Summary
Målet med denne protokollen er å isolere endoteliale progenitor celler fra navlestrengsblod. Noen av programmene inkluderer bruk av disse cellene som en biomarkør for å identifisere pasienter med kardiovaskulær risiko, behandle iskemiske sykdommer, og skape vev-konstruert vaskulær og hjerte ventil konstruksjoner.
Abstract
Eksistensen av endoteliale progenitor celler (EPCs) i perifert blod og dens engasjement i vasculogenesis ble først rapportert av Ashara og kolleger1. Senere dokumentert andre eksistensen av lignende typer EPCs fra benmargen2,3. Flere nylig, Yoder og Ingram viste at EPCs avledet fra navlestrengsblod hadde et høyere proliferativ potensial sammenlignet med de isolert fra voksen perifert blod4,5,6. Bortsett fra å være involvert i postnatal vasculogenesis, har EPCs også vist lovende som en celle for å lage vev-konstruert vaskulær og hjerte ventil konstruksjoner7,8. Ulike isolasjon protokoller finnes, innebære noen som cellen sorteringen av mononukleære celler (MNCs) fra kilder som er nevnt tidligere ved hjelp av endothelial og blodkreft markører eller dyrking disse MNCs med spesialiserte endothelial vekst medium, eller en kombinasjon av disse teknikker9. Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og kultur EPCs bruker spesialiserte endothelial medium med vekstfaktorer, uten bruk av immunosorting, etterfulgt av karakterisering av isolerte cellene med vestlige blotting og immunostaining.
Introduction
Flere etterforskere har studert egenskaper og potensialet i menneskelig EPCs5,10,11,12,13. EPCs kan beskrives som sirkulerende celler som har evnen til å overholde endothelial vev i områder av hypoksi, iskemi, skade eller tumor formasjon og bidra til dannelse av nye vaskulære strukturer4,14. De observerte er involvert i neovascularization, i form av postnatal vasculogenesis, har ført til en forståelse av i Patofysiologien ved disse cellene og deres bruk i terapeutiske programmer4,15, 16. antall EPCs i et individ har vist seg å være korrelert med hjerte patologi9,15,16,17,18,19 ,20. Andre studier har også differensiert EPCs i en ventil fibroblast-lignende fenotypen og foreslått at disse cellene kan brukes for tissue engineering hjertet ventiler7,21.
Bestemt celle overflaten molekyler for å isolere EPCs har ikke blitt klart identifisert på grunn av avvik mellom undersøkelser4. Vedheft av MNCs til en bestemt matrise, med eksponering til en rekke kultur forhold, er utført av flere grupper1,17,22,23, antyder at antatte EPCs kan vise ulike fenotypiske egenskaper. Disse egenskapene inkluderer manglende phagocytotic evne, rør formasjon i Matrigel og opptaket av Dil-acetylated low-density lipoproteiner. Den høye clonogenic og proliferativ potensialet er to egenskaper som EPCs kan være hierarchized5. EPCs kan også danne i vitro tubuli når cocultured med menneskelige fosterets lunge fibroblaster4. Disse cellene kalles å uttrykke endothelial celle overflate markører og å dele noen av blodkreft markører13,24,25. Positivt uttrykt markører som er allment akseptert for phenotyping EPCs er CD31, CD34, vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR2), von Willebrand faktor (vWF), CD133, c-Kit og vaskulær endotelial cadherin (VE-cadherin)4 , 18. celler som uttrykker co CD90, CD45, CD14, CD115 eller alpha-glatt muskel utgangen (α-SMA) anses ikke å være EPCs på grunn av deres begrensede proliferativ potensial, evne å phagocytose bakterier og manglende evne til å danne de novo menneskelige fartøy i vivo4,7. Denne artikkelen beskriver en endret protokoll for isolering av endoteliale progenitor celler fra menneskelige navlestrengsblod uten behov for en celle sortering protokoller. For denne artikkelen har brukte vi CD31, CD34 og VEGFR2 som positive markører, med α-SMA som negative indikator.
