Summary
تشكل الخلايا الكيراتينية البشرة حاجز الجلد وظيفية ويتم وضعها في الخط الأمامي للدفاع المضيف ضد الشتائم البيئية الخارجية. هنا نحن تصف أساليب العزلة والثقافة الأولية من الخلايا الكيراتينية البشرة من حديثي الولادة والجلد الماوس الكبار، وتحريض من التمايز الطرفية والاستجابة الالتهابية أوفب أثارت من الخلايا الكيراتينية.
Abstract
الكيراتين (كك) هو نوع الخلية السائدة في البشرة، الطبقة الخارجية من الجلد. البشرة تلعب كك دورا حاسما في توفير دفاع الجلد عن طريق تشكيل حاجز الجلد سليمة ضد الإهانات البيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية التشعيع أو مسببات الأمراض، وأيضا عن طريق الشروع في استجابة التهابية على تلك الشتائم. هنا نحن تصف طرق لعزل ككس من جلد الماوس حديثي الولادة ومن الكبار الجلد ذيل الماوس. نحن أيضا وصف ظروف زراعة باستخدام مكملات النمو المحددة (دغس) بالمقارنة مع مصل الدم البقري الجنيني (كفبس). وظيفيا، وتبين لنا أن كل من كونات حديثي الولادة والكبار تستجيب للغاية إلى ارتفاع التوليف محطة الناجم عن الكالسيوم، وتشكيل تقاطع ضيق وطبقية. بالإضافة إلى ذلك، ككس الكبار مثقف عرضة للإصابة بالخلايا التي تسببها أوفب ويمكن أن يطلق كميات كبيرة من تنف على الأشعة فوق البنفسجية الأشعة فوق البنفسجية. معا، فإن الطرق الموصوفة هنا تكون مفيدة للباحثين عن إعداد نموذج في المختبرق لدراسة البيولوجيا البشرة في الماوس حديثي الولادة و / أو الماوس الكبار.
Introduction
الجلد هو أكبر جهاز في الجسم مع البشرة كما الخارجي معظم طبقة. البشرة تلعب دورا حاسما في تشكيل حاجز البشرة سليمة لفصل الجسم من البيئة، وبالتالي يمنع فقدان المياه ويوفر الحماية من الإهانات البيئية، مثل مسببات الحساسية، مسببات الأمراض والتعرض أوفب. البشرة تتطور من طبقة واحدة من الخلايا الكيراتينية القاعدية غير المتمايزة (ككس) في ظهارة طبقية متعددة الطبقات تتكون من طبقة القاعدية، تليها طبقة سبينوس، طبقة الحبيبية، وطبقة القرنية. بسال ككس، تتكون من كل من الخلايا الجذعية للبشرة وخلايا تضخيم العبور، هي التكاثري وغير متمايزة. كما كك القاعدية الخروج من دورة الخلية، وتلتزم الخلايا إلى التمايز وتهاجر تدريجيا نحو سطح البشرة، يرافقه نضوج تقاطعات الخلايا الخلوية وتشكيل حاجز نفاذية البشرة (إب). و ككس في الطبقة الشائكة التعبير عن الاختلافات في وقت مبكرعلامات أيون مثل الكيراتين 10 (K10). كما تهاجر ككس إلى الطبقة الحبيبية، والخلايا تعبر عن علامات التمايز المتأخر مثل فيلاغرين (فلغ)، لوريكرين (لور) و إنفولوكرين (إنف). في الطبقة القرنية، و كك تصبح متباينة كورنيوسيتس متباينة، والتي تسقط في نهاية المطاف من خلال التقشر كما خلايا جديدة محلها.
