Summary
Det här protokollet beskriver en hög genomströmning metod att funktionellt skärmen för protein-baserade arv i S. cerevisiae.
Abstract
Kodning av biologisk information som är tillgänglig för framtida generationer uppnås generellt via förändringar i DNA-sekvensen. Långlivat arv kodade i protein konformation (snarare än sekvens) har länge setts som paradigm-shifting men sällsynt. De bästa kännetecknas exemplen på sådana epigenetiska faktorer är prioner, som äger en egen montering beteende som kan driva den ärftliga manifestationen av nya fenotyper. Många arketypiska prioner Visa en slående N/Q-rika sekvens bias och montera in en amyloid fållan. Dessa ovanliga funktioner har informerat de flesta screening ansträngningar att identifiera nya prion proteiner. Minst tre kända prioner (inklusive grundande prioner, PrPSc) dock inte hysa dessa biokemiska egenskaper. Vi har därför utvecklat en alternativ metod för att undersöka omfattningen av proteinbaserade arv baserat på en egenskap av massa åtgärder: den övergående överuttryck av prion proteiner ökar frekvensen vid vilken de förvärvar en self-mallhantering konformation. Detta dokument beskriver en metod för att analysera jästen ORFeome förmåga att framkalla proteinbaserade arv. Använda denna strategi, fann vi tidigare att > 1% jäst proteiner kunde bränsle uppkomsten av biologiska egenskaper som var långlivat, stabil, och uppstod oftare än genetisk mutation. Detta tillvägagångssätt kan vara anställd i hög genomströmning över hela ORFeomes eller som en riktad screening paradigm för specifika genetiska nätverk eller stimuli från omgivningen. Precis som framåt genetiska skärmar definiera många utvecklings- och signalering vägar, ger dessa tekniker en metod för att undersöka påverkan av proteinbaserade arv i biologiska processer.
Introduction
Biologiska system upplever ofta övergående fluktuationer i protein överflöd. Det är fortfarande oklart huruvida dessa har en bestående inverkan forma fenotypen av en organism eller framtida generationer. De mest kända förekomsterna av detta biologi innebär en sällsynt klass av proteiner, prioner, som driver framväxten av ärftliga egenskaper utan genomet modifiering. I stället överföra dessa proteinaceous och isjukdomar partiklar fenotyper via självförstärkande ändringar till protein konformation1,2. Denna typ av arv upptäcktes som orsaken till de ovanliga nedärvningsmönster av en förödande neurodegenerativ sjukdom. Studier i organismer som sträcker sig från svampar till däggdjur3,4,5,6,7,8,9,10 har sedan visade emellertid att prion-liknande element kan ge adaptiva värde. Prioner har dock setts som en fascinerande men sällsynt biologiska oddity.
Detta rådande visdom hålls delvis eftersom karakterisering av proteinbaserade arv har länge begränsats av ett litet antal exempel. Senaste systematisk screening ansträngningar har breddat bilden betydligt genom att identifiera flera nya bona fide prioner11 och nästan två dussin protein domäner12 med kapacitet att bränsle prion-liknande konfirmerande konvertering. Men eftersom dessa metoder har allmänhet fokuserade på stark amino syra ordnar fördomar, dela prionerna som har identifierats biokemiska egenskaperna för den grundande jäst prioner [PSI+]13,14, [URE3]15och [RNQ+]11,16. Dessa inkluderar: (1) modulära domäner som är rika på långa polymera sträckor av asparagin (N) och glutamin (Q), (2) församlingen in i en amyloid [PRION+] konformation17,18,19, och 3) fullständig tillit till disaggregase Hsp104 funktion för trogna förökning från mor till dotter13,20,21. Faktiskt, många bona fide prioner, inklusive [GAR+], [Het-s], och även den ursprungliga prionen (PrPSc), skulle missas under sådana stränga kriterier. Kanske ännu viktigare, skulle de kunna fånga några nya mekanismer av proteinbaserade arv22. Sanna biologiska vidden av sådana fenomen kan således vara betydligt vanligare i naturen än man tidigare antagit.
För att undersöka denna fråga, var en hög genomströmning, proteomet-omfattande strategi anställd. Ett kännetecken för alla prioner, inklusive PrPSc, [GAR+], och [Het-s], är att de övergående överuttryck av kausala proteinerna starkt ökar graden av prion förvärv15,23,24,25,26. Vi drog fördel av denna funktion att systematiskt fråga, i hela jäst ORFeome, om stabil protein-baserade, epigenetiska stater kan inledas av övergående förmå överuttryck av enskilda proteiner. Det är välkänt att protein överuttryck kan förändra fenotyper27. Prion proteiner är dock ovanligt eftersom deras tillfällig överproduktion ger en förändring i fenotyp som är ärftligt för många hundratals generationer efter den inledande överuttryck. Tidigare tog vi fördel av denna funktion, liksom de ovanliga nedärvningsmönster proteinbaserade genetiska element, för att identifiera dussintals proteiner som klarar av heritably nytt kablage fenotypiska landskap utan att ändra i genomet28. Även om några identifierade var proteiner tidigare känt som prioner, de flesta var inte, betonar kraften i denna strategi att avslöja nya former av protein-baserade arv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De första jäst prionerna identifierades genom sin ovanliga fenotyper och förbryllande mönster av arv. Det som kännetecknen dessa prioner användes sedan för att bygga algoritmer och beräkningsverktyg till skärmen för ytterligare prion proteiner. Den metod som beskrivs här, däremot är experimentell och bygger på övergående överuttryck att skapa en varaktig förändring-en stabil stat-kodade i protein konformation. Dock om effektivitet ”sådd” prion montering av överuttryck för något visst protein är mycket låg, det proteinet kommer att ständigt dyka upp som en falsk negativ i överuttryck skärmar av denna typ. En sådan ändring att korrigera detta skulle vara att använda en 2-micron plasmid för protein överuttryck i framtiden experiment. Slutligen varje inducerad prion har sin egen unika uppsättning av tillväxt fenotyper och kommer inte uppenbar i varje skick analyseras. Således begränsar antalet olika villkor och testade doser antalet träffar.
