Summary
Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.
Abstract
A codificação da informação biológica que é acessível para as futuras gerações geralmente é conseguida através de alterações na sequência do DNA. Vida longa herança codificada em proteína conformação (ao invés de sequência) tem sido vista como mudança de paradigma mas raro. Os melhores exemplos caracterizados de tais elementos epigenéticos são príons, que possuem um comportamento de auto-montagem que pode conduzir a manifestação hereditária de novos fenótipos. Muitos príons arquetípicos exibir um marcante viés de sequência N/Q-rico e montam em uma dobra de amiloide. Estas características incomuns informaram a maioria dos esforços de rastreio para identificar novas proteínas príon. No entanto, pelo menos três priões conhecidos (incluindo o fundador prião, PrPSc) não abriga estas características bioquímicas. Portanto, desenvolvemos um método alternativo para sondar o âmbito da herança à base de proteínas com base em uma propriedade de ação das massas: o transiente superexpressão de proteínas príon aumenta a frequência em que eles adquirem uma conformação de automodelagem. Este documento descreve um método para analisar a capacidade da levedura ORFeome eliciar herança à base de proteínas. Usando essa estratégia, encontramos anteriormente que > 1% de proteínas de levedura poderia abastecer o surgimento de traços biológicos que eram long-lived, estável e levantou-se mais frequentemente do que a mutação genética. Esta abordagem pode ser empregada em alto throughput em toda ORFeomes ou como um paradigma de rastreio direcionados para redes genéticas específicas ou estímulos ambientais. Assim como o avançada genéticas telas definem inúmeras vias de sinalização e de desenvolvimento, essas técnicas fornecem uma metodologia para investigar a influência da herança à base de proteínas em processos biológicos.
Introduction
Sistemas biológicos frequentemente experimentam flutuações transientes em abundância de proteína. Se estes têm um impacto duradouro na formação do fenótipo de um organismo ou das futuras gerações permanece obscuro. As instâncias mais conhecidas desta biologia envolvem uma rara classe de proteínas, príons, que dirige o surgimento de traços hereditários sem modificação do genoma. Em vez disso, essas partículas de fectious teinaceous e em protransmitem fenótipos através de alterações auto-perpetuar a proteína conformação1,2. Este tipo de herança foi descoberto a causa dos padrões de herança incomum de uma doença neurodegenerativa devastadora. No entanto, estudos em organismos variando de fungos para mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 desde então têm revelado que elementos de prião podem conferir valor adaptativo. Não obstante, os príons têm sido vistos como um fascinante mas rara esquisitice biológica.
Esta sabedoria prevalecente é realizada em parte porque a caracterização de herança baseada em proteína longa foi restringida por um pequeno conjunto de exemplos. Esforços recentes de rastreio sistemático tem alargado esta imagem significativamente identificando vários novo bona fide priões11 e quase duas dúzias de proteína domínios12 com a capacidade de conversão conformacional de príon-como combustível. No entanto, porque essas abordagens têm geralmente focada em preconceitos de sequência de aminoácido forte, os príons que foram descobertos compartilham as propriedades bioquímicas dos fundadores fermento priões [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Estes incluem: 1) modulares domínios que são ricas em tempo poliméricos trechos da asparagina (N) e glutamina (Q), 2) montagem em um amiloide [PRIÃO+] conformação17,18,19e 3) completa dependência de disaggregase Hsp104 função de propagação fiel de mãe para filha13,20,21. De fato, muitos bona fide príons, incluindo [GAR+], [Het-s] e mesmo o original do prião (PrPSc), iria ser desperdiçada sob tais critérios rigorosos. Talvez mais importante, eles seria incapazes de capturar qualquer romance, mecanismos de herança baseada em proteína22. Assim, a verdadeira amplitude biológica de tais fenômenos pode ser muito mais comum na natureza do que anteriormente se supunha.
Para investigar esta questão, utilizou-se uma estratégia de alta produtividade, proteoma-largo. Uma marca registrada de todos os príons, incluindo PrPSc, [GAR+], e [Het-s], é que a superexpressão transitória das proteínas causais fortemente aumenta a taxa de prião aquisição15,23,24,25,26. Tiramos vantagem desse recurso que sistematicamente perguntar, em toda a levedura ORFeome, se Estados estáveis à base de proteínas, epigenéticos podem ser iniciados, transitoriamente, induzindo a superexpressão de proteínas individuais. É sabido que superexpressão da proteína pode alterar fenótipos27. No entanto, proteínas príon são incomuns porque sua superprodução temporária produz uma mudança no fenótipo é hereditária para muitas centenas de gerações após a superexpressão inicial. Anteriormente, tiramos proveito desse recurso, bem como os padrões de herança incomum de elementos genéticos à base de proteínas, identificar dezenas de proteínas que são capazes de hereditariedade religação fenotípicas paisagens sem alterar o genoma de28. Embora algumas identificadas proteínas anteriormente eram conhecidos como priões, a maioria eram não, ressaltando o poder desta abordagem para descobrir novas formas de herança à base de proteínas.
