Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग

Published: July 27, 2017 doi: 10.3791/56041
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Tissue Biology, Program in Craniofacial Biology and Institute for Human Genetics, University of California San Francisco, 2Laboratory of Transgenic Models Diseases, Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Summary

यहां, हम कंफ़ेकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए माउस के माध्यमिक तालु संलयन के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइनों के साथ संयोजन में और यंत्रवत् अंतर्दृष्टि के लिए पथ अवरोधकों के साथ किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल अन्य विकास प्रणालियों में लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

द्वितीयक तालाल अलमारियों का संमिश्र अक्षय माध्यमिक तालु बनाने के लिए स्तनधारी के विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और इसकी व्यवधान से ग्रस्त माध्यमिक तालु का कारण बन सकता है, जो मानवों में एक सामान्य जन्मजात विसंगति है। माध्यमिक तालु संलयन का व्यापक अध्ययन किया गया है जिससे कई प्रस्तावित सेलुलर तंत्र शामिल हो सकते हैं जो इस प्रक्रिया को मध्यस्थ बना सकते हैं। हालांकि, इन अध्ययनों का विकास के दौरान या स्थैतिक समय-समय पर विश्लेषण किए जाने वाले निश्चित व्याख्यात्मक संस्कृतियों के दौरान प्रगतिशील समय-समय पर निर्धारित भ्रूण के ऊतकों पर ज्यादातर प्रदर्शन किया जाता है। गतिशील morphogenetic प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए स्थैतिक विश्लेषण सीमित है, जैसे कि एक तालु संलयन और गतिशील सेलुलर व्यवहार किस प्रकार के पैदल संबंधी संलयन में मध्यस्थता का अछालन है। यहाँ हम माउस भ्रूण में पूर्व vivo माध्यमिक तालु संलयन के लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तालु संलयन के सेलुलर व्यवहार की जांच के लिए, एपीथेलियल -विशिष्ट केराटिन 14-कोर का उपयोग आरओएस में तालु उपकला कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया गया थाए 26- एमटीएमजी फ्लोक्स रिपोर्टर भ्रूण फ़िलीमेंटस एक्टिन की कल्पना करने के लिए, लाइफैक्ट-एमआरएफप्रसार रिपोर्टर चूहों का उपयोग किया गया था। माध्यमिक तालु संलयन का लाइव इमेजिंग भ्रूण के दिन (ई) के 14-चरण मंच भ्रूण और संवृद्धि का एक गिलास नीचे के डिब्बों में हाल ही में पालन किए जाने वाले माध्यमिक तालाल अलमारियों को विच्छेद करके निष्प्रभावी करके किया गया था, जो एक उलटे confocal microscope के साथ इमेजिंग को सक्षम करता है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने माध्यमिक तालु संलयन के दौरान विभिन्न उपन्यास सेलुलर व्यवहारों का पता लगाया है। अंतरिक्ष और समय में कितने अलग-अलग सेल व्यवहार समन्वित होते हैं इसकी सराहना इस गतिशील morphogenetic प्रक्रिया की हमारी समझ के लिए काफी योगदान देता है। यह प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती माउस लाइनों या औषधीय अवरोधकों के साथ इलाज किये जाने वाले संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है ताकि यह पता लगा सके कि द्वितीयक तालु संलयन कैसे नियंत्रित है।

Introduction

ऊतक संलयन कई अंगों के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रमुख मानव जन्म दोष जैसे फांक होंठ और तालु, स्पाइना बिफिडा और हृदय के विकृतियों के कारण ऊतक संलयन 1 में दोष हो सकते हैं। विकास 2 , 3 , 4 में ऊतक संलयन को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए माउस के माध्यमिक तालु संलयन का व्यापक अध्ययन किया गया है। माउस में, द्विपक्षीय मेकिलरी प्रक्रियाओं में से प्रत्येक माध्यमिक तालाल शेल्फ के परिणाम के साथ, ई -11.5 के आसपास माध्यमिक तालु विकास शुरू होता है। तालाल अलमारियों की प्रारंभिक वृद्धि जीभ पर खड़ी होती है, लगभग E14.0 तक, जब तक, तालाल अलमारियों को जीभ के ऊपर क्षैतिज रूप से ऊंचा किया जाता है। मध्यकाल के एपिथेली का निर्माण करने वाले दो तालाल अलमारियों के एपटीथिया के बीच शारीरिक संपर्क में मध्यिकृत निर्देशित विकास परिणामई 14.5 पर अल सीम (एमईएस) मध्यवर्ती तालाल अलमारियों के बीच से मध्यवर्ती एमईएस हटाया जाना चाहिए ताकि मेसेनचिमल संगम और ई -15.5 3 द्वारा एक अक्षुण्ण, पूरी तरह से जुड़े हुए माध्यमिक तालु का विकास किया जा सके।