I denne artikkelen foreslår vi en metode for å isolere og dyrking endoteliale progenitor celler fra navlestrengsblod uten celle sortere ved hjelp av spesialiserte endothelial oppblomstringen medium med vekst faktorer (EGF). Denne EGM inneholder vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF), som forbedrer den overlevelse, spredning og migrering av endotelceller26. Det inkluderer også askorbinsyre, som er ansvarlig for å opprettholde brosteinsbelagte morfologi av celler. insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1), som gir angiogenic og vandrende funksjon; og heparin, som fører til bedre langsiktig stabilitet av vekstfaktorer i middels26. Andre vekstfaktorer lagt til endothelial celle kultur medium inkluderer tilskudd med epidermal vekstfaktor (EGF), som hjelper i stimulere celle spredning og differensiering hydrocortisone, som sensitizes cellene til EGF26 . Vi viser at bruk av denne bestemte vekstmediet gir høyere antall EPCs sammenlignet endothelial basale medium (EBM) eller Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne forskningen ble utført med godkjenning av University of Arkansas institusjonelle Review Board (godkjenningsnummer 16-04-722). Navlestreng blod enheter ble samlet i citrate fosfat druesukker (CPD) løsning på Arkansas Cord Blood Bank, og enheter som ikke oppfyller kravet for lagring ble donert til forskning. Ledningen blod enheter ble sendt med Ilbud til lab innen 24 timer av samlingen ved omgivelsestemperatur.
1. isolering av endoteliale Progenitor celler fra ledningen blod
- forberedelse av reagenser.
- Forberede EGM ved å legge til endotelial basale medium (EBM) 10% fosterets bovin serum (FBS) supplert med 20 ng/mL insulin-lignende vekstfaktor (IGF), 1 µg/mL askorbinsyre, 5 ng/mL rekombinant menneskelige epidermal vekstfaktor (rhEGF), 22,5 µg/mL heparin og 0,5 ng/mL vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), 10 ng/mL av rekombinant menneskelige Fibroblast vekst faktor B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortisone og 2% penicillin-streptomycin-glutamin. Sterilisere kultur medium med 0,2 µm polyethersulfone (PES) membran vakuum filtere.
- Forberede rotte hale jeg kollagen løsning i en konsentrasjon av 50 µg/mL bruker 0.02 N eddiksyre. Sterilisere denne løsningen bruker filtere 0,2 µm sprøyten.
- Før pels 6-vel plater med 2 mL forberedt rotte hale jeg kollagen løsning for hver brønn. Plasser dem i en inkubator opprettholdt på 5% CO 2 og 37 ° C i minst 1 time før såing.
- Fortynne ca 25 mL av ledningen blod med Hanks balansert Salt løsning (HBSS) i en 1:1 konsentrasjon.
- Forberede radio-immuno nedbør analysen (RIPA) Buffer 150 mM natriumklorid, 1% Triton X-100, 0,5% natrium deoxycholate, 1 mM β-glycerophosphate, 0,1% SDS og 50 mM Tris (pH 8.0).
- Isolasjon av endoteliale progenitor celler.
- Varm alle forberedt reagenser i et vannbad opprettholdt på 37 ° C før isolasjon.
- Legge til 20 mL tetthet gradert middels reagens slik 50 mL sentrifuge.
- Nøye laget 20 mL utvannet navlestrengsblod i sentrifuge røret som inneholder tetthet gradert medium uten å bryte dette laget gjennom pipette mot sideveggene røret.
- Skille komponentene i blod basert på deres tettheter ( figur 1) ved sentrifugering 800 x g i 30 min ved romtemperatur, med bremser av sentrifuger rotoren av. Ikke forstyrr de forskjellige lagene.
- Fjerne plasma laget ved nøye pipettering det ut av slangen uten å forstyrre andre cellen lag til pipette spissen er kjøpedyktig rekkevidde NCE lag (se figur 1). Forkaste fjernet plasma.
Merk: Når du bruker pipette-spisser fjerne plasma, la et lite lag av plasma over MNC laget ( figur 1) redusere forstyrrelser. - Samle buffy pelsen som inneholder MNCs bruker en sprøyte som er montert på en 18-gauge nål og overføre den til en frisk sentrifuge tube.
