Summary
ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。
Abstract
ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用の生化学的分析に広範に使用されている分子生物学の基本的ツールである。これらの相互作用は、伝統的に、2枚のガラスプレートの間に生成されたポリアクリルアミドゲルおよび垂直に電気泳動されたサンプルで分析されてきた。しかし、ポリアクリルアミドゲルは、トレイにキャスティングされ、水平に電気泳動されると、いくつかの利点をもたらす。例えば、蛍光RNA基質と特定のタンパク質との間の複合体を分析するために使用される水平ゲルは、電気泳動が進行するにつれて複数回画像化することができる。これは、実験中のいくつかの時点でRNA-タンパク質複合体をモニターする独特の機会を提供する。さらに、水平ゲル電気泳動は、多数の試料を並行して分析することを可能にする。これは、時間経過の実験を大幅に促進するだけでなく、複数の反応を同時に分析して、異なる成分および条件を比較することができる。ここで私たちはprRNA-タンパク質相互作用を分析するための水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコルを提供する。
Introduction
電気泳動移動度泳動シフトアッセイ（EMSA）は、特定のタンパク質-核酸相互作用1、2、3を分析するための貴重な生化学的ツールであることが証明されています。これらのアッセイは、核酸 - タンパク質複合体1の成分化学量論であるRNAまたはDNA 3に対するタンパク質の結合親和性に関する重要な情報を提供し、基質競合実験1を介したRNA結合タンパク質の結合特異性に関する重要な新しい洞察を提供する。
これらのアッセイのための従来の実験装置は、精製されたタンパク質を放射性標識されたRNA基質と混合することからなる。次いで、得られた複合体を、2つのガラスプレートの間に注がれた非変性（天然）ポリアクリルアミドゲルで分析し、次いで垂直装置3でサンプル電気泳動を行う。このアプローチは、タンパク質の核酸への結合の基礎をなす生化学的メカニズムにおける重要な洞察を提供するために徹底的に使用されてきたが、いくつかの制限もある。例えば、この基本戦略はスループットが比較的低く、多くの結合反応を並行して分析する必要がある用途には容易に適応できない。加えて、従来の縦型装置では、潜在的に電気泳動図3、 図4中に複数回に錯体を監視することが困難です。
ここでは、フラットベッド装置で鋳造ネイティブポリアクリルアミドゲル、水平電気泳動および蛍光標識されたRNA基質4、5、6、7を使用するEMSAアッセイの適応を提示します。これらの比較的簡単な変更を基本的なひずみに組み込むことtegyはいくつかの強力な利点を提供します。特に、水平フラットベッドフォーマットは、数十のサンプルを同時に分析するのに適しています4 。また、Bicaudal-Cタンパク質とそのRNA基質との間に形成されるRNA-タンパク質複合体の場合、水平ゲル中での電気泳動は、異なるRNA-タンパク質複合体を分離し、これらを非結合RNA基質から区別する能力を高める。
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Protocol
水平ネイティブポリアクリルアミドゲルの調製4 。
- 必要な材料の準備。
- 水平ゲル装置の場合は、27cm×21cmのトレイを備えたゲルボックス（37cm×24cm）を使用し、2つの24ウェルコームの容量を使用します。この設定では、合計48個のサンプルを同時に分析できます。
- 40％アクリルアミド - ビス19：1,5x TBE（Tris-ボレート-EDTA pH8.0）、TEMED、および10％APS（過硫酸アンモニウム）の試薬を調製する。
- 10％天然アクリルアミドゲルの生成。
- 500mLのフラスコに、80mLの5×TBE、100mLの40％アクリルアミド、および水を最終容量400mLまで加える。
- 10％APS 4mLとTEMED400μLを加える。よく混ぜます。
- 混合物を水平キャスティングトレーに注ぎ、ゲルを30分間重合させる。ゲルの厚さは約2cmです。
注：ゲルはヒュームフードでキャストしてスピードを上げることができます重合を開始する。重合後、薄い液体層がゲルの上に残る。 - 液体を注ぎ、ランニングバッファーですすいでください。慎重に櫛を外し、シリンジを使用してランニングバッファーでウェルをリンスします。
- ランニングバッファーの準備。
- ゲルボックス用の1x TBEランニングバッファー2 Lを調製する。 400mLの5XTBEを1600mLで希釈し、混合する。冷たい部屋に1x TBE緩衝液を入れて冷ます。
- ゲルのプレ - ランニング
- 2Lの冷たいランニングバッファーをゲルボックスに加え、ゲルを挿入する。
- 冷たい部屋で4℃、1時間、120Vでゲルをプレランします。この間、結合反応を準備する。