ويعتبر الكالسيوم العامل الأكثر فسيولوجية في البشرة ويؤدي التمايز في المختبر وفي الجسم الحي بطريقة مماثلة. في البشرة العادية البشرة، أيونات الكالسيوم تشكل مميزة "تركيز التدرج"، وزيادة في التركيز نحو سطح الجلد 1 ، 2 ، 3 . ويرتفع تركيز الكالسيوم من المستويات المنخفضة في الطبقات الفرعية الدنيا (الطبقات القاعدية والسبينوس) إلى ذروة الطبقة الحبيبية العليا ثم ينخفض إلى مستويات لا تذكر في الطبقة السطحية الأكثر (الطبقة القرنية). يتطور التدرج الكالسيوم أيضا من قبيل الصدفة مع ظهور حاجز نفاذية المكون، والذي يدعم أن إشارات الكالسيوم تلعب دورا حاسما في التمايز كك. في المختبر ، والكالسيوم منخفض (0.02-0.1 ملم) يحافظ على انتشار كك القاعدية كما أحادي الطبقة، في حين أن ارتفاع الكالسيوم (> 0.1 ملم) يدفع التزام سريع ولا رجعة فيه من الخلايا إلى التمايز الطرفية كما يتضح من تشكيل تقاطع ضيق والتحريض من لور و إنف على ارتفاع الكالسيوم العلاج إلى ككس القاعدية 4 ، 5 .
بالإضافة إلى تشكيل حاجز، كك البشرة هي أيضا عنصرا هاما من نظام المناعة الفطرية في الجلد. استجابة لمسببات الأمراض أو أنماط الجزيئية المرتبطة التالفة (دامبس) صدر على أشعة أوفب أو إصابة، ككس يمكن أن تنتج كميات كبيرة من السيتوكينات الالتهابية، مثل TNFα، IL6 و IFNβ، مما يؤدي إلى تنشيط جهاز المناعة> 6 ، 7 ، 8 ، 9 . على الرغم من أن الإشارات الالتهابية المناسبة من ككس مطلوبة للتخلص من الممرض، والاستجابة الالتهابية غير المنضبط قد تؤدي إلى تطوير الأمراض الجلدية للالتهابات، مثل الصدفية والوردية 6 ، 8 .
عموما، كك تلعب دورا حيويا في الحفاظ على حاجز الجلد سليمة والشروع في استجابة مناعية على غزو الممرض أو الإهانات البيئية. ولذلك، والثقافة الأولية من كك البشرة هي تقنية مفيدة لدراسة البيولوجيا الظهارية، والتمايز كك، فضلا عن استجابات المناعة الفطرية تحفيز كك. العزلة والثقافة الأولية كوز البشرة الماوس يمكن أن يكون عملية صعبة بسبب حساسية كك وحساسية لمختلف المنبهات الخارجية. هنا نحن تصف طريقة لعزل والثقافة ككس إما من جلد الماوس حديثي الولادة أوبالغ، ذيل الفأر، جلد. للكبار كك العزلة، ونحن لا تستخدم الجلد الظهري الماوس لعزل كميات كافية من كك قابلة للحياة من هذا النسيج يمكن أن يكون صعبا للأسباب التالية: أولا، الجلد الظهرية الكبار في مرحلة يستريح من دورة الشعر (تيلوجين) يتكون من رقيقة البشرة مع 1-2 طبقات فقط من الخلايا، مما يؤدي إلى انخفاض العائد الخلية وفصل غير فعال للبشرة من الأدمة، والتي هي الخطوة الحاسمة لنجاح عزل كك. ثانيا، ارتفاع كثافة بصيلات الشعر الذي هو موجود على الجلد الظهرية الكبار يزيد من صعوبة في فصل البشرة من الأدمة. بدلا من ذلك، نحن بشكل روتيني استخدام الجلد الذيل كمصدر للكبار الماوس الماوس كك هذه الظهارة هي أكثر سمكا مع 3-5 طبقات من كك البشرة. كما أن لديها أقل كثافة بصيلات الشعر، والتي لا تتداخل مع الانفصال البشرة، مما يسمح عزل كك من أي الكبار الجلد ذيل الماوس بغض النظر عن العمر ومرحلة ركوب الدراجات الشعر من الماوس. نينا معزولةتصنف ككس تال للأطباق ثقافة الجيلاتين المغلفة، في حين يتم استخدام الأطباق المغلفة الكولاجين للبذور معزولة ككس الكبار بسبب ضعف القدرة من الخلايا الكبار على الانضمام إلى نظرائهم حديثي الولادة. لثقافة الماوس ككس، ويستكمل منخفض الكالسيوم المتوسطة القاعدية مع دغس، الذي يحتوي على عامل نمو البشرة (إغف)، ترانسفيرين البقري، مثل الأنسولين النمو IGUC1 (IGF1)، البروستاجلاندين E2 (PGE2)، ألبومين المصل البقري (بسا) والهيدروكورتيزون. بين 2-4 أيام بعد الطلاء الأولي، يمكن أن تغسل معظم ككس متباينة خلال التغييرات المتوسطة اليومية، وتبين الخلايا الملتصقة المتبقية التشكل المرصوف بالحصى النموذجي 4 ، تتكاثر، ولا تعبر عن التمايز المبكر علامة K10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية أوسد.
