Summary
Этот протокол описывает высок объём методологию функционально экран для наследования на основе белков в S. cerevisiae.
Abstract
Кодирование биологической информации, доступной для будущих поколений обычно достигается через изменения в последовательности ДНК. Долгоживущих наследования, закодированные в конформации белка (а не последовательность) долго рассматривалась как сдвиг парадигмы, но редко. Лучше всего характеризуется примеры таких эпигеномные элементов являются прионы, которые обладают самостоятельной сборки поведение, которое может управлять наследуемое проявление новых фенотипов. Многие архетипической прионов отображения ярких предвзятости последовательности N/Q-богатые и собрать в амилоида лоно. Эти необычные свойства сообщили большинство скрининг усилия по выявлению новых прионных белков. Однако по крайней мере три известных прионы, (в том числе основателей прионы, ОТРSc) не гавань этих биохимических характеристик. Поэтому мы разработали альтернативный метод прозондирует область на основе белков наследования на основе свойства массовых действий: переходных гиперэкспрессия прионных белков увеличивает частоту, на которой они приобретают конформации self шаблонов. Этот документ описывает метод для анализа дрожжей ORFeome способность добиться на основе белков наследования. Используя эту стратегию, мы ранее обнаружил, что > 1% белков, дрожжи могут топлива появление биологических черт, которые были долгоживущих, стабильной и возникают чаще, чем генетической мутации. Этот подход может быть использован в высокой пропускной способности через весь ORFeomes или как целенаправленного скрининга парадигмы для конкретных генетических сетей или экологических раздражителей. Так же, как вперед генетических экраны определяют многочисленные пути развития и сигнализации, эти методы обеспечивают методологию для исследовать влияние наследования на основе белков в биологических процессах.
Introduction
Биологические системы часто испытывают временные колебания в изобилии белка. Ли они имеют долговременное воздействие на формирование фенотип организма или будущих поколений остается неясным. Известных экземпляров этой биологии включать редкие класса белков, прионы, подталкивающих появление наследственные черты без модификации генома. Вместо этого эти проteinaceous и вобструктиным частицы передают фенотипов через самоподдерживающиеся изменения конформации белка1,2. Этот тип наследования был обнаружен в качестве причины необычной наследования шаблонов разрушительные нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования в организмах, начиная от грибов до млекопитающих3,4,5,6,,78,9,10 с тех пор показали, что китовая птичка как элементы могут иметь значение adaptive. Тем не менее прионы были осмотрены как увлекательная, но редких биологических странность.
Этот сложившейся мудрость проводится в части потому что характеристика на основе белков наследования давно были ограничены небольшим набором примеров. Недавние усилия систематического отбора значительно расширили эту картину путем выявления несколько новых bona fide прионов11 и белка почти двух десятков доменов12 мощностью до конформационные конверсии топлива китовая птичка как. Однако потому что эти подходы как правило сосредоточены на сильных аминокислот последовательности предубеждения, прионы, которые были обнаружены поделиться биохимические свойства основателей дрожжи прионов [PSI+]13,14,15[URE3] и [RNQ+]11,16. К ним относятся: 1) Модульная домены, которые богаты длинные полимерные тянется аспарагин (N) и (Q), глютамин 2) Ассамблея в амилоида [китовая птичка+] конформации17,18,19и 3) завершить зависимость disaggregase функции Hsp104 для верных распространения от матери к дочери13,,2021. Действительно, многие bona fide прионы, включая [Гар+], [Het-s] и даже оригинальные китовая птичка (ScPrP), будет не хватать под такие строгие критерии. Возможно более важно, они будут не в состоянии захватить любых новых механизмов на основе белков наследования22. Таким образом истинный биологических ширина таких явлений может быть гораздо более общий характер, чем предполагалось ранее.
Расследовать этот вопрос, было занято высокой пропускной способностью, протеома общесистемной стратегии. Отличительной чертой всех прионы, включая PrPSc, [Гар+], и [Het-s], что переходные гиперэкспрессия причинной белков сильно увеличивает скорость прионных приобретение15,23,24,25,26. Мы воспользовались эта возможность систематически во всем дрожжей ORFeome, спросить, если стабильной основе белка, эпигенетических государств мог бы быть инициирован временно вызывая гиперэкспрессия индивидуальных белков. Это хорошо известно, что гиперэкспрессия белка может изменить фенотипов27. Однако прионных белков являются необычными, потому что их временные перепроизводства производит изменение фенотипа, что наследственные многие сотни поколений после первоначального гиперэкспрессия. Мы ранее принял преимущество этой функции, а также необычные наследования шаблонов на основе белков генетические элементы, чтобы определить десятки белков, которые способны heritably повторной проводки фенотипические пейзажи без изменения генома28. Хотя некоторые выявленные белков ранее были известны как прионы, большинство не было, подчеркнув сила этого подхода для выявления новых форм на основе белков наследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первый прионов дрожжи были определены их необычные фенотипы и запутанной модели наследования. Характеристики этих прионы, затем были использованы для построения алгоритмов и вычислительных средств экран для дополнительных прионных белков. Метод, описанный здесь, напротив, экспериментальной и опирается на переходных гиперэкспрессия для создания прочного изменения в стабильное государство закодированные в конформации белка. Однако если эффективность «посева» прионных Ассамблеи по гиперэкспрессии для любого данного белка очень низка, что белок постоянно будет выступать как ложный отрицательный в гиперэкспрессия экраны данного типа. Один из таких изменений, чтобы исправить это бы использовать 2 микрона плазмида гиперэкспрессия белка в будущем экспериментов. Наконец каждый индуцированных китовая птичка имеет свой собственный уникальный набор роста фенотипы и будет не быть очевидным в каждом состоянии assayed. Таким образом количество различных условий и дозы испытания ограничивает количество хитов.
