein uttrykk i VCCC kan utføres på to hovedmåter: no ansiktet (figur 1A) eller tverrgående (Figur 3). Begge forberedelser tillate visualisering av proteiner i hullene av filteret fra to forskjellige perspektiver. No ansikt teknikken innebærer arteriene som klippes langs og deretter låst ut flatt, med EF vendt opp, for å visualisere både EF-monolayer og hullene i IEL, det eneste stedet hvor MEJ kan danne. Et fluorescerende signal i hullene av IEL angir lokalisering av proteinet i MEJ10,27. Den samme prinsippet kan oversettes til VCCC av imaging EC monolayer ovenfra, uten å måtte bygges inn i parafin eller gjøre deler. Tverrgående metoden er mer komplisert å mestre, men er avgjørende for tydelig visualisering av proteiner i EU versus SMC monolayers (Figur 3).
Mangel på strøm eller strekke i systemet er en potensiell begrensning, men det er mulig å legge flyt i en endothelial-glatt muskel celle co kultur16,19. Vises som statiske forholdene fortsatt tillate fysiologisk nøyaktig protein uttrykk og aktivisering, så det kan være at heterocellular kontakten er den viktigste faktoren i Disseksjon av MEJ signalnettverk trasé.
Det finnes flere programmer av denne teknikken utover motstand arterien signalering som VCCC ikke er nødvendigvis begrenset til spesifikke celletyper. Andre co kultur modeller har benyttet utvekst endotelceller og osteoblasts17, eller modellert blod-hjernebarrieren med endotelial og pericyte/astrocytter co kulturer21. Metastasering av kreftceller gjennom endotelet kan også kvantifiseres bruker denne modellen21. Det er også mulig å vokse celler i filteret og kultur en annen celle skrive i bunnen av 6-vel parabolen teste paracrine signalering, eller vokse endotelceller på den øvre delen av membranen å betrakte polarisering av cellen (våre upubliserte observasjoner). Leukocytter eller andre sirkulerende celler kan legges til EC media og vedheft av celler kan være kvantifisert12. I tillegg kan til VCCC brukes til å undersøke patologi som glatt muskel migrasjon24 og spredning svar på endothelial skade15,18.
I konklusjonen, har vi presentert en metode for å isolere MEJ fra en i vitro celle kultur-systemet, som tillater etterforskningen signalnettverk prosesser mellom to sammenkoblede celletyper. Viktigere, co kultur-systemet er ikke begrenset til studiet av MEJ og kan være verdifullt å svare mange spørsmål, særlig de som involverer heterocellular kommunikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National hjerte, gir lunge og blod Institutt R01088554, T32HL007284 og American Heart Association predoctoral fellesskap 14PRE20420024. Vi takke spesielt St. Jude Cellular Imaging delt forskning kjernen, inkludert Randall Wakefield og Linda Horner for elektronmikroskop bilder, Adam Straub for hjelp med representant immunofluorescence bilder og Pooneh Bagher for henne verdifulle tilbakemeldinger på manuskriptet protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