1. الابتدائي الماوس كك العزلة والثقافة من الجلد حديثي الولادة
- التضحية بعد الولادة الولادة 0-2 الولدان من سلالة الماوس C57B / 6 ويلديب بواسطة قطع الرأس باستخدام مقص. قطع أطرافه فقط فوق المعصم والكاحل المفاصل، ثم قطع الذيل تماما، وترك حفرة صغيرة.
- لتقشير الجلد كله، إدراج أول مقص حاد من خلال ثقب في الذيل وقطع الجلد على طول خط الوسط الظهرية من الجسم لافتتاح على الرقبة. بعد ذلك، استخدم ملقط واحد لفهم الجسم المكشوف وملقط أخرى لفهم الجلد، وقشر بلطف الجلد كله من الجسم وعلى جذوع الساق مع حركة مستمرة واحدة.
- تقشر الجلد كما قطعة واحدة سليمة ويجب الحرص على عدم كسر الجلد إلى قطع لأن هذا سوف يؤدي إلى فقدان الخلية خلال الخطوة ديسباس.
<لي> شطف الجلد المقشر مع 15 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في طبق بتري 10 سم، ثم وضع الجلد من كل الجرو في أنبوب 2 مل مليئة الباردة الباردة ديسباس العازلة الهضم، والذي يحتوي على 4 ملغ / مل ديسباس في وسط النمو كك (كك المتوسطة القاعدية لديها 0.06 ملي كاكل 2 ، دغس، والمضادات الحيوية / أنتيميكوتيكش). - تأكد من أن الجلد غير مطوية في الأنبوب لأن هذا سوف يؤدي إلى التعرض الكافي للمنطقة مطوية إلى حل ديسباس.
- في اليوم التالي (بعد 12-18 ساعة في ديسباس)، ونقل الجلد جنبا إلى جنب مع حل ديسباس في طبق بتري. نقل كل قطعة الأنسجة إلى طبق بتري جديد مع 15 مل برنامج تلفزيوني العقيمة لغسل بعيدا ديسباس الزائدة.
- باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، فهم الجلد من برنامج تلفزيوني،ورفع الجلد، ونقل إلى طبق بتري جديد مع الجانب البشرة إلى أسفل والجانب الأدمة حتى. تمدد بعناية طيات الجلد بحيث يتم تمديده بشكل كامل على طبق بتري.
- مكان 500 ميكرولتر من حل الهضم القائم على التربسين لكل الجلد في طبق بتري الجديد. باستخدام ملقط، ورفع ببطء الأدمة حتى وبعيدا عن البشرة، في حين عقد البشرة إلى أسفل. التخلص من الأدمة كما المواد بيوهازاردوس. نقل البشرة فصل وتطفو على كل قطرة من حل التربسين مع الطبقة القاعدية النزولي.
- إذا تم طي البشرة على الحل التربسين، وإزالة أي طيات باستخدام ملقط لضمان كفاءة الهضم من كك القاعدية من ظهارة.