Viktigast av allt, återställs inte alla typer av protein-baserade arv lika med denna metod. Proteiner som inte kan vara ökad utsträckning effektivt eller utan toxicitet kommer uppenbarligen att ständigt missas. Mitotiskt instabila ämnen som ”mnemons”, skulle aldrig sprids till döttrar efter den inledande överuttryck22. Däremot kan andra typer av långlivade bistabila växlar teoretiskt induceras via övergående överuttryck42,43. Dessa stater är dock normalt inte beroende av protein homeostatiska maskiner eller överföras via ”seedade” proteiner. Dessutom skulle prioner som förlitar sig på andra chaperones (utanför Hsp70 och Hsp104) eller ytterligare armar protein homeostas nätverket för förökning misslyckas förkläde-dependency analyserna beskrivs här. Slutligen, en låg överflöd proteiner som också bilda amyloid kanske smittsamhet räntesatser under detektionsgränsen i protein omvandling setup.
Det här protokollet beskriver en teknik för inducerande stabil proteinbaserade epigenetiska stater via protein överuttryck, liksom ytterligare nedströms steg att verifiera om varje inducerad epigenetiska tillstånd är en bona fide prion. De exempel som presenteras i detta papper, Psp1, är ett exempel på ett protein som visar en ”prion-liknande” aminosyra bias och teoretiskt kunde återställas med hjälp av tidigare utvecklade bioinformatiska algoritmer. Dock Psp1 oförmåga att bilda amyloid och dess ovanliga förkläde beroende (Hsp104) skulle snabbt ha diskvalificerat den från ytterligare analyser och således eliminerade från prion övervägande. Men de screening tekniker presenteras i denna uppsats är agnostiker till dessa antaganden och istället fokusera på de underliggande mönstren av arv och tillräckliga protein ensam för att överföra de motsvarande fenotyperna. Den stora majoriteten av proteinbaserade arv återhämtade sig med denna metod var verkligen saknar N/Q-rika sekvens bias.
Denna metod användes sond hela jästen ORFeome för sin förmåga att framkalla proteinbaserade arv på ett opartiskt sätt med endast ett litet antal stressfaktorer (25 mM kadmium klorid, 1 mM koboltklorid, 2 mM Kopparvitriol, 1 mM diamide, 0,2 mM flukonazol, 50 mM hydroxyurea, 20 mM manganese chloride, 0,75 mM parakvat, 50 mM radicicol, 80 J/m2 UV-bestrålning och 10 mM zinksulfat). Detta tillvägagångssätt kan dock enkelt ändras skärmen genetiska nät eller specifika cellulära svar på ett mer riktat sätt. För exempel, funktionellt relaterade proteiner eller alla proteiner reglerade i kan ett diskret signalering nätverk induceras via övergående överuttryck och screenas med stressfaktorer relaterade till deras biologiska funktion. Däremot kunde en större uppsättning av proteiner säkerhetskontrolleras med en mer omfattande uppsättning stressfaktorer att undersöka huruvida specifika cellulära svar har naturligtvis utvecklats till harbor prion växlar. Slutligen, även om vi har genomfört dessa studier i jäst, många aspekter av experimenten (t.ex., övergående proteinuttryck, förkläde ”bota”, etc.) kan generaliseras till andra modellsystem i framtiden. Till exempel däggdjur vävnadsodling är mottagliga för överuttryck via plasmid-baserade system, och fluorescens foci kan också användas som en avläsning för ärftliga självmontering, som beskrivs tidigare28. Protein-kodande sekvenser från andra organismer kan dessutom uttryckt i jäst och testade för sin förmåga att framkalla prion-liknande arv med de metoder som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She och Susan Lindquist för deras hjälp för att utveckla analyserna används i detta dokument, liksom granskarna för sina tankeväckande kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
| Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
| 5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
| BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
| Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
| FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
| Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
| Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
| Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
| CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
| CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
| CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
| CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
| CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
| peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
| bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
| yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
| agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
| Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
| Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
| Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
| Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
| Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
| RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
| biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
| zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
| Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
| Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
| Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |
References
- Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
- Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
- Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
- True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
- Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
- Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
- Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
- Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
- Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
- Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
- Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
- Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
- Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
- Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
- Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
- Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
- Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
- Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
- Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
- Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
- Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
- Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
- Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
- Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
- Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
- Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
- Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
- Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
- Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).