- Legge til en lik mengde EBM samlet MNCs. sentrifuge disse rørene på 500 x g i 10 min 4 ° C. Forkast nedbryting.
Merk: Cellen pellet vil bli rød på grunn av røde blodlegemer/erytrocytter. - Legge til 5 mL salmiakk løsningen å lyse røde blodlegemer. Inkuber dette røret på is 5-10 min, med sporadiske risting.
Merk: Forsiktighet bør tas i dette trinnet ikke overstiger hele tiden, så det kan være skadelig for MNCs. - Sentrifuge rørene på 500 x g i 10 min på 4 ° C og kast nedbryting. Hvis erytrocytter vedvarer, Gjenta trinn 1.2.8 og 1.2.9 til ingen rød farge er observert i pellet.
- Resuspend pellet i forberedt EGM og bruke hemocytometer til å telle MNCs.
- Leveringstanken rotte hale jeg kollagen-belagt 6-vel plate (fra trinn 1.1.3) og vaske brønnene tre ganger med 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Frø MNC pellet resuspended i EGM av kollagen platen i en konsentrasjon av 1 x 10 7 MNCs i hver brønn. Plasser den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Etter 24 h, Sug opp mediet og vask brønnene gang med EGM. Tilsett 3 mL EGM medium hver brønn og sett den tilbake i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
- Fylle tallerkenen med fersk EGM medium hver dag for 7 dager. Etter 7 dager, endre EGM mediet annenhver dag.
- Bruker en lys-feltet mikroskop, ta bilder av 6-vel plate hver dag spore fremdriften av endothelial celle kolonier. Markere platen hvor koloniene oppstår å holde oversikt over deres vekst.
Merk: Det tar vanligvis mellom 5 og 9 dager for koloniene i kultur.
- Utvidelse av endoteliale progenitor celler.
- Coat T-25 kultur flasken rotte hale jeg kollagen (50 µg/mL) og plassere den i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i minst 60 min. leveringstanken og vask T-25 celle kultur kolbe tre ganger med 1 x PBS før såing cellene.
- Trypsinize endothelial celle koloniene når de nå ca 3 mm i størrelse med 150 µL 0,05% Trypsin-EDTA løsning i hver brønn. Plasser 6-vel platen tilbake i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for 2-3 min.
- Trykk forsiktig 6-vel platen for å fjerne de tilknyttede cellene. Straks legge til 2 mL EGM og gjenopprette cellene i en 15 mL sentrifuge tube.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og beregne innledende seeding tettheten.
- Snurr 15 mL sentrifuge rør på 400 x g for 5 min. Resuspend celle pellet i EGM og frø T-25 flasken ~ 500.000 celler. Merke denne kolbe som passering 1 og plassere T-25 kolbe tilbake i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
Merk: Celler kan være belagt i EBM og DMEM sammenligne vekst med EGM. - For ytterligere passasjer, når flasken når 90% samløpet, fremgangsmåten 1.3.1 - 1.3.5 og reseed celler på 10 4 celler/cm 2 på T-75 eller T-175 celle kultur flasker. Videre til karakterisering av isolerte cellene (trinn 2 og 3).
2. Karakteristikk av isolerte celler ved hjelp av Western Blotting
- Legg til 50-100 µL av lysis buffer på hver passage når fremgangsmåten utvidelse å karakterisere isolert cellene. Samle proteiner fra ca 500.000 eller flere celler.
- Pipetter opp og ned kraftig ruptur cellene og slipp proteiner. Samle og overføre bufferen slik microcentrifuge.
- Spinn microcentrifuge røret på 500 x g og overføre nøye nedbryting til en ny microcentrifuge tube. Merke og lagre rør ved-80 ° C for langtidslagring.
- Kvantifisere mengden av proteiner i hver retning bruker enten Bradford ' s eller BCA analysen 27 , 28 , 29.