कैसे एक साझा उपकला एमईएस सेल परत दो अलग अलग तालाल अलमारियों के बीच बनाई गई है, और फिर मेसेनचिमल सामंजस्य को प्राप्त करने के लिए हटा दिया गया है, तालु विकास में एक केंद्रीय प्रश्न रहा है। माउस हिस्टोलॉजिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के अध्ययन, स्पष्टीकरण संस्कृति अध्ययन और कार्यात्मक माउस आनुवंशिकी प्रयोगों के आधार पर, कई मौलिक सेल व्यवहार इस प्रक्रिया में शामिल किए गए हैं। प्रत्येक पैलेटल शेल्फ के औसत दर्जे का किनारा एपिथेलियम मेई से फ़िलोपोडिया जैसे अनुमान , आरंभिक संपर्क 5 , 6 की सुविधा प्रदान करते हैं, इसके बाद एक साझा एकल एमईएस 6 , 7 में इन उपकला कोशिकाओं के बीच में अंतर होता है। परिणामस्वरूप साझा एमईएस निकालनाको तीन गैर-विशिष्ट तंत्रों द्वारा आगे बढ़ने का प्रस्ताव दिया गया है शुरुआती अध्ययनों में ऊष्मवैज्ञानिक अवलोकन और पूर्व विवो वंशावली के महत्वपूर्ण रंगों के साथ अनुरेखण से संकेत मिलता है कि एमईएस को एमईएस कोशिकाओं 8 , 9 के मेसेनचिमल संक्रमण (ईएमटी) से उपकला द्वारा हटाया जा सकता है, हालांकि हाल ही में, उपकला कोशिकाओं के आनुवांशिक वंशावली के निशान ने अनिश्चितता बढ़ा दी है मलयालम शिल्प मेसेनशिमा 10 , 11 , 12 के लिए उपकला कोशिकाओं का दीर्घकालिक योगदान। एपोपोटिक कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या, और कुछ म्यूटेंटों में उनकी संख्या में कमी जो उचित तालु संलयन से गुजरने में नाकाम रही है, ने विचार किया कि एपोपोसिस एमईएस विघटन 2 , 3 का प्रमुख चालक हो सकता है। अंत में, प्रारंभिक आधार पर पढ़ाई के आधार पर उपकला लेबलिंग और स्थैतिक अवलोकन, प्रगतिशील समय-समय पर, एमईएस कोशिकाएं11 , 13 यानोसोल और एंटेरोस्टोरियरे आयामों में पलायन करने का प्रस्ताव किया गया था, लेकिन इस तरह के गतिशील कोशिका व्यवहार प्रारंभिक रूप से अपरिपक्व थे क्योंकि वे जीना तंतुओं के ऊतक में रहते थे। हाल ही में, हम एक नए लाइव इमेजिंग पद्धति का विकास करके इन व्यवहारों का प्रत्यक्ष रूप से पालन करने में सक्षम थे, जो फ्लोटोसेंट लेबलिंग के माउस आनुवंशिक तरीकों को जोड़ती है, जिसे ट्रांटलल अलमारियों के विस्फोटक लाइव इमेजिंग के साथ मिलाया जाता है।

सबसे पहले, तालु संलयन के दौरान तालु उपकला कोशिकाओं में गतिशील सेलुलर व्यवहार की कल्पना करने के लिए, हमने Keratin14-cre चूहों 14 , 15 के साथ ROSA26- mTmG flox चूहों को पार कर एक उपकला-विशिष्ट संवाददाता माउस उत्पन्न किया। परिणामस्वरूप भ्रूण की तालु व्याख्या संस्कृति की कोंफोकल लाइव इमेजिंग ने कुछ पहले से प्रस्तावित सेलुलर व्यवहार की पुष्टि की और संलयन प्रक्रिया में उपन्यास घटनाओं की पहचान की 6 6 , 16 ड्राइविंग एक प्रमुख तंत्र था। इस इमेजिंग पद्धति का उपयोग अन्य रिपोर्टर लाइनों के साथ किया जा सकता है; हम संलयन प्रक्रिया के दौरान एटिन साइटोस्केलेटल गतिशीलता की जांच करने के लिए लाइफैक्ट-एमआरएफपीआरयूबी ट्रांसजेनिक माइस 17 , 18 का उपयोग किया। अन्य संवाददाताओं को भी तालू संलयन के अन्य विशिष्ट पहलुओं का पालन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है और इस विधि को इमेजिंग की जरूरतों और सूक्ष्मदर्शी उपलब्धता के आधार पर लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोपी या कताई डिस्क इन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी के रूप में अनुकूलित किया जा सकता है। लाइव इमेजिंग विकास जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बनता जा रहा है। पार्टीCularly, craniofacial morphogenesis जटिल है और चेहरे को प्रभावित करने वाले मानव जन्म दोष सामान्य हैं। इस confocal रहते इमेजिंग विधि बुनियादी विकास तंत्र के साथ ही मानव craniofacial असामान्यताओं के मूल की एक बेहतर समझ को सक्षम करने में मदद मिलेगी

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को सैन फ्रांसिस्को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया।

1. लाइव इमेजिंग मीडिया की तैयारी

  1. तरल संस्कृति मीडिया की तैयारी
    1. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 माइक्रोग्राम / एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड, 15 एमएम HEPES को डल्बेइको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) / एफ 12 में जोड़ें मीडिया।
      नोट: लाइव इमेजिंग मीडिया को इमेजिंग से पहले ताजा बना दिया गया था। इस मीडिया में फिनोल-लाल होता है जो लाइव इमेजिंग के लंबे समय पाठ्यक्रमों पर फोटोटोक्सिसिटी पैदा कर सकता है। फिनोल-लाल के बिना मीडिया के लिए प्रतिस्थापित करना दीर्घकालिक इमेजिंग में सुधार कर सकता है।
  2. कम पिघलने agarose समाधान की तैयारी
    1. 10 मिलीलीटर आटोक्लेवड आसुत जल में 3.5 मिलीग्राम का कम पिघलने वाले एगरोज़ को भंग कर 3.5% स्टॉक सोल्यूशन बनाने के लिए।
    2. Agarose का समाधान अच्छी तरह से मिलाएं और पानी के स्नान में 70 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें ताकि पूरी तरह से agarose को भंग कर दें।
    3. लाइव इमेजिंग मीडिया को जोड़ने से पहले इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नल में एगरोस सोल्यूशन को शांत कर दें।
    4. एक अंतिम एकाग्रता (0.6%) बनाने के लिए तरल लाइव इमेजिंग मीडिया के 5 एमएल के लिए एगरोस स्टॉक समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
    5. समय से पहले मजबूती को रोकने के लिए मीडिया को एजेंस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में रखें।