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Discussion
Os primeiros príons de levedura foram identificados por seus fenótipos incomuns e complexos padrões de herança. As características dos priões foram então usadas para construir algoritmos e ferramentas computacionais para triagem de proteínas príon adicionais. O método descrito aqui, em contraste, é experimental e baseia-se na transitória superexpressão para criar uma duradoura mudança-a estável estado-codificado na conformação da proteína. No entanto, se a eficiência de "semeadura" montagem do prião pela superexpressão para qualquer proteína dada é muito baixa, essa proteína continuamente irá emergir como um falso negativo em telas de superexpressão desse tipo. Uma tal alteração para corrigir isso seria usar um plasmídeo de 2 mícron para superexpressão da proteína no futuro experimentos. Finalmente, cada prião induzida tem seu próprio conjunto único de fenótipos de crescimento e será não ser apreciado em cada condição analisada. Assim, o número de condições diferentes e doses testadas limita o número de acertos.
Importante, nem todos os tipos de herança baseada em proteína serão igualmente recuperados usando esse método. Proteínas que não podem ser eficientemente overexpressed ou sem toxicidade serão obviamente continuamente perdidas. Elementos mitotically instáveis, tais como "mnemons," nunca se propagará para filhas a superexpressão inicial22a seguir. Em contraste, outros tipos de interruptores de long-lived biestável teoricamente poderiam ser induzidos através de transiente superexpressão42,43. No entanto, estes Estados geralmente não são dependentes de maquinaria homeostática de proteína ou transmissíveis através de proteínas "semeado". Além disso, príons que dependem de outros acompanhantes (fora da Hsp70 e Hsp104) ou braços adicionais da rede para a propagação de homeostase proteína falharia os ensaios de acompanhante-dependência descritos aqui. Finalmente, um proteínas de baixa abundância que também formam amiloide podem ter taxas de infecciosidade abaixo do limite de detecção na configuração de transformação da proteína.
Este protocolo descreve uma técnica para induzir à base de proteínas epigenéticos Estados estáveis via superexpressão da proteína, bem como mais a jusante passos para validar se cada induzida estado epigenético é um prião de bona fide . O exemplo apresentado neste artigo, Psp1, é um exemplo de uma proteína que exibe um viés "príon-como" aminoácido e teoricamente poderia ser recuperado usando anteriormente desenvolvidos algoritmos de bioinformatic. No entanto, a incapacidade de Psp1 para formar amiloide e sua dependência de acompanhante incomum (Hsp104) iria ter rapidamente desclassificado é de mais análises e assim o eliminou da consideração do prião. No entanto, as técnicas de triagem apresentadas neste trabalho são agnósticas para essas suposições e em vez disso, focar os padrões subjacentes da herança e a suficiência da proteína sozinha para transmitir os fenótipos correspondentes. Com efeito, a grande maioria de herança à base de proteínas recuperada com este método era desprovido de viés de sequência N/Q-rico.
Este método foi usado para sondar o fermento inteiro ORFeome por sua capacidade de eliciar a herança à base de proteínas de forma imparcial, usando apenas um pequeno número de estressores (cloreto de cádmio de 25 mM 1 mM de cloreto de cobalto, sulfato de cobre de 2mm, 1 mM diamido, fluconazol 0,2 mM, 50mm hidroxiureia, cloreto de manganês de 20 mM, o paraquat 0,75 mM, 50mm radicicol, 80 J/m2 irradiação UV e sulfato de zinco de 10 mM). No entanto, esta abordagem poderia facilmente ser modificada para redes genéticas de tela ou respostas celulares específicas de forma mais direccionada. Por exemplo, proteínas funcionalmente relacionadas ou todas as proteínas reguladas em uma rede de sinalização discreta poderia ser induzida através de superexpressão transitória e projectada com estressores relacionados com sua função biológica. Em contraste, um conjunto maior de proteínas poderia ser rastreado com um conjunto mais abrangente de estressores para investigar se respostas celulares específicas naturalmente evoluíram para abrigar interruptores de prião. Finalmente, embora temos realizado estes estudos em fermento, muitos aspectos das experiências (por exemplo, a expressão de proteínas transitória, acompanhante "cura", etc.) pode ser generalizada para outros sistemas de modelo no futuro. Por exemplo, cultura de tecidos de mamíferos é passível de superexpressão através de sistemas baseados no plasmídeo, e focos de fluorescência podem ser também ser usado como uma leitura para hereditários auto-montagem, como descrito anteriormente28. Além disso, sequências codificantes de proteínas de outros organismos poderiam ser expressos em levedura e testadas pela sua capacidade de eliciar príon como herança usando os métodos descritos aqui.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sohini Chakrabortee, de Sandra Jones, de David Garcia, de Bhupinder Bhullar, de Amelia Chang, de Richard She e de Susan Lindquist por sua assistência no desenvolvimento de ensaios utilizados no presente livro, bem como os revisores para seus comentários pensativos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
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