植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

摘要

启动子表达分析对于深入理解基因调控机制以及目标基因在时空上的表达模式至关重要。本文介绍了一种用于鉴定、分离和克隆植物启动子的实验方案，并进一步描述了在菜豆毛状根中对根瘤特异性启动子的表征方法。

摘要

基因编码序列的上游序列被称为启动子序列。研究启动子的表达模式对于理解基因调控以及目标基因的时空表达模式具有重要意义。另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。在本研究中，我们分析了根瘤菌共生特异性结瘤起始基因（NIN）启动子在转基因毛状根中的时空表达模式，该启动子来源于菜豆（Phaseolus vulgaris）。利用植物基因组数据库和分析工具，我们鉴定、分离并克隆了P. vulgaris NIN启动子，并将其与嵌合报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）GUS增强型::GFP进行转录融合。此外，本实验方案描述了一种利用根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导产生毛状根，实现P. vulgaris快速且多功能遗传转化的系统。该系统在转化后10至12天内可产生长度≥2 cm的毛状根。随后，我们在接种根瘤菌（Rhizobium）后的不同时间点，评估了NIN启动子在毛状根中的时空表达情况。GUS活性结果显示，NIN启动子在结瘤过程中具有活性。综上所述，本实验方案展示了如何在菜豆毛状根中鉴定、分离、克隆并表征植物启动子。此外，该方案适用于非专业实验室，操作简便。

引言

启动子是重要的分子生物学工具，在理解目的基因表达调控中发挥着关键作用。启动子是位于基因序列翻译起始密码子上游的DNA序列，携带基因的核心调控信息；因此，对其准确注释和表征对于理解基因功能至关重要。根据表达模式的不同，植物启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子和诱导型启动子¹。转录组学技术的进步、计算机建模方法的改进，以及多种植物物种基因组序列数据的日益丰富，促进了启动子序列的大规模预测²。

另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。与其他模式植物不同，普通菜豆（P. vulgaris）基因的功能表征主要受限于Phaseolus属植物在稳定遗传转化方面的顽拗性。瞬时转化系统可作为快速进行基因功能研究的替代方法³。在豆科植物共生研究中，豆科宿主植物与根瘤菌之间的相互作用是进行根瘤特异性基因功能分析和启动子研究中最易操作的模型系统之一。迄今为止，已有多个与这些共生过程相关的豆科植物启动子被鉴定，例如Medicago truncatula PT4⁴、SWEET11⁵、Lotus japonicus Cyclops、UBQ....

方案

1. P. Vulgaris NIN 启动子的鉴定、分离与克隆

1. 确定目标基因的启动子序列。目前有多种适用于植物的基因组数据库和分析工具，例如 Phytozome、Ensembl Plants、NCBI。 等等。 一种豆科植物启动子 P. vulgaris 本研究中使用了NIN（PvNIN；Phvul.009G115800）²⁰.
2. 根据所使用的载体系统，设计用于Gateway或传统限制性内切酶克隆的寡核苷酸图1A).
   注意：标准（25–35 bp）脱盐引物即可满足要求。建议使用位于启动子与基因之间的反向寡核苷酸序列。
3. 扩增新鲜分离的 PvNIN 启动子区域（或目的基因的启动子区域） P. vulgaris 使用特异性启动子引物组从基因组DNA进行扩增。采用高保真聚合酶，PCR反应条件如下：95 °C 预变性5 min；30个循环（95 °C 变性30 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸5 min。
4. 在7 x 10 cm的凝胶板上用1%琼脂糖凝胶于60 V电压下电泳分离扩增产物，并回收相应条带的扩增子（700 bp， 图1B）并根据制造商说明将其克隆至pEN....

结果

本研究的目的是评估结节特异性P. vulgaris NIN的时空表达模式。为此，选取NIN基因翻译起始密码子上游700 bp的区域，并设计了一组引物，如图1A所示。使用高保真DNA聚合酶扩增NIN启动子片段，经分离纯化（图1B）后，通过Gateway克隆技术将其插入到双元载体pBGWFS7.0中（图1C），构建形成与嵌合报告基因GUS增强型GFP（GUS-enhanced GFP）的转录融合载体（pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP）。pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP载体构建通常可获得数百个独立克隆。利用基因特异性引物进行菌落PCR筛选，可快速鉴定出正确克隆（图2D）。随后使用启动子特异性引物对PCR阳性质粒进行Sanger测序，以验证插入片段的真实性。

讨论

在基因功能分析过程中，基因表达模式的研究对于理解基因的空间和时间调控具有重要作用 体内研究基因表达模式的常用方法是将目标基因的启动子区域克隆至报告基因（如荧光标记基因 GFP、RFP）的上游。 等。) 或 β-葡萄糖醛酸酶。本文中，我们选择根瘤共生（RNS）特异性基因 NIN 的启动子区域，以研究其在时空表达模式中的表现 P. vulgaris 在RNS期间，已通过Gateway方法将选定的启动子序列克隆至GFP::GUS报告基因的上游，插入启动子表达载体中。

我们已描述了共生特异性启动子在毛根系统中的表达 P. vulgaris 毛状根系统已广泛用于难转化作物中基因的功能鉴定，包括RNAi介导的基因敲低、基因的异位组成型表达、启动子活性分析以及蛋白质定位研究。该系统的主要优势在于操作简便、可重复性强、结果可靠，同时不需耗费大量人力。毛状根系统已在其他豆科作物中成功应用，例如 G. max²⁴, M. truncatula

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>qRT-PCR检测引物
pNIN 正向引物	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN 反向	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13正向引物	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 反向引物	CAG GAA ACA GCT ATG AC
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>试剂
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II 酶混合物	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	植物系统生物学	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA 聚合酶	赛默飞世尔科技	10966018
DNeasy 植物迷你试剂盒	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	赛默飞世尔科技	K210012
Platinum Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	11708013
认证分子生物学琼脂糖	伯乐（Bio-Rad）	1613102
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Invitrogen	C404006
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	T7293-250G
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
细菌学琼脂	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	60615-25G
硫酸壮观霉素	Sigma-Aldrich	PHR1441
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
细菌学蛋白胨	Sigma-Aldrich	P0556
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
萘啶酸	Sigma-Aldrich	N8878
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
上样缓冲液	Sigma-Aldrich	G7654
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>设备
PCR仪	Veriti 梯度PCR仪	4375786
离心	Sigma	Sigma 1-14K
凝胶成像系统	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 型振荡培养箱 - 115VAC	赛默飞世尔科技	EW-51708-70
植物生长培养箱	MRC	PGI-550RH
水平层流洁净工作台	Lumistell	LH-120
荧光显微镜	Leica	DM4500 B
培养皿	sym 实验室	90X15
手术刀刀片	Fisher Scientific	53223
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
22 mL 玻璃试管	托马斯科学	45048-16150