2. लाइव इमेजिंग के लिए पैलेट एक्सपैंट कल्चर तैयार करना

  1. हाल ही में बने ई -14.5 माध्यमिक तालाल अलमारियों का विच्छेदन
    नोट: हमारे अनुभव इमेजिंग फ्यूजन में तामलल अलमारियों की थोड़ी अनुष्ठान वाली जोड़ी से शुरू होना आवश्यक है; यह अनुपालन स्पष्टीकरण आंदोलनों को रोकता है जो इमेजिंग के दौरान होने से संलयन को रोकता है।
    1. 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में ई 14.5 चरण भ्रूण काटना और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -अनुसंधान का चयन करें (सेK14-रचनात्मक; रोसैस- एमटीएमजी फ्लॉक्स ) या (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) आरएफपी-एक्सप्रेसिंग ( लाइफैक्ट-एमआरएफपीआरयूबी ) से सकारात्मक भ्रूण फ्लोरोसेंट लैंप से लैस एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर। पूर्व-गर्म इमेजिंग संस्कृति मीडिया को agarose के बिना ऊतक स्थानांतरित करें।
    2. भ्रूण के सिर को काटें और दो ठीक सं 5 संदंश ( चित्रा 1 ए-सी ) का उपयोग करके ऊपरी मस्तिष्क क्षेत्र को हटा दें। भ्रूण को पकड़ने के लिए एक नंबर 5 संदंश का प्रयोग करें, जबकि दूसरे नंबर 5 संदंश के लिए पैटलाल अलमारियों के बाहर अतिरिक्त ऊतक काट दिया जाता है।
      नोट: ठीक कैंची का उपयोग एक नंबर 5 संदंश के बजाय भ्रूण सिर (पहला कदम) में कटौती करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सटीक कटौती करने के लिए दो नंबर 5 फाइनेंस संदंश बेहतर नियंत्रण दे देंगे।
    3. चित्रा 1 डी और 1 ई में दिखाए गए अनुसार तामलल अलमारियों को हानि पहुंचाए बिना बिना सावधानी से हटायें। हानिकारक तालियों की संभावना को कम करने के लिए, जीभ को मेन्दीय, च के विच्छेदन के माध्यम से रखेंजीभ का सावधानीपूर्वक हटाने से ओल्व किया गया
    4. मेम्बिबल और जीभ को हटाने के बाद, एमईएस ( चित्रा 1 एम ) में मजबूत रिपोर्टर सिग्नल की पुष्टि के लिए प्रतिदीप्ति के साथ एक स्टिरिओमिकोरोस्कोप के साथ माध्यमिक तालु के मौखिक पक्ष की जांच करें।
    5. मंडल और जीभ ( चित्रा 1 एफ ) को हटाने के बाद हिंडाब्रेन और मस्तिष्क स्टेम सहित पीछे के हिस्सों का विच्छेद करें।
    6. अनुवांशिक पैलेटल अलमारियों ( चित्रा 1 जी ) के साथ दोनों मैक्सिला को हटा दें।
    7. पूर्व और ऊपरी जबड़े के ऊतक को काटकर दोनों प्राथमिक और माध्यमिक तालु को बरकरार रखना ( चित्रा 1 एच और मैं )।
    8. एमईएस को उजागर करने वाले अन्वेषक के नाक पक्ष पर नाक पट निकालें
      नोट: विच्छेदन के इन बाद के चरणों को सावधानीपूर्वक ध्यान देने की जरूरत है कि दो माध्यमिक तालाल अलमारियों के बीच संपर्कों को बाधित न करें। नाक सेप्टम को निकालने में मदद मिलती हैअन्य क्षेत्रों से पृष्ठभूमि संकेत कम करें और ऊर्ध्वाधर ऊतक आंदोलन को कम करें, स्थिर इमेजिंग की अनुमति दें ( चित्रा 1 जे-एल )।
    9. तालाल अलमारियों को विदारक करने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए कि फिर से ऊतकों के बीच उपकला परत को कोई नुकसान नहीं होता है, फिर से मिडलाइन रिपोर्टर सिग्नल की जांच करें।
  2. जीवित इमेजिंग मीडिया के साथ संस्कृति पकवान में तालू स्पष्टीकरण सेट करना
    1. लाइव इमेजिंग मीडिया 35 मिमी गिलास नीचे डिश में रखें।
    2. विच्छेदित तालाल अलमारियों को उल्टा मौखिक ओर रख दें, जो कि उल्टे confocal खुर्दबीन ( चित्रा 1 एन ) के साथ इमेजिंग के लिए संभव के रूप में ग्लास नीचे के करीब है।
    3. तापमान को तेजी से कम करके या 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति डिश डालकर agarose solidification में तेजी लाने के लिए संस्कृति पकवान के निकट एक प्रवाहकीय सतह पर सूखी बर्फ छर्रों रखें। एक ठंडे प्लेट, जैसे कि पैराफिन एम्बेडिंग के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला एक भी इस पर इस्तेमाल किया जा सकता हैtage।
      नोट: जब सूखी बर्फ का इस्तेमाल किया जाता है, तो फ्रीजिंग मीडिया को रोकने के लिए agarose media change को ध्यान से निगरानी की जरूरत है।