Важно отметить, что не все типы на основе белков наследования будет столь же восстановлен с помощью этого метода. Белки, которые не могут быть эффективно оверэкспрессировали или без токсичности будет очевидно постоянно не хватать. Mitotically нестабильные элементы, такие как «mnemons,» никогда не распространит к дочери после первоначального гиперэкспрессия22. В отличие от других видов долгоживущих бистабильные переключатели теоретически могут быть вызваны через переходные гиперэкспрессия42,43. Однако эти государства обычно являются не зависимыми от белка гомеостатических механизмов или передаваемых через «посеяны» белки. Кроме того прионы, которые полагаются на других сопровождающих (за пределами Hsp70 и Hsp104) или дополнительные оружия белка гомеостаза сети для распространения не будет сопровождающий зависимость анализов, описанных здесь. Наконец низкая численность белки, которые также образуют амилоид могут иметь инфективности ставки ниже предела обнаружения в установки преобразования белков.
Этот протокол описывает метод для вызывая стабильной основе белка эпигеномные государств через гиперэкспрессия белка, а также далее вниз по течению шаги для проверки ли каждый индуцированной эпигеномные государства является bona fide китовая птичка. Пример, представленный в настоящем документе, Psp1, является пример белок, который отображает «китовая птичка как» аминокислоты уклоном и теоретически могут быть восстановлены с помощью ранее разработанных bioinformatic алгоритмов. Однако неспособность Psp1 сформировать амилоид и ее зависимость от необычных сопровождающий (Hsp104) быстро лишались его от дальнейшего анализа и таким образом исключить из рассмотрения китовая птичка. Однако методы скрининга, представленные в настоящем документе агностиком эти предположения и вместо этого сосредоточиться на базовой модели наследования и достаточности белка только передать соответствующие фенотипов. Действительно подавляющее большинство белка на основе наследования, восстановленные с помощью этого метода был лишен предвзятости последовательности N/Q-богатые люди.
Этот метод был использован для проверки всей дрожжи ORFeome за его способность добиться на основе белков наследования в беспристрастной моды, используя только небольшое количество стрессоров (Кадмий хлористый 25 мм, 1 мм кобальта хлорида, сульфат меди 2 мм, 1 мм diamide, флуконазол 0,2 мм, 50 мм гидроксимочевина, хлорид марганца 20 мм, параквата 0,75 мм, 50 мм radicicol, 80 J/m2 УФ облучения и сульфат цинка 10 мм). Однако этот подход легко быть изменен экран генетических сетей или конкретных клеточных реакций в более целенаправленным образом. Для например, функционально связанных белков или всех белков регулируются в дискретных сигналов сети может индуцированной через переходные гиперэкспрессия и экранированный с стресса, связанных с их биологической функции. В отличие от этого больший набор белков может проверяться с более полным набором стрессоров расследовать ли конкретные клеточных реакций естественно эволюционировали, чтобы гавани прионных переключателей. Наконец, хотя мы провели эти исследования в дрожжи, многие аспекты экспериментов (например, переходные белков, сопровождающий «лечить», и т.д.) может быть обобщена на другие модели систем в будущем. Например, млекопитающих Культура ткани поддается гиперэкспрессия через плазмиды-систем, и флуоресценции очагов могут быть также использоваться как индикация для наследуемого самостоятельной сборки, как описано ранее,28. Кроме того можно было выражено в дрожжей и проверены на их способность добиться китовая птичка как наследование с помощью методов, описанных здесь последовательности кодирвоания протеина от других живых организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Sohini Chakrabortee, Сандра Джонс, Дэвид Гарсия, Bhupinder Bhullar, Амелия Chang, Ричард она и Сьюзен Линдквист за их помощь в разработке анализов, используемые в этом документе, а также рецензентов для их вдумчивые комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