- احتضان الجلد على طبق بتري في حل التربسين في درجة حرارة الغرفة (مع غطاء مغطى) على شاكر الأفقي مع الإثارة لطيف لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 2 مل من مكمل النمو كك المتوسطة للبشرة (حوالي 1 بوصة مربعة في الحجم لكلالبشرة) إلى طبق بتري. فهم البشرة باستخدام ملقط، وفرك بقوة البشرة ذهابا وإيابا للافراج عن خلايا واحدة من ورقة البشرة.
- مشاهدة بدوره المتوسطة عكر بشكل متزايد كما يتم فصل الخلايا من البشرة. إمالة طبق بتري لجمع ونقل تعليق خلية إلى أنبوب جديد ترك ورقة البشرة المتبقية على الطبق.
- كرر مرتين أكثر من فرك ورقة البشرة بعد إضافة 2 مل وسط النمو كك، والجمع بين تعليق الخلية في نفس الأنبوب.
- الماصة حل الخلية صعودا وهبوطا بلطف عدة مرات لكسر أي كتل خلية باستخدام ماصة المصلية المناسبة، ثم تمريره من خلال مرشح 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديد.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها لمدة 5 دقائق في 180 × ز.
- نضح قبالة طاف و ريسوسبيند بلطف بيليه الخلية في 1 مل الباردة النمو كك المتوسطة / البشرة.
- عد الخلايا عن طريق عدادة الكريات.
- البذور الخلايا بكثافة 5 × 10 4 / سم 2 في وسط النمو كك في أطباق الثقافة المغلفة مسبقا مع المصفوفة خارج الخلية (إسم) المنتج الذي يعزز مرفق الخلية.
ملاحظة: نحن نستخدم التجارية المتاحة (على سبيل المثال عامل التعلق، وهي مادة الطلاء القائم على الجيلاتين (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل) تم استزراع الخلايا في حاضنة ترطيب مع 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية، وكانت المتوسطة الطازجة تجدد كل يوم.- للطلاء، معطف أطباق الثقافة مع المواد خلية مرفق الطلاء تحسنت لدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة إلى 2 ساعة قبل البذر الخلية. قم بإزالة عامل التعلق مباشرةمضيفا تعليق الخلية.
- تغيير المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء الأولي لإزالة الخلايا غير المرفقة، وتغيير المتوسطة يوميا حتى تصل الخلايا كونفلنسي المطلوب قبل التجربة.
ملاحظة: يمكن الجمع بين العزلات متعددة الجلد وحضنت في أنبوب واحد 15 مل (تصل إلى 5 جلود في أنبوب) تحتوي على 12 مل من محلول ديسباس. احتضان أنبوب الجلد بين عشية وضحاها في الثلاجة 4 درجات مئوية على المدورة.
2. الابتدائي الماوس كك العزلة من الجلد الذيل الكبار
- التضحية الكبار C57BL / 6 الماوس (يفضل أن يكون بين 6-15 أسابيع من العمر، سواء من الذكور أو الإناث) وفقا للوائح منشأة الحيوان. قطع ذيل قبالة الجسم من قاعدة الذيل، وقطع ~ 2 ملم من طرف الذيل بحيث يكون هناك ثقب مرئي في طرف.
- لقشر الجلد الذيل قبالة، أولا استخدام شفرة حادة لقطع على طول الجلد الذيل من القاعدة إلى طرف الذيل. بعد ذلك، استخدم ملقط واحد لفهم عظم الذيل المكشوفة وملقط أخرى لفهم الجلد، وقشر بلطف الجلد الذيل قبالة العظام مع حركة واحدة مستمرة. قطع الجلد المقشر من منتصف خط بحيث كل قطعة هو أقل من 2-3 سم طويلة.
- شطف الطرافة الجلد مقشرح 15 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في طبق بتري 10 سم، ثم وضع الجلد من كل ذيل إلى أنبوب 2 مل مليئة الباردة الباردة ديسباس العازلة الهضم (4 ملغ / مل ديسباس في وسط النمو كك).
ملاحظة: ويمكن أيضا قطع الجلد متعددة مجتمعة وحضنت في أنبوب واحد 15 مل (تصل إلى 5 ذيول لكل أنبوب) تحتوي على 12 مل من محلول ديسباس.- احتضان أنبوب الجلد بين عشية وضحاها في الثلاجة 4 درجات مئوية على المدورة.
- تنفيذ الخطوات 1.4 إلى 1.13 لعزل تعليق خلية واحدة من البشرة الذيل.
- البذور الخلايا البالغة بكثافة 10 × 10 4 / سم 2 (تحسب عن طريق مقياس كريات الدم) في وسط النمو كك في أطباق الثقافة المغلفة مسبقا مع الكولاجين.
ملاحظة: نحن نستخدم المتاحة تجاريا مجموعة طلاء القائم على الكولاجين (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل). تم تربيتها الخلايا في حاضنة ترطيب مع 5٪ كو 2 عند 37 درجة مئوية، وتم تجديد المتوسطة الطازجة كل يوم. بشكل عام، جيجب أن تكون مغلفة الأطباق ثقافة مع الكولاجين لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل البذر الخلية. نلاحظ أن هناك تعزيز كبير من مرفق كك الكبار إلى الطبق عندما المغلفة مع الكولاجين بالمقارنة مع عامل التعلق، وهو مادة الطلاء القائم على الجيلاتين. - تغيير المتوسطة 24 ساعة بعد الطلاء الأولي لإزالة الخلايا غير المرفقة، وتغيير المتوسطة يوميا حتى تصل الخلايا كونفلنسي المطلوب قبل التجربة.
3. في التمايز في المختبر ككس من قبل الكالسيوم عالية
- للحث على التمايز الطرفية، إضافة كاكل 2 إلى 0.2 ملم في وسط الاستزراع.
- بدلا من ذلك، تجويع كك مثقف بين عشية وضحاها دون مكملات النمو المضافة في انخفاض الكالسيوم وسط كك القاعدي قبل إضافة الكالسيوم عالية.
ملاحظة: سوف عامل النمو المجاعة تعزيز التزام الخلية إلى التمايز المبكر وتحريض علامات التمايز في وقت مبكر، مثل K10 5
4. أوفب التشعيع بوساطة خلية الموت و TNFα الإصدار من ككس
- ثقافة ككس الماوس في وسط النمو كك (في حاضنة مرطب مع 5٪ كو 2 في 37 درجة مئوية) مع تغيير المتوسطة يوميا حتى تصل الخلايا كونفلنسي. مباشرة قبل الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، وإزالة المتوسطة النمو واستبدالها مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. ثم تخضع الخلايا إلى 25 ميجا جول / سم 2 أوفب أو السيطرة وهمية (لا أوفب).
ملاحظة: يتم تنفيذ أوفب التشعيع باستخدام المصابيح أوفب المحمولة مع اثنين من 8 W لمبات (312 نانومتر) كما هو موضح سابقا 10 . بعد أشعة أوفب، يتم استنشق بس ويضاف المتوسطة الطازجة. - قياس وقياس بقاء الخلية من قبل كك-8 فحص بقاء الخلية في 6 و 8 و 24 ساعة بعد العلاج أوفب بعد تعليمات الشركة الصانعة 11 .
- جمع المتوسطة مكيفة من ككس تعامل مع أوفب في نقاط الوقت المطلوب وقياس TNFα صدرفي وسيلة مكيفة من قبل ماوس تنف (مونو / مونو) إليسا عدة بعد تعليمات الشركة المصنعة 7 ، 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ارتفاع الكالسيوم التمايز محطة الناجم عن ككس حديثي الولادة والكبار. كروس البشرة الأساسية الأولية مطلي والحفاظ عليها في 0.06 ملي كاكل 2 نمت باعتبارها أحادي الطبقة، وكانت الخلايا الفردية شكل مضلع مع الفضاء بين الخلايا متميزة، والتي تبين ظهور حصوه عندما متموجة ( الشكل 1A والشكل 2A ). رفع كاكل 2 إلى 0.2 ملي يسبب تغيير التشكل السريع للخلايا. في غضون 8 ساعة بعد التحول الكالسيوم عالية، أصبحت الخلايا بالارض وأصبح الفضاء بين الخلايا متميزة أقل وضوحا، وبحلول 24 ساعة التصاق خلية الخلية مع تقاطعات ضيقة أصبح واضحا ( الشكل 1A والشكل 2B ). بدأ تشكيل المغلف الخلية زرع والطبقية الخلية العمودي حوالي 48-72 ساعة بعد التحول الكالسيوم عالية ( الشكل 2B). لتحليل إعادة تشكيل أكتين وخلية خلية تشكيل تقاطع ضيق خلال التحول الكالسيوم عالية، وكانت ملطخة ككس تعامل مع 0.2 ملي كاكل 2 مع فالويدين ( الشكل 1B ) لقياس إعادة تشكيل أكتين خلال التمايز كك 13 . تم الكشف عن تشكيل أكتين الألياف الليفية الغنية التوقعات الإسقاطية بين الخلايا المجاورة في وقت مبكر من 3 ساعة بعد التبديل الكالسيوم، وإعادة عرض الألياف أكتين مزيد من التقدم بين 6-24 ساعة، وبحلول 48 ساعة أصبح الطبقية الخلية بارزة ( الشكل 1B ).
قابلية الماوس ككس إلى أوفب تسبب الموت الخلية و TNFα الإفراج . تم الكشف عن ككس الماوس مثقف الكبار إلى 25 ميج / سم 2 أوفب التشعيع، وتم تحليل بقاء الخلية و TNFα صدر في وسط الثقافة. كما هو مبين في الصور على النقيض من المرحلة ( فيغوإعادة 3A)، فضلا عن مقايسة بقاء الخلية ( الشكل 3B )، أثار أوفب وقت يعتمد الموت من كك. قبل 24 ساعة، تم تقريب غالبية الخلايا و فصلت من الطبق ( الشكل 3A ). كما تم قياسها من قبل مقايسة بقاء الخلية، ~ 90٪ من الخلايا لقوا حتفهم في غضون 24 ساعة بعد العلاج أوفب ( الشكل 3B ؛ p <0.001 كما يحسبها في اتجاه واحد أنوفا اختبار المقارنة متعددة). وأخيرا، أظهرنا أن TNFα، وهو السيتوكين الهامة التي يسببها أوفب ومحركات كك موت الخلايا المبرمج التالية الأشعة فوق البنفسجية التشعيع 14 ، تم إفرازه بوفرة (~ 250 بيكوغرام / مل في غضون 24 ساعة بعد الأشعة فوق البنفسجية-التشعيع؛ P <0.001) في وسط الاستزراع كوف أوفب المعالجة في الوقت تعتمد الطريقة ( الشكل 3C ).
الشكل 1: الثقافة الأولية للماوس الوليد ككس، وارتفاع الكالسيوم المحرض الطرفية التمايز وتشكيل خلية تقاطع ضيق. ( ألف ). تم التعامل مع الماوس الابتدائية حديثي الولادة ككس مع ارتفاع الكالسيوم (0.2 ملي كاكل 2 )، واتخذت الصور النقيض المرحلة في التكبير 4X في 0 ساعة (كترل) وعند 8 ساعات بعد العلاج. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( باء ). تم تمييز ككس الوليدية في وجود 0.2 ملي كاكل 2 ، وكانت ملطخة الخلايا مع فالويدين (الأحمر) لتصور تشكيل الإسقاطات الأفيتين الغنية بالألياف الألياف بين الخلايا المجاورة خلال التمايز. كانت كونترستيند نوى مع دابي، وملطخة الألياف أكتين مع فالويدين رودامين. شريط مقياس = 25 ميكرون. أخذت الصور في التكبير 20X باستخدام المجهر مضان تعيين إلى قناة دابي (لتلطيخ نوى) وقناة رفب (لتلطيخ الأكتين). لانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الثقافة الأولية وارتفاع الكالسيوم المستحثة التمايز الطرفية للكبار الماوس الماوس ككس. ( ألف ). المرحلة النقيض من الصور في 10X التكبير من ككس الماوس الكبار الأساسي في 8 ساعة، 1 يوم، 2 أيام و 3 أيام بعد الطلاء الأولي. تمثل اللوحة العلوية الخلايا التي تزرع في دغس، وتمثل اللوحة السفلى الخلايا التي نمت في 10٪ فلكس تشيبسيد (كفبس) مع 8 نانوغرام / مل المؤتلف الماوس إغف. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( باء ). متفاوتة الماوس ككس متموجة في وجود 0.2 ملي كاكل 2 ، واتخذت الصور النقيض المرحلة في 10X التكبير في 0 (السيطرة)، 8، 24، 48، و 72 ساعة بعد ارتفاع الكالسيوم التبديل. شريط مقياس = 100 ميكرون.نك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الثقافة الأولية للكبار الماوس الماوس ككس، وقابلية للكبار الكبار ل أوفب الناجم عن خلية الموت وإطلاق TNFα. تم تربيتها ككس الماوس الكبار الابتدائية ل كونفلنسي، ثم يتعرض إلى 25 ميج / سم 2 أوفب التشعيع. ( A ) الصور على النقيض من المرحلة في 10X التكبير المتخذة في 12 و 24 ساعة بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية أظهرت موت الخلايا التي تعتمد على أوفب الوقت تعتمد. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( ب ) تم قياس بقاء الخلية من قبل مقايسة بقاء الخلية كك-8 في 6 و 8 و 24 ساعة بعد العلاج أوفب. ( C ) وقد تم قياس الإفراج الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية من TNFα إلى وسائل الإعلام في الوقت المحدد نقاط من قبل إليسا. تشير جميع أشرطة الخطأ يعني ± سيم. تم حساب قيم p بواسطة مقارنة متعددة أنوفا في اتجاه واحداختبار (***، p <0.001) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البشرة البشرة وظائف كحاجز حاسم لفصل وحماية الجسم من البيئة الخارجية والضرر من فقدان المياه، مسببات الأمراض، الحرارة والأشعة فوق البنفسجية التشعيع. و ككس هي سلالة الخلايا السائدة من البشرة، والثقافة الأساسية لل كك البشرة هي أداة مفيدة لدراسة وفهم العمليات البيولوجية لتشكيل حاجز واستجابة كك إلى الشتائم البيئية في المختبر .
هنا نحن تصف أساليب لعزل والثقافة كك البشرة الأولية من حديثي الولادة والجلد الماوس الكبار. في حين الابتدائية ككس الماوس يمكن أن تكون معزولة بشكل مريح من الجلد الماوس حديثي الولادة، والعزلة والثقافة الناجحة لل ككس الكبار تعتبر صعبة بسبب ترقق البشرة وارتفاع كثافة بصيلات الشعر للبالغين الماوس الجلد الظهري. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم الكبار الجلد ذيل الماوس كمصدر مريحة وفيرة من كك القاعدية. بسبب وجود البشرة سميكة وانخفاض كثافة بصيلات الشعر في جلد الذيل، والخطوة الحاسمة لعزل كك عن طريق فصل البشرة من الأدمة يصبح ممكنا بعد بين عشية وضحاها ديسباس الهضم من جلد الذيل. في المقابل، كانت محاولتنا لعزل كك من الجلد الظهرية الكبار باستخدام هذا البروتوكول غير ناجحة، مما أدى إلى انخفاض العائد الخلية بعد العزلة وانخفاض مرفق الخلية بعد الطلاء. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن العزلة الناجحة وثقافة ككس من الجلد الظهرية الكبار بعد تريبسين بين عشية وضحاها الهضم من الجلد الخالي من الفراء 15 ، مما يشير إلى أن ديسباس وحدها قد لا تكون كافية لاستخراج كك الجريبي من الأدمة من الجلد الظهرية الكبار.
في هذا البروتوكول، تم زرع ككس الأولية في انخفاض مستوى الكالسيوم تستكمل مع دغس بدلا من الكالسيوم المستنفدة تشليسد-فبس، والذي كان يستخدم على نطاق واسع في عدة بروتوكولات ثقافة كك الفأر التي نشرت سابقا 4 ، 15 ، "> 16 ، 17 ، 18. في هذه الدراسة، لاحظنا أن دغس متفوقة على فبس تشيليكسد لثقافة الماوس الكبار كك والحفاظ على مورفولوجيا الخلايا القاعدية كك ( الشكل 2A )، ومع ذلك، فمن المرجح أن فعالية Chlexed- فبس للحفاظ على مورفولوجيا القاعدية كك قد تعتمد على الكثير فبس المستخدمة في كل دراسة.
باستخدام الطرق المعروضة هنا، أثبتنا أن كلا من حديثي الولادة والكبار الماوس الماوس ككس ردت على ارتفاع الكالسيوم أثار التمايز الطرفية، وتشكيل خلية تقاطع ضيق وطبقية ( الشكل 1 والشكل 2 ). بشكل عام، ورفع مستوى الكالسيوم خارج الخلية إلى أكبر من 0.1 ملي مشغلات التمايز محطة من كك القاعدية 4 ، 5 ، 17 ،أس = "كريف"> 19. وقد أفيد أن المستوى المتوسط من الكالسيوم (0.1- 0.16 ملم) أدى إلى حد كبير التعبير عن علامات التمايز في وقت مبكر، مثل K1 و K10، خلال أول 24 ساعة على التبديل الكالسيوم، في حين K1 و K10 كان يسببها فقط في صغيرة جزء من الخلايا عندما تعامل مع ارتفاع نسبة الكالسيوم (1 ملم) 19 ، 20 . ومع ذلك، فإن متوسط الكالسيوم أعلى (≥1 ملم) وقد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الدراسات الأخرى بسرعة وتحفيز بقوة كك الطبقية والتعبير عن الجينات التمايز في وقت متأخر، مثل إنف و لور 4 ، 21 ، 22 ، 23 . واستنادا إلى خبرتنا، فإن مستوى متوسط من الكالسيوم، مثل 0.2 ملي كاكل 2 ، يؤدي إلى بداية تدريجية وبطء من التمايز الطرفية، في حين أن ارتفاع مستويات الكالسيوم (≥1 ملم) تسريع بشكل كبير في بداية كك تيالتمايز العشوائي، مما يؤدي إلى نافذة زمنية أقصر لدراسة التغيرات الخلوية أثناء التمايز. لذلك، استخدمنا 0.2 ملي كاكل 2 للحث على تمايز محطة كك، ولقد أظهرنا أن هذا المستوى الكالسيوم وسيطة أدى إلى تغيير تدريجي في التشكل الخلية القاعدية إلى مورفولوجيا الخلايا القرنية الطبقية في غضون 72 ساعة بعد التبديل الكالسيوم ( الشكل 2B ).
وقد أظهرت مجموعتنا سابقا أن ككس البشرة أيضا أن تلعب دورا هاما لبدء الاستجابات الالتهابية لمسببات الأمراض أو دامبس صدر خلال الإصابة و / أو الأشعة فوق البنفسجية-التشعيع 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 . في متسقة مع تلك الموجودة في الملاحظات الجسم الحي ، وهنا أظهرنا أن مثقف الماوس الكبار ككس كانت عرضة للغاية لموفرة الخلايا التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية و كك المعالجة أوفب صدر كبيركمية TNFα، وهو سيتوكين التهابات الرئيسية التي ينشط الجهاز المناعي.
وباختصار، توفر ثقافة الخلية الأولية البشرة كك الأولية مفيدة في نموذج المختبر لدراسة تشكيل حاجز البشرة والاستجابة المناعية الفطرية من كك، والأساليب المذكورة هنا سوف تكون ذات فائدة للباحثين متابعة الدراسات في البيولوجيا الجلدية في الماوس حديثي الولادة كما وكذلك في الماوس الكبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لأمراض المفاصل والأمراض العظمية والسكري والجسم منح (R01AR069653 لتشانغ لج)، والمعاهد الوطنية للدعم الصحي (5T32AR062496-03 إلى كا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).