2.結合反応8
- 2.1。以下の反応成分を調製する。
20mM DTT
10mM BSA
10mM酵母tRNA
5X結合緩衝液（50mM HEPES pH8.0,5mM EDTA、25μl0mM KCl、0.2％Tween-20）
市販されている100nMフルオレセイン標識RNA
濃縮されたBicaudal-Cタンパク質
DEPC処理H 2 O中の50％グリセロール
DEPC処理H 2 O - 結合反応成分をRNaseフリーの微量遠心チューブに集める。
- チューブに、5μLの10mM BSA、5μLの20mM DTT、5μLの10mM酵母tRNA、10μLの5×Binding Bufferを加えます。
- タンパク質を50μL中250nMの最終濃度に添加する。 45μLの最終容量に水を加える。
- 5μLの蛍光標識RNA基質を添加する。市販の3 'フルオレセイン標識32-ヌクレオチド基質を使用する。
- 混合し、室温で30分間暗所でインキュベートする。
3.ネイティブ水平ポリアクリルアミドゲル上の試料の分析
- 各反応に、50μLのグリセロール15μLを添加し、穏やかに混合する。
- ケアフー各反応液30μLをゲルに加える。単一のウェルに充填することができる試料の量は、ゲルの厚さおよびウェルのサイズに依存して変化する。私たちは、24ウェルの櫛で作製したゲルの1ウェルに、15μLと45μLという少量を充填し、2cmの厚さに注いだ。
- 電源をゲル装置のスイッチに接続して電源を入れ、電圧を調整します。ゲルを4℃、120Vで反応させる。
注：水平ゲル装置の場合、これは約5V / cmになる。縦型ゲル装置の場合、これは16V / cmである。- 蛍光標識されたRNAの損傷または漂白を防ぐために、暗所で電気泳動を行います。
- 分析されるRNA-タンパク質複合体の特性に応じて電気泳動時間を変化させる。
注：水平EMSA分析の主な利点は、電気泳動を停止し、ゲルを画像化し、次にゲルlを装置に戻すことができ、電気泳動をより長い時間続けることができる。
4.ゲルのイメージング
- 蛍光基質の検出とイメージング用に設計された任意の機器で分析を行います。
- イメージャにゲルを置きます。
- イメージャの設定を調整します。フルオレセイン標識RNAリガンドについては、以下の設定を用いる：FAM（波長473nm）、750光電子増倍管電圧（PMT）、100μmピクセルサイズ。
- ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。
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Representative Results
水平ネイティブゲル電気泳動の力と汎用性を実証するために、我々はBicc1結合部位を含む蛍光標識されたRNAをアフリカツメガエル Bicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を分析しました。 Bicc1タンパク質は、動物の開発9の母体段階の間の細胞運命決定を制御するために、mRNAを特異的翻訳リプレッサーとして機能10、11、12、並びに成人13における特定の器官の機能、14。 Cripto-1 mRNAの8、12の3'UTRから32ヌクレオチド領域： アフリカツメガエルにおける私たちの仕事は、Bicc1タンパク質8のための第1の結合部位を同定しました。この結合部位は、技術の組み合わせを用いて定義された：RNase保護イオンおよびフットプリンティングアッセイ、 インビボ結合実験およびインビトロ EMSAアッセイ8 。
精製されたアフリカツメガエル Bicc1タンパク質を蛍光標識された32ヌクレオチドRNAと混合した。 Cripto-1 mRNAからのBicc1結合部位8 。別の反応において、Bicc1タンパク質を、サイクリンB1 mRNAの3'UTRに由来する蛍光標識された32ヌクレオチドRNAと混合した。 Bicc1は、サイクリンB1 mRNAの8、12には結合せず、このRNAは、陰性対照としての役割を果たす。各反応の半分を垂直方向の天然ポリアクリルアミドゲル（ 図1A ）で分析し、他の部分は水平ネイティブゲル（ 図1B ）を用いて平行して分析した。どちらの方法を用いても、Bicc1がRNA Cripto-1 RNAに結合し、特異的複合体aを形成することは容易に明らかであるサイクリンB1陰性対照RNAに結合しない。しかし、Bicc1-Cripto-1複合体は、水平ゲルで分析すると、その検出を容易にし、非結合RNAからのタンパク質-RNA複合体の識別を可能にする。画像化後、ゲルをゲル装置に戻し、さらに3時間半電気泳動した。ゲルを再イメージングした後、複合体はさらに移動し、まだ容易に検出可能であり、安定性を示した（ 図1C ）。最初のイメージング後に電気泳動および分析を続けるこの能力は、不可能ではないにしても、垂直ゲル形式では困難である。