3. कपटपूर्ण समय-सारिणी इमेजिंग ऑफ़ पैलेट एक्सपेंटेंट

  1. इमेजिंग और डाटा अधिग्रहण
    1. Agarose अर्द्ध मजबूती के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन कक्ष के साथ सुसज्जित एक उलटा confocal सूक्ष्मदर्शी में संस्कृति पकवान माउंट। एक सफेद रोशनी confocal खुर्दबीन और सेल पर्यवेक्षक डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी कताई का प्रयोग करें।
      नोट: हमने सीओ 2 गैस के बिना 15 मिमी एचईपीई युक्त एक संशोधित मीडिया का इस्तेमाल किया।
    2. संस्कृति डिश के बीच पेट्रोलियम जेली को रखो और मीडिया के वाष्पीकरण ( चित्रा 1 एन ) को रोकने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करके कवर करें।
      नोट: रातोंरात (ओ / एन) संस्कृति के बाद संस्कृति पकवान के शीर्ष पर कुछ संक्षेपण होता है लेकिन मीडिया का वॉल्यूम यह सुझाव नहीं बदलता है कि पेट्रोलियम जेली मीडिया को वाष्पीकरण से रोकता है।
    3. कम बढ़ाई उद्देश्यों (10x) के साथ ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएं और समय-अंतराल रहते इमेजिंग के लिए उच्च विस्तार वाले उद्देश्यों (3x डिजिटल ज़ूम के साथ 20x उद्देश्य या इमरर्स डब्ल्यू के साथ 40x का उद्देश्य) का उपयोग करें।
      नोट: विच्छेदित माध्यमिक तालाल अलमारियों फ्लैट नहीं हैं माध्यमिक तालु एक घुमावदार ढांचे है और यह एक ही विमान में पूरे एमईएस को छवि के लिए मुश्किल बनाता है। कम बढ़ाई (10x) इमेजिंग पूरे तालु इमेजिंग की अनुमति दे सकती है लेकिन 40x उद्देश्यों में गहरा Z पदों में विस्तृत सेलुलर आंदोलनों की जांच करने के लिए बेहतर छवि संकल्प प्रदान करेगा। मध्यम टलेट क्षेत्र में वक्रता उच्च है। पूर्वकाल और पीछे के तालू मध्यम तालु की अपेक्षा अपेक्षाकृत सपाट हैं। हम अक्सर सबसे बड़ी वक्रता के क्षेत्रों से बचने के लिए माध्यमिक तालु के मध्य-पूर्व की ओर चित्र देखते हैं।
    4. उचित लेजर उत्तेजना (जीएफपी के लिए 488 एनएम और आरएफपी के लिए 532/561 एनएम) ( चित्रा 2 ) के द्वारा 16-24 घंटे के लिए प्रत्येक चरण में 5 माइक्रोन के साथ कई जेड स्टैक स्कैन करें।
      नोट: संभावित phototoxicity को कम करने के लिए, न्यूनतम लेजर शक्ति और जोखिम समय का उपयोग करें। यह विशेष रूप से बहु रंग इमेजिंग के मामले में महत्वपूर्ण है झिल्ली के लिए 552 एनएम लेजर शक्ति का 22% का उपयोग करें, टमाटे (एमटी), झिल्ली जीएफपी (एमजी) के लिए 495 एनएम लेजर शक्ति का 30% और झिल्ली आरएफपी के लिए 561 एनएम लेजर शक्ति का 25%। औसत एक्सपोजर का समय 550 एमएस था।
    5. सेल ट्रैकिंग और मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

4. डेटा छवि विश्लेषण

नोट: यहां, इमरिस का उपयोग किया गया था समान डेटा का विश्लेषण भी ImageJ या Volocity सॉफ़्टवेयर पैकेज के साथ किया जा सकता है।