- Utføre Western blotting bruker standard prosedyrer 27 , 28 , 29. Analysere 5 µg totale protein for uttrykk for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Bruke α-tubulin for normalisere dataene.
3. Indirekte Immunofluorescence
- Sonicate 18 mm glass coverslips i 50% etanol og tørkes. La den rene coverslips i en 12-vel plate overnatter i biosikkerhet panseret med en UV lys på å sperre.
- Coat coverslips med 50 & #181; g/mL av rotte hale jeg kollagen og overføre platen til en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i minst 60 min.
- Sug opp kollagen og tilsett 1 mL 1 x PBS til 12-vel plate å vaske coverslips. Sug opp 1 x PBS og gjenta to ganger.
- Frø 250.000 kultivert EPCs i hver brønn og setter dem tilbake i 37 ° C, 5% CO 2 inkubator for minst 3 dager før du utfører immunostaining.
- Vask platen 3 ganger med 1 x PBS. Tilsett 1 mL av iskalde metanol hver brønn og Inkuber ved romtemperatur i 15 min å fikse cellene.
- Utføre immunostaining ved hjelp av en standardprotokoll 27 , 28 , 29. Bruke antistoffer på deres aktuelle fortynninger (f.eks CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) og VEGFR2 (1:50)).
- Tar bilder av immunostained coverslips med en epifluorescence mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolasjon og utvidelse av endoteliale Progenitor celler:
En skjematisk (figur 1) gis som viser den generelle protokollen. Forskjellige blod komponent lagene ble observert etter tetthet gradert sentrifugering menneskelige navlestreng blod med tetthet gradert medium. På seeding MNCs på kollagen-behandlet plater, ble resultatet av kolonier først observert mellom dager 5 og 7 (figur 2A). Disse kolonier fortsatte å vokse, og hadde en spindel-formet cellen morfologi (figur 2A-2D) i de tidlige stadiene, som senere utviklet seg til en brosteinsbelagt-lignende morfologi (figur 2E-2F). Figur 3 En viser totalt antall celler versus tid i kultur, og hvert datapunkt representerer Kumulativt antall celler høstes ved hver passering. Figur 3 B viser Gjennomsnittstid for første kolonien å oppstå i kollagen-behandlet 6-vel platen etter seeding MNCs.
Karakterisering ved hjelp vestlige Blotting:
Figur 4 En viser representant resultatene av vestlige blot membran som ble testet mot ulike antistoffer. Våre resultater tyder på at cellene var positivt for CD31 og CD34. Uttrykk for CD31 (Figur 4B) og CD34 (Figur 4C) syntes å avta over påfølgende passasjer, mens VEGFR2 (Figur 4D) ble uttrykt like i senere passasjer, med først passasje høyere uttrykket having. Vi har også observert at EPCs ikke uttrykker mesenchymal celle markør α-SMA (Figur 4E). Menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC) og Valvulær interstitielle cellene (VIC) cellen lysates ble brukt som positive og negative kontroller, henholdsvis. HUVECs er kjent for å uttrykke CD31, CD34 og VEGFR2, mens VICs express α-SMA.
