Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.
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Methodenartikel
Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verwendung von Kalzium Indikatoren wurde unser Verständnis der neuronalen Dynamik und Regulierung erheblich verbessert. Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, mit seiner völlig zugeordneten Nervensystem und transparente Anatomie, stellt ein ideales Modell für Echtzeit-neural Dynamics mit Kalzium Indikatoren zu verstehen. In Kombination mit mikrofluidischen Technologien und experimentellen Designs sind Kalzium-Bildgebungsstudien mit Hilfe dieser Indikatoren in frei bewegliche und eingeschlossene Tiere durchgeführt. Allerdings haben die meisten frühere Studien unter Verwendung Trapping-Geräte, wie den olfaktorischen Chip beschrieben in Chronis Et Al., Geräte für den Einsatz in der häufiger Zwitter, wie das seltenere Männchen sowohl morphologisch und strukturell ist unähnlich. Ein angepasster olfaktorischer Chip wurde konstruiert und gefertigt für mehr Effizienz in der männlichen neuronale Bildgebung mit jungen Erwachsenen Tieren. Eine Wende wurde der Wurm Verladehafen, die Tiere zu drehen und ermöglicht die Trennung der einzelnen Neuronen innerhalb eines bilateralen Paares in 2D Bildgebung eingegliedert. Würmer sind ein kontrollierter Informationsfluss Geruchsstoff innerhalb des Gerätes mikrofluidischen ausgesetzt wie in den vorhergehenden Zwitter Studien beschrieben. Kalzium-Transienten sind dann mit der Open-Source-Software ImageJ analysiert. Die hier beschriebene Verfahren ermöglichen eine erhöhte Menge an männlich-basierte C. Elegans Kalzium Bildgebungsstudien vertiefen unser Verständnis der Mechanismen der Geschlecht-spezifische neuronale Signale.
Einleitung
Mikrofluidischen Geräte bieten verstärkten Zugang zu genau kontrollierten Umgebungen, wobei Tiere, wie z. B. der Fadenwurm C. Elegans, kann experimentell manipulierte1sein. Diese Studien umfassen Verhaltens Assays, Kalzium bildgebenden oder sogar Vorführungen für bestimmte Phänotypen, wodurch genauere Messungen von experimentellen Ergebnissen1,2,3,4, 5,6. Mikrofluidik bieten kleinen flüssigen Bedingungen durch die ausführliche Experimente ....
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Protokoll
1. Gerät Herstellung
Hinweis: siehe Hinweis 1.
Hinweis: master Silikonformen wurden hergestellt mit photolithographische Standardtechniken für Musterung SU-8 Photoresist auf einem Silizium-master 1 ,- 7. Fotomasken für Wafer Musterung wurden bei 25.000 dpi gedruckt. Männlich-angepasst Gerätefunktionen Chronis olfaktorische Chip design 19 mit einer Änderung in der Wurm Verladehafen, Anpassung eine Design von M. Zimmer (persönliche Korrespondenz, 2016) erhalten. Eine Wende ist enthalten, um die Rotation de....
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Ergebnisse
Ein Beispiel für den Gesamtaufbau Gerät sehen in Abbildung 1A-B. Abbildung 1A zeigt den richtigen Behälter Bau und Einrichtung. Abbildung 1 b zeigt die Verbindungen der Stauseen am mikrofluidischen Gerät. Abbildung 1 zeigt ein mikrofluidischen Gerät mit einzelnen Ports für Klarheit beschriftet.
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Diskussion
Die männlichen angepasst olfaktorische Chip integriert eine Wendung in ein schmaler Verladehafen, wodurch für mehr Kontrolle über die Ausrichtung und das effiziente Abfangen von männlichen C. Elegans. Dies ermöglicht die Visualisierung der linken und rechten Mitglieder des neuronalen bilaterale Paare, ohne die Notwendigkeit für Z-Stapeln. Diese Kurve führt zu eine Orientierung Weg von vertikalen 100 % der Zeit in Worms, wo richtet sich nur eine bilaterale paar mit einem fluoreszierenden Marker, z. B. Asche (
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten danken Manuel Zimmer für die Bereitstellung von uns mit der ersten Entwurf-Datei, die für Gebrauch mit Männchen angepasst wurde; Frank Schroeder für die Synthese und die Lieferung von Ascr #3; Ross Lagoy für die Einsicht und Unterstützung bei der Bildverarbeitung und Analyse; und Laura Aurilio für die Meister Fertigung und, neben Christopher Chute, dazu beigetragen, den Beitrag dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde unter der National Institutes of Health Grant 1R01DC016058-01 (j.s.), die National Science Foundation Stipendium CBET 1605679 (D.R.A) und die Burroughs Wellcome Career Award an wissenschaftlichen Schnittstelle (D.R.A) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Silizium Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Entwickler | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Sonderanfertigung. Gedruckt mit 25.000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Stanzen | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hardtubing | IDEX Gesundheit & Gesundheit Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0,415/0,425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL Spritzen | BD | 309657 | |
| 30 mL Spritzen | Vitality Medical | 302832 | Wird als Pufferreservoir verwendet. |
| Edelstahl Blunt Needle 23 Gauge, Polypropylen Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Absperrhähne mit Luer-Anschlüssen; 3-Wege; männliche Verriegelung; 5 Strömungsmuster; unsteril | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Deckglas | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Steuerungssystem LF-5 Plasmasystem | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vakuum-Exsikkator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm Innendurchmesser. |
| Wägeschiffchen | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glaspasteur-Pipetten | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transferpipetten | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Modellnummer: 1500E. |
| 60 mm, nicht belüftet, scharfkantige Petrischalen | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss-Hammamatsu | ||
| Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blau Leuchtstofflampe | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Beleuchtungsadapter | Zeiss | 423302-0000 | |
| Serie 1 und 2 Miniatur-Inert-PTFE-Absperrventil | Parker | 001-0017-900 | 3-Wege-Ventil zur Durchflussregelung. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Strömungswächter |
| Controller Micro Manager | Micro-Manager-Kostenlose | Software, kann heruntergeladen werden unter: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release | |
| ImageJ | ImageJ-Free | Software, kann heruntergeladen werden unter: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Agar, bakteriologische Qualität | Apex | 9012-36-6 | |
| Pepton | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterin | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisol | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Bei 4 °C lagern. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | lichtempfindlich. In Lichtschutzfläschchen aufbewahren. |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascarosid #3 | - | synthetisiert im Schroeder Lab (Cornell University). | |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3-Leitung | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Entwickelt im Labor von Bargmann. Zur Verfügung gestellt aus der Albrecht Lab-Bibliothek. |
| CEM GCaMP6-Linie | - | -JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Entwickelt von Robyn Lints. Bereitgestellt aus der Srinivasan Lab-Bibliothek. | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | Um ein Reservoir zu erstellen: Eine "30-ml-Spritze" wird mit einem "Absperrhahn mit Luer-Anschlüssen; 3-Wege; männliche Sperre; 5-Flussmuster; unsteril" verbunden, der mit einer "3-ml-Spritze" und einer "stumpfen Edelstahlnadel 23 Gauge" verbunden ist, Polypropylen Luer". Die "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" wird dann etwa 1/3 des Weges nach unten in den "Soft Tubing" eingeführt. |
Referenzen
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