  1. छवि अनुक्रमों से 3-आयामी (3 डी) सतहों को प्रस्तुत करना
    नोट: यह खंड एक झिल्ली जीएफपी सिग्नल से उत्पन्न फिल्म से सतह की पीढ़ी को सक्षम करता है।
    1. संपादित करें पर क्लिक करें | प्रदर्शन समायोजन दिखाएं और सिग्नल की तीव्रता को समायोजित करने के लिए हिस्टोग्राम स्लाइडर का उपयोग करें जिससे झिल्ली संकेत स्पष्ट होफिल्म की लंबाई बाहर ( चित्रा 3 ए )।
    2. चित्र का उपयोग करके सही प्रक्षालित संकेत प्रसंस्करण | क्षीणन सुधार तीव्रता मोर्चे और तीव्रता वापस मानों को समायोजित करें ताकि झिल्ली का संकेत फिल्म की पूरी अवधि के दौरान स्पष्ट हो। इन मानों को सेट करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है
      नोट: सीमित लेजर पैठ के कारण तीव्रता वापस (गहरा Z स्थिति) मूल्य तीव्रता मोर्चे (सरफेस जेड पोजीशन) मान से कम होगा। इन मानों को भी Z श्रृंखला में संकेत तीव्रता को सामान्य करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। दोनों मूल्यों को ब्लीचिंग सुधार प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। क्षीणन सुधार को एमिशन क्षीणन सुधार 19 भी कहा जाता है।
    3. झिल्ली संकेत से एक सतह उत्पन्न करने के लिए, पार का चयन करें | सतहों , एक स्रोत चैनल और थ्रेसहोल्ड प्रकार (संपूर्ण तीव्रता) चुनें और एल्गोरिथ्म सेटिंग के तहतलेवल सेगमेंट केवल ब्याज का क्षेत्रफल और अंत में पूरी छवि की प्रक्रिया , आगे तीर पर क्लिक करके; आगे की तीर (डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें, या भूतल क्षेत्र विस्तार स्तर और थ्रेशोल्डिंग विधि को परीक्षण और त्रुटि के द्वारा निर्दिष्ट करें) को आगे बढ़ाएं, यह जांच लें कि उत्पन्न सतह प्रतिदीप्ति संकेत को दर्शाती है या नहीं। रुचि के क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए, क्षेत्र, और समय (एक्स) का चयन करके एक्स, वाई, जेड पोज़िशन फसल करके प्रदान करें।
      नोट: चुनें आखिरकार पूरी तस्वीर की प्रक्रिया पूरी की गई है ताकि समायोजन और थ्रेसहोल्ड पूरी फिल्म में लागू हो जाए।
    4. आगे की ओर तीर बटन पर क्लिक करके एक सतह उत्पन्न करें फिर झिल्ली संकेत के अनुरूप फ़िल्टर में हिस्टोग्राम को बदलकर सीमा को समायोजित करें।
    5. सतह उत्पन्न होने के बाद, सतहों / सेटिंग्स में सतह का चयन करें सतह संकेत को देखने के लिए और डबल ऊँची एड़ी के जूते को धक्का द्वारा सतह पीढ़ी प्रक्रिया खत्मतीर तीर बटन ( चित्रा 3 बी )
    6. सतह पर जाएं | नकाब किए गए चैनल छवि बनाने के लिए मास्क गुणों में सभी को संपादित करें और मास्क पर क्लिक करें ।
    7. ठीक क्लिक करने के बाद, मास्क चैनल विंडो स्वतः खुल जाएगी; जीएफपी चैनल का चयन करें, सतह के बाहर अधिकतम संकेत तीव्रता मूल्य ( संपादित करें | प्रदर्शन समायोजन में पाया जाता है) और सतह के अंदर कम से कम जीएफपी तीव्रता मूल्य के लिए वॉक्सल्स सेट करें (यह भी पाया जाता है संपादित करें | झिल्ली संकेत का मुखौटा उत्पन्न करने के लिए मास्क सेटिंग्स में, प्रदर्शन समायोजन )
    8. झिल्ली संकेत का मुखौटा, वॉल्यूम दृश्य में दिखाया जाएगा, छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके उलटे छवियां बनाएं कंट्रास्ट बदलें | उलटा ( चित्रा 3 सी )।
  2. औंधा सतह छवियों से स्पॉट का पता लगा रहा है
    नोट: यह खंड प्रत्येक कक्ष के केंद्र होने की अनुमति देता हैएक अद्वितीय स्थान के साथ चिह्नित और अंतरिक्ष और समय पर ट्रैक।
    1. सीन के ऊपर का चयन करें | स्पॉट | बनाएँ ; एल्गोरिथ्म सेटिंग्स में सेगमेंट केवल ब्याज क्षेत्र , अंततः संपूर्ण छवि की प्रक्रिया और ट्रैक स्पॉट (समय के साथ) को चुनते हैं।
    2. आगे तीर पर क्लिक करें और रुचि के क्षेत्र को निर्दिष्ट करें; स्थानों को ट्रैक करने के लिए क्षेत्र और समय चुनें; आगे तीर को आगे बढ़ाएं, मुखौटा चैनल को एक स्रोत चैनल के रूप में चुनें और अनुमान लगाए गए XY व्यास का स्थान निर्धारित करें।
    3. आगे तीर बटन पर क्लिक करने से स्वत: एक फिल्टर विंडो खुल जाएगी; प्रत्येक कोशिका के केंद्र में एकल धब्बों को उत्पन्न करने के लिए हिस्टोग्राम में मानों को बदलकर स्थान पहचान थ्रेशोल्ड को समायोजित करें ( चित्रा 3 डी )।
    4. अग्रेषण तीर बटन पर क्लिक करने से एल्गोरिथ्म विंडो खुल जाएगी, आटोरेग्रेजिव गति ट्रैकिंग मॉडल 20 को चुनें और अधिकतम ट्रैकिंग डिली को निर्दिष्ट करेंरुख और अधिकतम अंतराल का आकार जो कि समय की थोड़ी अवधि के लिए असंतुष्ट हो जाते हैं।
    5. फ़ॉरवर्ड एरो बटन पर क्लिक करने से फ़िल्टर्स विंडो खुल जाएगी, हिस्टोग्राम को समायोजित करके ट्रैक अवधि थ्रेशोल्ड सेट करें ताकि प्रत्येक सेल को ट्रैक किया जा सके। डबल आगे तीर बटन पर क्लिक करने से स्पॉट डिटेक्शन को अंतिम रूप दिया जाएगा।
    6. ऊतक बहाव को सही करने के लिए, स्पॉट पर क्लिक करें | ट्रैक संपादक और सही बहाव का चयन करें। एक एल्गोरिथ्म विंडो स्वचालित रूप से खुल जाएगी; चुनें अनुवादकारी बहाव, पूरे परिणाम शामिल करें , और सही ऑब्जेक्ट स्थिति
  3. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सुविधाजनक बनाने वाले भूखंड
    नोट: प्रोग्राम का स्कैटरप्लोट बहु-आयामी (एक्स, वाई, जेड, रंग और स्केल) कई ऑब्जेक्ट के साथ रेखांकन उत्पन्न करने के लिए एक उपकरण है। समय के साथ कई सेल आंदोलनों के रुझान देखने के लिए ये भूखंड उपयोगी होते हैं
    1. सेल ट्रैकिंग डेटा के 2 डी या 3 डी भूखंडों का उपयोग करके इसका उपयोग करेंनई सहूलियत प्लॉट मेनू ( चित्रा 3 ई और 3 एफ ) सहूलियत जोड़ें
    2. वॉल्यूम या स्पॉट चुनें और चुनें / श्रेणी और प्लॉट प्रकार चुनें
    3. विभिन्न सुविधाजनक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए प्लॉट मान समायोजित करें।
    4. स्नैपशॉट फ़ंक्शन का प्रयोग करके ग्राफ़ निर्यात करें।
      नोट: सांख्यिकीय आंकड़ों को प्लॉट नंबर एरिया | क्लिक करके आगे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए स्प्रेडशीट के रूप में निर्यात किया जा सकता है सहेजें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

तालू explant संस्कृति का लाइव इमेजिंग कई ऐसे कोशिकीय तालू संलयन 6 मध्यस्थता की प्रक्रिया का पता चला। दो उपकला कोशिकाओं के बीच प्रारंभिक संपर्क झिल्ली protrusions ( चित्रा 2 बी -2 ई ) द्वारा बनाई गई हैं। जब दो उपकला परतें मिलती हैं, वे एक बहु-सेल स्तरित एमईएस बनाते हैं, जिसके बाद एपिथेलियल अभिसरण ( चित्रा 2 ए -2 ए और चित्रा 2 के -2 ओ ) के माध्यम से एक एकीकृत एकल सेल-परत एमईएस बनाने के लिए अंतर होता है। गहरा Z स्तरों में उपकला कोशिकाओं को उत्तरोत्तर अभिसरण प्रक्रिया ( चित्रा 2 के ) में योगदान करने के लिए एमईएस के मौखिक ओर क्रमशः विस्थापित हो जाते हैं। पोस्टर-निर्देशित सेल माइग्रेशन मध्यम तालु एमईएस ( चित्रा 2 एफ -2 जे ) में देखा गया था। इसके अलावा, हम उपकला सेल ext पायातालु संलयन के दौरान भ्रम की घटनाओं का सुझाव है कि एमईएस में उपकला कोशिकाओं को इस सक्रिय प्रक्रिया ( चित्रा 2 क्यू, 2 टी ) द्वारा हटाया जा सकता है। एकीकृत उपकला सीम अंततः मेसेनचिमल सामंजस्य ( चित्रा 2 एस, 2 टी ) प्राप्त करने के लिए टूट जाएगा।