Figur 1 : Skjematisk EPC isolasjon. Start isolasjon av utvannende ledningen blod med HBSS og legge den nøye på tetthet gradert medium, som vist. Tetthet gradert sentrifugering lagdelt blod utføres for å få forskjellige sjiktene av blod, som består av MNCs (buffy pels), tetthet gradert medium, granulocytter og RBCs. Delsett bildet gitt viser disse ulike lag. MNCs er samlet og reseeded på en kollagen-behandlet celle kultur plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Progresjon av cellen kolonien. (A-E) Representant lyse-feltet bilder av EPC kolonien progresjon over tid. Merk at kolonien har spindel-formet celler på et tidlig stadium, vedta brosteinsbelagte morfologi. (E) representativt bilde av EPC kultivert i en T-75 bolle på passering 3. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vekst kurver av EPCs. (A) grafen viser antall celler vokse over en periode, og hver av datapunktet angir cellen nummer høstet under hver passering (P0 - P10) (n = 4). (B) tid tatt for første EPC kolonien i 6-vel platen (n = 4). Feilfeltene betegne standard feil av gjsnitt (SEM). Ingen statistisk signifikans ble funnet med veis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Vestlige Blotting. (A) Western blot membran med ulike antistoffer. HUVEC lysate og VIC lysate ble brukt som positive kontroller. (B) gjennomsnittlig intensiteten av CD31 band normalisert med α-tubulin. (C) gjennomsnittlig intensiteten av CD34 band normalisert med α-tubulin. (D) gjennomsnittlig intensiteten av VEGFR2 band normalisert med α-tubulin. (E) gjennomsnittlig intensitet α-SMA band normalisert med α-tubulin (n = 3-6). Feilfeltene betegne SEM. Ingen statistisk signifikans ble funnet med veis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Immunostaining. Representant bilder av EPCs kultivert i EGM i 7 dager og immunostained på ulike passasjer for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skala bar - 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: Grafen viser antall celler per enhet over en periode på 7 dager når kultivert EGM, EBM og DMEM. EGM viste høyere cellevekst sammenlignet med media (EBM og DMEM). Dataene viser statistisk betydning, med p < 0.01, med enveis ANOVA (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/ > Supplerende figur 2: representant bilder av EPCs kultivert i EBM i 7 dager og immunostained for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 3: Representant bilder av EPCs kultivert i DMEM i 7 dager og immunostained for CD31, CD34, VEGFR2 og α-SMA. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nevnt tidligere, tilhenger EPCs har en brosteinsbelagt morfologi. Vår isolerte MNCs kommet fra en spindel-formet celle koloni (figur 2A-2D) i de tidlige stadiene til en brosteinsbelagt koloni (figur 2E-2F) over en periode på ti dager i kultur. EPCs har blitt merket annerledes av forskjellige forskningsgrupper, nemlig som sent endoteliale progenitor celler10, endothelial kolonien danner celler5eller endoteliale progenitor celler12. Det bør bemerkes at disse cellene er funksjonelt samme og uttrykke lignende celle overflate markører. Antall celler observert i kultur perioden (Figur 3) økt til nesten 108 celler, slik som tidligere publikasjoner og typisk for høy proliferativ potensialet EPCs3,5. Faktisk ble det funnet at EPCs innhentet fra menneskelige navlestrengsblod viste en høy proliferativ potensielle og vist flere befolkningen doublings før under senescence forhold til EPCs isolert fra adult periferisk menneskeblod5 , 10.
Våre vestlige blotting resultater (Figur 4A) viste tilstedeværelse av CD31, CD34 og VEGFR2 på cellen lysates fra EPCs sammenlignet med positiv kontrollen, HUVEC. HUVECs express CD31, CD34 og VEGFR2 og aktivert VIC express α-sSMA. I likhet med tidligere rapporter10,18, uttrykk for CD31 redusert med høyere passasjer. Uttrykket mønsteret ble også tilsvarende CD34 og VEGFR2, der merkene ble uttrykt sterkt i første passering og relativt lavere men like beløp i senere passeringer. Dette viser en trend som er i samsvar med tidligere grupper resultater, der immunosorting protokoller ble brukt for å isolere ledningen blod-avledet EPCs12. Vanligvis EPCs ikke uttrykke mesenchymal markører og kontrollere at isolert cellene ikke var mesenchymal i naturen, vi immunolabeled vår Western blot membraner med α-SMA. Våre resultater viser tydelig at det var ingen α-SMA uttrykk i kulturperler EPCs sammenlignet med positiv kontroll celle lysates fra VICs, som viser sterk uttrykk α-SMA antistoff.