図1：Cripto1 RNAへのBicc1の結合を分析するための垂直および水平ネイティブゲルの比較。 Bicc1結合実験は、32ヌクレオチド蛍光CyclinB1 RNA陰性対照または蛍光32ヌクレオチドCripto1 RNA陽性対照を用いて行った。各反応には0nMまたは250nMのSUMO-Bicc1 N末端のいずれかが含まれており、4℃で120Vで30分間、（ A ）垂直ポリアクリルアミド生ゲルで分析するか、または水平ポリアクリルアミド生ゲル（ B ）4℃で120Vで2時間、または（ C ）4℃で120Vで5.5時間。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ネイティブポリアクリルアミドゲルは、タンパク質-RNA相互作用を調査し、伝統的に、これらのゲルを上下に2、3電気泳動するための貴重なツールです。我々が作成され、水平方向に1、4、6、7、15電気泳動ネイティブポリアクリルアミドゲルを代入プロトコルの変形を使用しています。蛍光標識されたRNA基質と組み合わせて使用されるこれらの変化は、タンパク質-RNA結合相互作用の生化学分析に多数の利点を提供する。これらの利点には、緩衝液を下部チャンバから上部に移すためにポンプを必要とする垂直装置と比較して、緩衝液の混合が単純化されており、水平のゲルは、水平ゲル電気泳動は、しばしば、垂直ゲルと比較してRNA-タンパク質複合体の改善された分解能を提供し、水平ゲル電気泳動は、分析中に複数の時点で実験を画像化する能力を提供する。
もう1つの大きな利点は、水平型フォーマットが、複数のサンプルを並行して分析する能力を提供する多数のウェルを有するゲルを作成することに役立つことである1 。この特徴は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための生化学的ツールとしての使用を著しく拡大する。例えば、複数のサンプルを分析する能力は、分析15ならびに結合複合体構成要素15の化学量論を定義するために設計された実験をk offは、競合実験15の使用を介してタンパク質-RNA複合体形成の定量的パラメータを調査を容易にします。さらに、蛍光RNA基質単一の反応からそのような蛍光偏光結合アッセイなどの複数の分析を行い、定量的および定性的な結合データ5、15の両方を得ることができます。
水平ゲルセットアップから最適な結果を得るために、イメージングのための複合体の品質を改善するために調整することができる様々なパラメータがある。これには、タンパク質RNA複合体の遊離RNAからの分離をより容易に取り扱い、向上させるために、ゲルのアクリルアミドパーセンテージを変更することが含まれる。しかしながら、そのサイズのために低いパーセントのアクリルアミドゲルを取り扱うことは困難であり得る。 7.5％以上のアクリルアミド濃度を持つゲルを使用することが最も簡単です。また、必要に応じて電気泳動条件を変更して、タンパク質-RNA複合体の安定性を改善することができる。電気泳動電圧を調整し、ゲルを室温で作動させる。4℃でプレラン条件を調節することにより、
多くの利点にもかかわらず、水平ネイティブゲル電気泳動アッセイのいくつかの制限がある。例えば、その有用性は、蛍光性RNA基質を使用することによって最大化される。選択されたフルオロフォアおよびRNAのサイズに依存して、このような基質を得ることは高価になる可能性がある。さらに、水平ゲルは一般に垂直ゲルよりもはるかに大きく、したがってポリアクリルアミドおよびDEPC処理溶液のようなより多くの量の材料を必要とする。
水平ネイティブゲル電気泳動は、臨床的に関連するRNA-タンパク質相互作用を標的とする化合物を同定しようとする分子スクリーニングの検証ツールとして使用される可能性を秘めています16 。そのようなスクリーニングは、典型的には、さらなる研究のための関連する化合物を同定するための溶液生化学アッセイを使用する。垂直フォーマットと比較して水平フォーマットのスループットが高い潜在的な候補者の二次的検証のためのツールとしてネイティブゲル電気泳動を適用する機会を提供する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
フィギュアを準備してくれたLaura Vanderploegに感謝します。 Sheetsラボでの作業は、NSFグラント1050395とNIHグラント（R21HD076828）によってサポートされています。 Ryderラボの研究は、NIHグラントR01GM117237とR01GM117008によってサポートされています。 Megan Dowdleは、国立衛生研究所（T32GM008349）の全米医科学研究所を通じて、ウィスコンシン大学マディソン大学院大学およびバイオテクノロジー訓練プログラムを通じて、SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowshipの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