Lifeact-mRFPruby तालू तालू संलयन 6 के दौरान गतिशील actin cytoskeletal rearrangements दिखाया। फिलामेंटस एक्टिन पूर्ववर्ती-पीछे वाला अक्ष ( चित्रा 2 के -2 टी) के साथ एक केबल जैसी संरचना बनाने वाले उपकला और मेसेनचिमल क्षेत्रों के बीच सीमा पर समृद्ध हो गया। Actomyosin सिकुड़ना ड्राइव उपकला अभिसरण और एमईएस टूटना क्योंकि या तो मायोसिन गतिविधि या actin बहुलकीकरण की रासायनिक निषेध इन गतिशील प्रक्रियाओं 6 अवरुद्ध कर दिया।

Hin-page = "1"> सॉफ्टवेयर का उपयोग तालु संलयन के दौरान सेलुलर व्यवहार का पता लगाने के लिए किया गया था। सेल ट्रैकिंग के लिए सबसे अच्छा तरीका रिपोर्टर सिग्नल पर निर्भर करता है। यदि एक परमाणु रिपोर्टर माउस का उपयोग किया जाता है, तो यह प्रोग्राम सेल्युलर केंद्रों 21 के रूप में फ्लोरोसेंट संकेतों के केंद्र का पता लगा सकता है। परमाणु जीएफपी रिपोर्टर माउस जैसे रोसै 26 जीएफपी-एनएलएस- एलएसीजेड ( जीएनजेड) 22 का उपयोग ऊतक-विशिष्ट क्र लाइनों का उपयोग कर उपकला कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जा सकता है; हमारे हाथों में, यह विशिष्ट परमाणु रिपोर्टर लाइव इमेजिंग में इस्तेमाल किए गए लंबे समय के दौरान तेज विरंजन का प्रदर्शन करता है। इसलिए, हमने हमारे अध्ययनों में उपकला कोशिका आंदोलनों का पालन करने के लिए झिल्ली-जीएफपी रिपोर्टर ( आरओएसए 26- एमटीएमजी फ्लोक्स ) का उपयोग किया। झिल्ली संकेत द्वारा व्यक्तिगत कोशिकाओं को पहचानने और उनका पता लगाने के लिए इस विधि की आवश्यकता है। इस समस्या को हल करने के लिए, हमने एक संशोधित सेल ट्रैकिंग विधि ( चित्रा 3 और प्रोटोकॉल अनुभाग 4 ) का उपयोग किया।

सामग्री "के लिए: रख-एक साथ। अंदर-पृष्ठ =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1 : माउस माध्यमिक तालु विच्छेदन के योजनाबद्ध दृश्य। ( ए ) ई 14.5 माउस भ्रूण का साइड व्यू। तालाल अलमारियों को छीलने के लिए, सिर को पहले सफेद बिंदीदार रेखा के साथ काट दिया गया, # 1 ( बी, सी ) ऊपरी मस्तिष्क (दूसरी सफेद रेखा के ऊपर, # 2) को हटा दिया गया था। ( डी, ई ) विच्छेदित सिर के मौखिक दृश्य लोअर मेन्डिबल (# 3) को विच्छेदित किया गया था और जीभ (# 4) निकाल दी गई थी ( एफ ) लाइन # 5 के साथ सिर के पीछे के हिस्से काट दिया गया था। ( जीआई ) दोनों मैक्सिला (# 6, # 7) और ऊपरी जबड़े (# 8) के पूर्वकाल भाग को हटा दिया गया था। ( जेएल ) नासल सेप्टम (# 9) को हटा दिया गया था ( एम ) जीएफपी सिग्नल को एमएस के विच्छेदित तालु में एक के 14 -क्री से; ROSA26 mTmG माउस भ्रूण। ( एन ) लाइव इमेजिंग सेटअप दोस्त के मौखिक पक्षइन्फर्टेड इन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेजेट होने के लिए स्पष्टीकरण खाया गया था। एमईएस सफेद तीर ( एफआई ) के साथ संकेत दिया है इमेजेड क्षेत्र एल और एम में सफेद बिंदीदार बक्से द्वारा इंगित किया गया है। स्केल बार = ए में 2 सेमी, बीआई में 1 सेमी, जेएम में 500 माइक्रोन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : तालु खोज संस्कृतियों का लाइव इमेजिंग। ( एई ) K14-cre से पूर्वकाल माध्यमिक तालु का लाइव इमेजिंग ; ROSA26 mTmG explant (5 सुक्ष्ममापी गहराई)। सफेद ऐरोहेड एक उपकला कोशिका ( एफजे ) से एक झिल्ली फलाव दिखाता है जो के 14 -क्री से मध्यम तालू का लाइव इमेजिंग ; ROSA26 mTmG explant (5 सुक्ष्ममापी घepth)। सफेद तीर पूर्वकाल से पीछे के तालु तक सेल माइग्रेशन की दिशा दर्शाते हैं। ( KO ) लाइफैक्ट-एमआरएफप्रसारिपैंटिक से अन्तर्निर्म तालु का लाइव इमेजिंग (5 माइक्रोन गहराई)। मौखिक सतह और अभिसरण को उपकला कोशिका विस्थापन (पीला तीर) मध्यलाइन में केबल जैसी एक्टिन संरचनाओं के साथ एकीकृत एमईएस बनाने के लिए। ( पीटी ) Lifeact-mRFPruby explant (25 μm गहराई) से पूर्वकाल तालू के लाइव इमेजिंग। लाल तीर एक सेल एक्सट्रूज़न इवेंट ( क्यू, टी ) इंगित करता है। सीवन के भविष्य के टूटने के अंक एस और टी में दो ऊर्ध्वाधर सफेद तीरों से इंगित किए जाते हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। इस आंकड़े में सभी लाइव इमेजिंग डेटा पहले 6 में प्रकाशित किए गए प्रयोगों से प्राप्त किए गए हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