For å demonstrere at EGM tillater økt celle spredning i forhold til andre kultur medier brukes for EPCs, vi kulturperler cellene i tre ulike typer medier: DMEM, EBM og EGM (dvs. EBM supplert med vekstfaktorer, som beskrevet tidligere). Alle ble supplert med 10% FBS. Vi seeded cellene i ulike passasjer i hver brønn av en 12-vel plate. Supplerende figur 1 viser antall celler per enhet i hver brønn over tid i kulturen i ulike medier formuleringer. Vi registrerer at EPCs kulturperler på EGF viste en jevn økning i celle nummer, og celler i EBM, det var en tregere veksten i celle nummer under de tre første dagene, som senere platå. Dette tyder på at EPCs kan likevel overleve i EBM, men fraværet av vekstfaktorer hindret spredning. Vi også oppmerksom på at EPCs kultivert DMEM nedgang i antall, noe som tyder på at denne bestemte middels formuleringen ikke er egnet for overlevelse eller spredning. Våre immunostai-data viser at EPCs kulturperler på EGF (figur 5) uttrykt CD31 mer sammenlignet med EPCs kultivert EBM (supplerende figur 2) og DMEM (ekstra figur 3). Sammenligne figur 5 med supplerende figur 2 og supplerende figur 3, kan det sees at cellene ikke var forurenset med andre celletyper. Også, når du sammenligner immunostained EPCs (figur 5), kan kvalitativt tilstand at uttrykk for CD31 og CD34 redusert med høyere passasjer, støtter våre Western blot data (Figur 4).
For å gjenta, er hovedmålet til våre foreslåtte protokollen å vise at en kan isolere endoteliale progenitor celler av dyrking blod MNCs i spesialiserte selektiv medier. Dette er å vise at EPCs kan isoleres uten avansert utstyr og prosedyrer, i motsetning til andre metoder som innebærer bruk av flowcytometri - enten umiddelbart etter MNC isolasjon1,3,20 , 30 eller etter koloniene har vokst til en monolayer - etterfulgt av replating4,10,12,13,23. EPC koloniene vises vanligvis mellom dager 5 og 9. Vår metode er dermed en raskere og mer kostnadseffektiv metode for å isolere EPCs. Den største begrensningen av denne teknikken er at uttrykk for CD31 og CD34 reduseres med påfølgende skriftsteder som kan foreslå at cellene mister sin stamfar fenotypen. Det anbefales derfor at man bør bruke celler fra passasje 5 eller lavere for å utføre eksperimenter hvis bruker denne protokollen.
Forholdsregler bør tas etter tetthet sentrifugering ikke forstyrre de forskjellige lag når du tar centrifuged rør tilbake i panseret og også når du fjerner plasma. En annen viktig trinn gjelder røde blodlegemer lysis, der lenger inkubasjon tid potensielt kan skade NCE. Det anbefales derfor ikke å gjenta dette trinnet mer enn to ganger. Faktisk siden middels aspirasjon er gjennomført 24 timer etter plating, er sporstoffer mengder erytrocytter fjernet, de er ikke-tilhenger. Alternative underlag, som fibronectin eller gelatin, kan mens ikke testet av oss, også brukes i henhold til bestemte protokoller for å lage celle kultur belegg. Ved å bruke mindre endring i de første trinnene, kan forskere isolere ikke-tilhenger EPCs30.
I konklusjonen, har vi rapportert en metode for å isolere EPCs fra navlestrengsblod. Det er viktig å merke seg at EPCs ikke uttrykke markører som α-SMA, antyder at de ikke er mesenchymal-lignende celler. Faktisk fungerer α-SMA som en viktig indikator når prøver å studere endothelial-mesenchymal overgangen (endo-MT) av EPCs. Endo-MT er en mobil transdifferentiation prosess som kalles endotelceller å tape sine spesifikke markører og å transformere til en mesenchymal som cellen fenotypen. Det har vist at EPCs kan gjennomgå denne overgangen i nærvær av omforming vekst faktor-β7 og kan frigi ekstracellulære membran proteiner på deres vev-konstruert stillaser8. Alle disse observasjonene viser løfte om EPCs for bruk som en autologous cellen til å lage en hjerteklaffen eller andre hjerte vev-konstruert konstruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under Grant nr. CMMI-1452943 og ved University of Arkansas utmerkelser College. Vi ønsker også å erkjenne Arkansas Cord Blood Bank for å gi oss med ledningen blod enheter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C.
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