-page = "1"> चित्र तीन
चित्रा 3 : डेटा विश्लेषण ( एडी ) K14-cre से झिल्ली जीएफपी संकेतों के साथ उपकला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ; ROSA26 mTmG तालू explant (ए), एक सतह झिल्ली GFP संकेत (बी) की मात्रा प्रतिपादन द्वारा उत्पन्न किया गया था। निर्मित सतह ( सी ) मास्किंग के बाद इनवर्टेड छवियां उत्पन्न हुईं इमरिस ( डी ) में स्पॉट्स डिटेक्शन फ़ंक्शन का इस्तेमाल करते हुए इन्वर्टेड इमेज से सेलुलर सेंटर की पहचान की गई। ( ई ) 3D पुनर्निर्माण कई दिशाओं में ट्रैकिंग सेल आंदोलनों की अनुमति देते हैं। ए: पूर्वकाल, पी: पोस्टर, एन: नासल, ओ: मौखिक ( एफ ) 2 डी विश्लेषण पूर्वोत्तर से पलायन करने वाली कोशिकाओं को दिखाती है कि बीच के तालू एमईएस में पीछे की तरफ स्थानांतरित होने वाली कोशिकाओं को दिखाया गया है। स्केल बार = 20 माइक्रोन ईडी में, ईएफ में 10 माइक्रोन।S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो चित्रा 1
वीडियो चित्रा 1: K14-cre के लाइव इमेजिंग ; रोसै 26- एमटीएमजी फ़्लोक्स पूर्वकाल तालु (5 माइक्रोन गहराई)। छवियों को प्रत्येक 10 मिनट (10 मिनट / फ्रेम) 16 घंटे 20 मिनट, स्केल बार = 25 माइक्रोन के लिए कब्जा कर लिया गया था। इस वीडियो में पहले संदर्भ 6 में प्रकाशित एक फिल्म का एक अलग जेड स्थिति है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो चित्रा 2
वीडियो चित्रा 2: K14-cre के लाइव इमेजिंग ; रोसै 26- एमटीएमजी फ्लोक्स मध्यम तालु (5 माइक्रोन गहराई)। छवियों को हर 15 मिनट (15 मिनट / फ्रेम) 13 घंटे 30 मिनट, स्केल बार = 25 माइक्रोन के लिए कब्जा कर लिया गया था। इस वीडियो को पहले 6 संदर्भ में प्रकाशित किया गया है कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो चित्रा 3
वीडियो 3 चित्रा: लाइफटेक्ट एमआरएफप्रब्रमी एंटेरियर तालु (5 माइक्रोन गहराई) के लाइव इमेजिंग
छवियाँ हर 10 मिनट (10 मिनट / फ्रेम) के लिए 7 घंटे 50 मिनट के लिए ली गईं स्केल बार = 20 माइक्रोन इस वीडियो को पहले 6 संदर्भ में प्रकाशित किया गया है कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

टी "के लिए: रख-एक साथ। अंदर-पेज =" 1 "> वीडियो चित्रा 4
वीडियो चित्रा 4: लाइफटेक्ट-एमआरएफपीआरबीआई एंटेरियर टलेट (25 माइक्रोन गहराई) के लाइव इमेजिंग
छवियाँ हर 10 मिनट (10 मिनट / फ्रेम) के लिए 7 घंटे 50 मिनट के लिए ली गईं स्केल बार = 20 माइक्रोन इस वीडियो में पहले संदर्भ 6 में प्रकाशित एक फिल्म का एक अलग जेड स्थिति है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3 डी अंग की खोज संस्कृति के साथ टिशू मोर्फोजेनेसिस के लाइव इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकती हैं जो निश्चित ऊतक वर्गों के पारंपरिक धुंधला विश्लेषण में नहीं दिखाया जा सकता है। माउस भ्रूणीय माध्यमिक तालु की इन विट्रो स्पष्टीकरण संस्कृति का प्रयोग करते हुए, हमने कई दिलचस्प सेलुलर व्यवहारों को देखा जो हमें तालु संलयन के एक उपन्यास तंत्र का प्रस्ताव देने के लिए प्रेरित करता है जिसमें उपकला अभिसरण और सेल एक्सट्रूज़न शामिल होता है।

इस प्रकार के अध्ययन में एक आम चुनौती एक लंबे समय-समय पर निरंतर लेजर उत्तेजनाओं से फोटोबलीइंग है। हमारे अध्ययन में, एक सफेद प्रकाश confocal और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया गया। समय के साथ संकेत तीव्रता में कुछ कमी इमेजिंग सॉफ्टवेयर (एलएएस-एएफ) (प्रोटोकॉल 4.1) में विरंजन सुधार से ठीक हो सकती है। क्योंकि विरंजन सुधार सीमित है, प्रत्येक इमेजिंग सिस्टम में लेजर शक्ति और एक्सपोज़र समय को ध्यान से अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। हमने भी जांच की3 दिनों की संस्कृति 6 के बाद लाइव इमेजिंग मीडिया में आम तौर पर तालु संलयन होता है।

लाइव इमेजिंग में एक दूसरा आम मुद्दा ऊतक बहाव है लाइव इमेजिंग के दौरान सुसंगत छवियां प्राप्त करने के लिए बहाव को कम करना महत्वपूर्ण है क्योंकि फोकल प्लेन में परिवर्तन समय के साथ morphogenetic परिवर्तनों की समझ को उलझन में डाल सकता है। जबकि थर्मल बहाव को नियंत्रित करने के लिए कई confocal सूक्ष्मदर्शी (खुर्दबीन में निश्चित ध्यान) में हासिल किया जा सकता है, ग्लास के नीचे के ऊतकों के प्रवाह के इन तरीकों से ठीक नहीं किया जा सकता है। Agarose का उपयोग करने के साथ ही ग्लास नीचे के खिलाफ स्पष्टीकरण देने से यह कम करने में मदद मिलती है, लेकिन ध्यान केवल उन फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए लिया जाना चाहिए जो अपेक्षाकृत स्थिर स्थिति बनाए रखते हैं। यह निर्धारित किया जा सकता है कि समय-समय पर इमेजिंग फ़ील्ड में कई नियंत्रण बिंदुओं का अनुसरण करके निर्धारित किया जा सकता है कि क्या वे स्थिर रहते हैं, समान प्रवृत्ति से आगे बढ़ें या अलग तरीके से स्थानांतरित करें। कुछ हद तक, पोस्ट प्रसंस्करण फू का उपयोग करNctions लाइव इमेजिंग (प्रोटोकॉल 4.2) में कुछ ऊतक बहाव के सुधार की अनुमति देते हैं।

स्पष्टीकरण के ऊतकों को स्थिर करने के लिए लाइव इमेजिंग मीडिया में 0.6% की अंतिम एकाग्रता में कम पिघलने वाले agarose का उपयोग किया गया था। जब हम agarose के उच्च सांद्रता का परीक्षण किया, तो वे यांत्रिक बाधा के कारण संभवतः टिशू मोर्फोजेनेसिस को खराब करने के लिए दिखाई देते थे। इसलिए मोर्चेोजेनेसिस परेशान नहीं करते हुए ऊतक बहाव को कम करने के लिए सही agarose एकाग्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

Confocal इमेजिंग गहराई के कारण, इस विधि तालु संलयन के बहुत गहरे जेड प्लानों की जांच में सीमाएं डालती है। 100 मील की गहराई से संकेत, सफेद प्रकाश और कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी दोनों का उपयोग सफलतापूर्वक imaged किया जा सकता है, हालांकि छवि को इस सीमा से परे सुस्त और बेहोश हो जाना शुरू किया। क्योंकि तालु संलयन एक प्रगतिशील प्रक्रिया है जो योनोनल और एंटेरोस्टोस्टेरियर कुल्हाड़ियों में है, हम प्रस्ताव देते हैं कि इमेजिंग कई पदों को प्रभावी ढंग से विभिन्न विभागों के इमेजिंग की अनुमति मिलती हैतालु संलयन के एचएस, लेकिन इमेजिंग की गहराई में सुधार करने के लिए भविष्य में दो फोटान या हल्के शीट confocal माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे प्रयोगों में से अधिकांश, तालू एक्सपेंट्स का मौखिक पक्ष चित्रित किया गया था। तालू स्पष्टीकरण के नाक पक्ष की इमेजिंग मुश्किल है क्योंकि नाक का सेप्टम जुड़ा हुआ है या माध्यमिक तालाल अलमारियों के करीब है। नाक की ओर से छवि संलयन के हमारे प्रयासों में, अतिरिक्त नाक ऊतक को निकालने के लिए भी आवश्यक था, जिससे वह तालु उपकला से संकेत में हस्तक्षेप न करें। हालांकि संभव है, तालू स्पष्टीकरण के नाक पक्ष को इमेजिंग करना मुश्किल था क्योंकि नाक पट्टिका के विच्छेदन को अक्सर तालू स्पष्टीकरण को नुकसान पहुंचा था।

रिपोर्टर माउस टिश्यू एक्सप्टान्ट का लाइव इमेजिंग भ्रूण के विकास के दौरान टिशू मोर्फोजेनेसिस के सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। Confocal माइक्रोस्कोपी तकनीकों और मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग करना, बुनियादी विकास प्रक्रियाओं जैसे कि माध्यमिक तालु संलयन हो सकता हैसेलुलर स्तर पर जांच की।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम माध्यमिक तालु इमेजिंग के बारे में प्रारंभिक बातचीत के लिए एम। डगलस बेन्सन का धन्यवाद करते हैं। हम confocal माइक्रोस्कोपी में इमेजिंग शर्तों को समायोजित करने के लिए उनकी सहायता के लिए डेविड कास्टैनेडा-कास्टेलानोस (लेइका) और क्रिस रिएक्सन (ज़ीज़) को भी स्वीकार करते हैं। Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए उपयोगी सुझावों के लिए हम लिन्सी हैमिल्टन (बिप्लेन) की सराहना करते हैं। यह काम एनआईएच / एनआईडीसीआर आर 001 डी 0 25887 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 Life technology 11330-032
Fetal Bovine Serum Life technology 16000-044
L-glutamine Life technology 25030-081
L-Ascorbic acid Sigma A4544-100G
Pennicillin/Streptomycin Life technology 15140-122
Low melting agarose BioExpress E-3111-125
35 mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Petrolieum Jelly (Vaseline) Sigma 16415-1Kg
Mice
Keratin14-cre MGI: J:65294 Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmG MGI: J:124702 Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPruby MGI: J:164274 Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 confocal microscope Leica Microsystems
Cell Observer spinning disk confocal microscope Zeiss Microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
  2. Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
  3. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
  4. Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
  5. Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
  6. Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
  7. Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
  8. Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
  9. Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
  10. Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
  11. Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
  12. Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
  13. Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
  14. Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  15. Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
  16. Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
  17. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
  18. Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
  19. Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
  20. Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
  21. Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
  22. Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 125 लाइव इमेजिंग माध्यमिक तालु ऊतक संलयन फांक क्रैनीफेशियल
माउस द्वितीयक ताललेट फ्यूजन की लाइव इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Prochazka, J., Bush, J. O.… More

Kim, S., Prochazka, J., Bush, J. O. Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion. J. Vis. Exp. (125), e56041, doi:10.3791/56041 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter