Summary
Detta protokoll presenterar en strategi för hela transkriptom analys från zebrafisk embryon, larver, eller sorterade celler. Vi inkluderar isolering av RNA, väg analys av RNASeq data, och qRT-PCR-baserade validering av genförändringar uttryck.
Abstract
Analysen av globala genförändringar uttryck är ett värdefullt verktyg för att identifiera nya vägar bakomliggande observerade fenotyper. Zebrafiskar är en utmärkt modell för snabb bedömning av hela transkriptom från hela djur eller enskilda cellpopulationer på grund av lättheten av isolering av RNA från ett stort antal djur. Här presenteras ett protokoll för globala gen uttryck analys hos zebrafiskar embryon använder RNA-sekvensering (RNASeq). Vi beskriver beredning av RNA från hela embryon eller från cellpopulationer som erhållits med cellen sortera i transgena djur. Vi beskriver också en metod för analys av RNASeq data för att identifiera berikad vägar och Gene ontologi (gå) villkor i globala gen uttryck datamängder. Slutligen ger vi ett protokoll för validering av gen uttryck ändringar med hjälp av kvantitativ omvänt transkriptas PCR (qRT-PCR). Dessa protokoll kan användas för jämförande analys av kontroll och experimentella uppsättningar av zebrafisk för att identifiera gen uttryck ändringar och molekylär inblick fenotyper av intresse.
Introduction
Jämförande analys av globala genuttryck är ett värdefullt verktyg att identifiera nya gener bidrar till observerade fenotyper. Sådana analyser som normalt förlitar sig på kvantitativ bedömning av avskrift överflöd jämfört mellan experimentell och kontrollprover. Målinriktade strategier, såsom qRT-PCR är relativt snabb och noggrann utredning av enda gen uttryck förändringar. RNA-sekvensering (RNASeq) erbjuder en bred, hypotes-fri metod för att identifiera betydande förändringar i genuttryck mellan prover, gör det nu standard för sådana utredningar över experimentella system.
Zebrafisk har dykt upp som en framstående modell över många sjukdomsområden. Utvecklades ursprungligen för deras nytta i utvecklingsbiologi studier, på grund av deras hög fruktsamhet och relativt låga kostnader för underhåll, experimentell användning av zebrafisk har utvecklats till att omfatta ett brett spektrum av fenotyper från embryonala till vuxna stadier samt som en brett utbud av molekylära analyser1,2,3. Nämligen dessa fördelar gör molekylära mekanistiska studier snabba och kostnadseffektiva på grund av lättheten av förvärva stora mängder material kombinerat med användarvänlighet både genetiska och miljömässiga manipulation i alla skeden av livet. Dessutom öppet beskaffenhet zebrafiskar embryon och yngel gör den idealisk för radgenerering cell - och vävnadsspecifika transgena reporter att låta in-vivo visualisering av diskreta cell populationer4. Utnyttjande av sådana ledningar tillåter global gen uttryck analys i viss isolerad celltyper baserat på reporter genuttryck.
Här presenterar vi ett omfattande protokoll för globala gen uttryck analys med RNASeq efter kultur zebrafiskar embryon. Genetiska experimentella manipulationer, inklusive morpholino (MO)-baserade övergående gen knockdown eller CRISPR-medierad gen editering, har lagts fram någon annanstans5,6,7. Vi har därför fokusera på ett detaljerat protokoll för isolering av RNA från hela embryon eller sorterade transgena reporter-uttryckande celler följt av enkel computational analys av RNASeq resultat med väg verktyg och gen ontologi (gå) villkor. Slutligen har vi inkluderat en strategi för validering av genförändringar uttryck av kvantitativ omvänt transkriptas PCR (qRT-PCR). Dessa protokoll är tillämpliga på zebrafiskar embryon utsätts för en rad olika experimentella förhållanden, inklusive jämförelse av genetiska mutanter eller miljöförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla djur protokoll som beskrivs nedan är i enlighet med och godkända av University of Maryland institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC).
1. embryot förberedelse
- genererar embryon genom naturlig parning
- kultur embryon till 3 månaders ålder, reproduktiva mognad 5 , 8 .
- Segregera vuxna manliga och kvinnliga fiskar från önskad stammen i delade parning tankar kvällen före embryosamlingen och Lägg till 2 hanar och 3 honor i varje tank.
Observera: Användning av transgena insulin2a:mCherry fluorescerande reporter stammen tillåtna analysen av bukspottkörtelns β-celler. - Överföring fisk till parningen vattentanken med färska system vatten och ta bort avdelaren omedelbart efter det att de tänds på morgonen därpå.
- Låt fisken att para naturligt tills embryon observeras i nedre tank. Samla in embryon i 30 min intervaller tills önskad mängd samlas. Store varje insamlade tidpunkt i separata petriskålar i embryo media på 28,5 ° C.
- Utför Mikroskop av genetiska material eller placering i experimentell kultur media 6, om så önskas, och kultur embryona i färska Hank ' s embryo medium 8 i 10-cm petriskålar på 28,5 ° C.
Obs: för analys av gen-uttryck i morpholino (MO) injiceras eller muterade djur, Observera att varje manipulation kan ha oförutsedda effekter på genuttryck. Mutanter kan uppvisa genetiska ersättning i nivå med transkription som inte följs av MO-baserade genmodifiering 9.
- Skede embryon
- kultur embryon i grupper av 50 – 75 embryon per 10-cm petriskål att främja konsekvent utvecklande timing av alla embryon.
- Övervaka utvecklingsmässiga morfologi med dissekera Mikroskop blastomerer, epiboly och somite skeden för att säkerställa utvecklande progression 10.
Obs: Ta bort alla döende eller missbildade embryon för att förhindra utvecklingsförsening i skålen. - Separata embryon de utvecklingsmässiga ålder. Mäta embryo ålder med somite nummer efter segmentering (efter gastrulation, 10,33 h post fertilisering (hpf)) fram till cirka 24 hpf. Etapp av embryon och yngel med kroppens totala längd efter 24 hpf.
Obs: Thoraxsegmenten är chevron-formade mesodermala vävnaden på ryggdelen av embryot. - Ställ sorterade embryon i en 28,5 ° C inkubator och utveckling att gå vidare till önskad ålder.
2. Encelliga Dissociation: Hela Embryo och sorterade cellpopulationer
- hela embryo dissociation
- Euthanize zebrafiskar embryon i önskad skede genom att placera petriskål på is för 5-15 min tills ingen rörelse observeras .
- Överför en pool av 20 embryon till en märkt 1,5 mL mikrocentrifug rör. Ta bort alla överflödiga embryon media från mikrocentrifug röret.
- Tillsätt 200 µL lysis reagens (se Tabell för material) till röret som innehåller embryon. Homogenisera embryon i Lys reagens mekaniskt med en mortelstöt. Tillsätt 800 µL lysis reagens för att få den totala volymen till 1 mL. Förvaras vid-80 ° C tills RNA-extraktion.
- Flöde-sorterade cell isolering 11
- överföra embryon från petriskål i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och ta bort så mycket embryo medium som möjligt.
Obs: Beroende på embryo ålder, mekaniska dissociation kan också krävas i detta steg. Med embryon > 48 hpf, rekommenderar vi användning av en mortel att störa embryo integritet innan du fortsätter. - Inkubera embryon med 1 mL av dissociation buffert 1 (se Tabell för material) i 1,5 mL mikrocentrifug rör. Inkubera i 15-30 min i rumstemperatur. Pulverisera lösningen genom att försiktigt upp och ner med ett P1000 tips för att blanda varje 3-4 min under inkubation steg med. GÖR inte VORTEX.
- Samla embryon genom centrifugering för 3 min vid 300 x g och avlägsna supernatanten. Återsuspendering embryon i 1 mL dissociation buffert 2 (se Tabell för material). Inkubera i 15-30 min i rumstemperatur med regelbundna Pipettera trituration.
- Bedöma matsmältningen genom spädning av 1-2 µL av suspensionen i fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) buffert under mikroskop.
Obs: Komplett matsmältning har inträffat när den undersökta alikvoten visar enstaka celler med minimal cell kluster och bitar av embryonal vävnad. - Samla cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min. ta bort supernatanten. Slamma upp cellerna i 1 mL FACS buffert och gravitation filter genom en 40 µm cell SIL att avlägsna osmält vävnad från provet.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och späd med FACS buffert till ca 1 x 10 6 celler/mL i en FACS tube.
För celltyper med ett relativt litet antal per embryo (mindre än 5% av totalt), såsom bukspottkörtelns β-celler, använder du ett minimum av 1000 steg-matchade embryon. - Ger den FACS sorteringsanläggning med såväl FACS rör innehållande 1 mL suspension cellprover som FACS rör som innehåller endast lysis reagens eller FACS buffert. Gate FACS flöde-Sorteraren för att samla in endast enstaka celler som uttrycker den fluorescerande reportern.
- Utför FACS flöde-sortering tills önskad cell nummer har samlats.
Obs: För att utföra RNASeq, det finns en total-RNA minimikravet. Vi har funnit att 3,000-5,000 celler är tillräckliga för att isolera högkvalitativa, högkoncentrerad RNA. - Lagra de insamlade cellerna på is och omedelbart gå vidare till RNA förberedelse.
- överföra embryon från petriskål i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och ta bort så mycket embryo medium som möjligt.
3. RNA förberedelse
- Extrahera RNA
- Inkubera insamlade provet (från steg 2) med Lys reagens för 5 min i rumstemperatur.
- Lägg till 0,2 mL kloroform för varje 1,0 mL lysis reagens används och Invertera rören för hand för 15 s. Inkubera i 2-3 min i rumstemperatur. Centrifugera proverna på 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför den separerad, vattenhaltiga fasen till en frisk slang och tillsätt 0,5 mL isopropanol för varje 1,0 mL lysis reagens används. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera proverna vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta med 75% etanol och centrifugera proverna vid 7 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. bort supernatanten helt och låt lufttorka i rumstemperatur. Återsuspendering RNA i 15-30 µL dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten.
- Rena högkvalitativa RNA
- kombinera RNA suspensionen med 1/10 volym 3 M natriumacetat (pH 5,5) och 1 volym av isopropanol. Inkubera i 20 min i rumstemperatur och centrifugera proverna vid 12500 x g i 10 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta pelleten med iskall 70% etanol i DEPC-behandlad vatten och centrifugera proverna vid 10 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Upprepa tvättningen gång.
- Avlägsna supernatanten och låt torka i rumstemperatur. Återsuspendering i DEPC-behandlad vatten.
- Assay extraherade RNA för koncentration (ng/µL) och renhet (260/230 förhållandet) använder en absorption spektrometer. Se till att värdet 260/230 är ~ 2.0 innan du fortsätter med RNASeq. Förvaras vid-80 ° C fram till osse (upp till 6 månader).
- Skicka de RNA-proverna till en leverantör eller core för RNASeq och genuttryck ändra analys utifrån kvantifiering av sekvensering läsningar. Resultatet som returneras från leverantören tillhandahålls vanligtvis som en lista av gener uppvisar en betydande faldig förändring i avskrift läser mellan prover.
Obs: En kolumn kan användas om ovanstående metod ger dålig kvalitet RNA. Den mängd, koncentration och RNA integritet nummer (RIN) för RNA-prover bör bekräftas med leverantören eller kärna. Leverantören eller core kommer också normalt att bedöma RIN.
4. Väg och gå långsiktig analys
Obs: se figur 1 för representativa utdata av gen uttryck analysen efter RNASeq som tillhandahålls av core eller leverantören.
- Sortering differentially uttryckt gener
- jämföra ett enda experimentella villkor kontra kontroll
- öppen data (resultat) i ett kalkylblad programvara (se tabellen av material ).
- Markera den drop-down pilen bredvid den ' typ ' och välj " anpassad sortering " inom på kalkylbladet som innehåller Differentiellt uttryckta generna i den experimentella kontra kontroll skick.
- Markerar kryssrutan under ' kolumnen ' i fönstret som dyker upp och välja att sortera efter den ' LFC ' kolumn. Säkerställa ' värden ' väljs i den ' sortera på ' kolumn. Välj för att sortera från ' största till minsta ' i den ' ordningen ' kolumn och klicka " OK ".
Obs: Detta kommer att sortera Differentiellt uttryckta gener så att de med ökat uttryck (positiv LFC) visas överst i listan medan de med minskad uttryck (negativa LFC) visas längst ned i listan.
- Jämföra de flera experimentella förhållandena till en enda kontroll enligt följande.
- Markera den första cellen i en tom kolumn på experimentell 1 kontra kontroll kalkylblad att bestämma differentially uttryckt gener finns i två experimentella förhållanden. Skriv följande formel i cell:
Obs: denna ekvation är en kombination av om, ÄRFEL och MATCH funktioner. a funktionen passa, passa (A1, Experimental2_vs_Control! A: a, 0), kommer att leta efter värdet i A1 (HÄCKNING ID) i i en kolumn (a: a) i kalkylbladet heter Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Den " 0 " indikerar för att leta efter en exakt matchning, och om en exakt matchning hittas, kommer funktionen returnera ett värde av " 1 ", medan om ingen matchning hittas returnerar funktionen ett fel " N/A ". (ii) resultatet av funktionen passa matas sedan in i funktionen ÄRFEL, ÄRFEL (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A: a, 0)), där, om ingången är " 1 " indikerar en matchning hittades, återgår " falska ", och om ingången är " N/A " indikerar en matchning inte hittades, det kommer att återvända " sanna ". (iii) " sant " eller " falska " resultatet är sedan bidrag till om-funktionen, om (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A: a, 0)), " ", " duplicera "), där, om ingången är " sant " indikerar en matchning hittades inte, det kommer returnera värdet mellan den första uppsättningen citattecken (" ") som är tom, och därför cellen är tom. Om ingången är " falska " som anger en matchning hittades, det kommer att returnera värdet mellan den andra uppsättningen citattecken (" duplicera "), och cellen kommer säga " duplicera ". - Tryck på " ange " eller " tillbaka " att köra ekvationen. Markera cellen som innehåller formeln och klicka i rutan i nedre högra hörnet av cellen. Håll musen klickade och dra det markerade området ända ner kolumnen till sista ' funktions-ID ', kopiera ekvationen till varje cell i kolumn.
- Välj " anpassad sortering " igen, lägga till en andra nivå av sortering genom att klicka på den " + "-ikonen i det nedre vänstra hörnet. I den första nivån, " sortera efter ", kolumn och välj " duplicera ", sortera efter och välj ' värden ', och under Order markerar ' A till ö '. I den andra nivån, " sedan genom ", kolumn och välj ' LFC ', sortera efter och välj ' värden ', och under Order markerar ' största till minsta ' och välj " OK ".
Obs: Detta kommer att sortera listan av gener i 4 grupper efter riktningen på uttrycket förändring. Det är viktigt att kontrollera de gener som finns i både experimentella villkor för att säkerställa att förändringen i uttrycket är i samma riktning i båda eller i motsatta riktningar. - Ta bort alla parenteser från kolumnen Gen symboler innan förfarandet eller resultatet inte kan hittas i databaser. Markera hela kolumnen som innehåller genen symboler. Välj " redigera " sedan " ersätta " i listrutan ' fil ' menyn. Typ " (*) " i den " hitta vad: " bar på Ersätt-fönstret, och lämna den " Ersätt med: " bar tom. Välj ' Ersätt alla ' att ta bort alla instanser av parenteser.
Obs: Den * representerar valfritt antal tecken, genom att placera denna karaktär mellan två parenteser programmet uppmanas att hitta en instans i de markerade cellerna och någon instans av parenteser kommer att ersättas med ingenting, och därmed att ta bort dem.
- Markera den första cellen i en tom kolumn på experimentell 1 kontra kontroll kalkylblad att bestämma differentially uttryckt gener finns i två experimentella förhållanden. Skriv följande formel i cell:
- jämföra ett enda experimentella villkor kontra kontroll
- Fastställa berikad vägar
- kopia gen symbolerna av uppsättningen som en önskar att avgöra de berikade vägarna till Urklipp. Gå till ConsensusPathDB 12. Välj " gen set-analys " på det vänstra sidofältet på webbsidan, följt av " överrepresentation analys ".
- Klistra in listan av gener i den " klistra in en lista av genen och protein identifierare " rutan. Välj gen symbol i den " genen och protein identifierare typ " rutan och klicka på " Fortsätt ". Markera rutan bredvid " vägar som definieras av väg databaser " enligt den vägen-baserade fastställer avsnitt.
Obs: Ett antal alternativ för analys visas även i listan över tillgängliga databaser att söka. Vi rekommenderar de att välja alla databaser utom de Kegg och Reactome databaserna som de är etablerade och mest omfattande. Den minimal överlappningen med lista och p-värde cutoff inmatningsinställningar kan också justeras utifrån behov. Vi rekommenderar att du lämnar dessa inställningar på den standard 2 gen minimal överlappningen och en 0,01 p-värde cutoff. - Välj " hitta berikad uppsättningar " att få listan över vägar som innehåller gener i listan input.
Obs: Utdata blir i tabellformat inklusive namnet på varje utbildningsavsnitt följt av " ange storlek " (som anger antalet totala gener i väg), " kandidater som innehöll " (som anger antalet gener i listan indata som är den väg ), samt p-värde och q-värdet (FDR) och databasen från vilken smittvägen identifierades.
- Generation av pathway nätverk
- bestämma berikad vägar enligt ovan.
- Markera alla de berikade vägarna att visualisera i pathway nätverk antingen genom att välja varje ruta bredvid väg namnen till visualiseras eller genom att klicka på " alla " under " Välj " i kolumnrubriken ovanför rutorna urval, välj sedan " Visualisera utvalda uppsättningar ".
Obs: Vi rekommenderar att visualisera alla vägar om det mindre än 30; om det finns större än 30 vägar rekommenderar vi att välja de översta 30 mest berikat vägarna (som innehåller det största antalet gener från listan input). - Justera den " relativa överlappar " och " delade kandidater " filter, genom att markera antingen rutan i mitten längst upp på sidan och inmatning av desirEd procent relativ överlappa eller delade kandidater, vara strängare för att göra den mer relevant överlappningar inom de pathway nätverk tydligare och välj " gälla ".
Obs: Vi rekommenderar en minsta relativa överlappning av 0,2, som anger en 20% gen överlappning mellan 2 vägar att ansluta dem, och minst 2 delade kandidater. Graph legenden kan ses genom att klicka på diagram legenden i övre vänstra delen av sidan.
- Bestämning av berikade GO villkor
- Kopiera gen symbolerna i gruppen som man önskar att berikas gen ontologier till Urklipp. Gå till den ' GO berikande analysverktyg ' i Gene Ontology konsortiet 13. Klistra in listan över gen symboler i rutan till vänster på sidan under " din gen IDs här … "
- Välj vilken uppsättning gå termer att använda, som förtecknas under rutan gen IDs: biologisk process, molekylära funktion eller cellulära komponenter. Välja (rekommenderas) ' biologisk process '. Välj ' Danio rerio ' under språng villkor rutan och klicka på " skicka ".
Obs: Vi rekommenderar att du använder standard p-värde cutoff 0,05.
5. Verifiering av qRT-PCR
Obs: enskilda gener som identifierats med betydande gen uttryck förändringar i RNASeq bör kontrolleras av riktade qRT-PCR i replikera experiment.
- cDNA syntes
- extrahera RNA från embryon med metoden som beskrivs i avsnitt 3.1. RNA-extraktion.
- Konvertera 1 µg RNA till cDNA med cDNA konvertering kit (se Tabell för material). Kombinera RNA, dNTP och omvänt transkriptas enzym. Utföra termocyklern reaktionen enligt tillverkaren ' s specifikationer.
- Späd cDNA 1:3 i DEPC-behandlad vatten. Förvaras vid 4 ° C i upp till 1-2 månader.
- qRT-PCR verifiering
- Välj gener att verifiera genom qRT-PCR från RNA-sekvensering resultat. Identifiera gener med hög fold förändringar i uttryck. Avgör vilka av dessa gener innehåller också hög Läs räknas, eftersom detta tyder rikliga uttryck.
- Väljer 10-12 målen från high fold change, hög Läs räkna lista av gener. Utforma grundfärger att förstärka de målgener som spänner över minst 1 intron-exon gräns.
- Ange genen eller riktade regionen av genen in qPCR primer design webbplats 14. Välj den " design 2 qPCR primers " och snabb platsen att skapa primer.
Obs: Glöm inte att inkludera intern kontroll primers, såsom β-aktin, för att normalisera jämförelser mellan prover. Β-aktin primers är F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' och R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Kombinerar den cDNA, forward primer, reverse primer och polymeras. Utföra qRT-PCR-amplifiering för att avgöra det relativa uttrycket av gener 15.
- Analysera de relativa mRNA-uttrycket av gener av intresse av relativ kvantifiering bestämning 15.
- Jämför qRT-PCR till RNASeq resultat för att riktningen på differentiell uttryck är konsekvent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sortering av Differentially uttryckt gener:
För att identifiera Differentiellt uttryckta gener i larvstadium zebrafiskar modeller av Alström syndrom och Bardet-Biedl syndrom (BBS), riktade vi antingen alms1 eller bbs1 utskrifter genom att injicera tidigare validerade splice-blockerande MOs till vildtyp zebrafiskar embryon16,17. 5 dagar efter befruktning (dpf), två replikat för RNA extraherades från varje skick, liksom embryon injiceras med kontroll MO, som beskrivs i avsnitt 3 ovan. RNA från varje prov sekvenserades till ett djup av ~ 120 miljoner läser med ~ 107 miljoner läser högerjusterade zebrafiskar genomet. Mellan 85-90% av arrangera i rak linje läser mappas till exonic regioner i genomet.
1 348 totala gener ändrats avsevärt i Alström modellen och 471 totala gener ändrats avsevärt i BBS modellen. Delade förändringar i genuttryck mellan modeller eller förändringar som är unik för en av modellerna identifierades som beskrivs i avsnitt 4.2. 1 084 totala gener ändrats unikt i Alström modellen, 612 uppreglerat och 472 down-reglerade och 207 gener ändrats unikt i BBS modellen, 176 uppreglerat och 31 down-reglerade (figur 2, Tabell S1och S2 tabell). 264 gener befanns ändras avsevärt i båda modellerna, 73 var uppreglerat 182 var ned-reglerade och 9 visade motsatt förändringar i uttryck mellan de två modellerna (figur 2, Tabell S1och S2 tabell (se Kompletterande Tables.xlsx)). De avvikande antal Differentiellt uttryckta gener mellan de båda modellerna föreslår att bbs1 och alms1 kan påverka olika stadier i utveckling.
Intressant, tyder det stora antalet Differentiellt uttryckta gener i Alström modellen på att alms1 spelar en viktig roll i utveckling vid 5 dpf scenen, medan de mindre antalet genförändringar i BBS modellen tyder på att roll bbs1 kanske inte är lika framträdande vid denna tidpunkt. Däremot föreslog tidigare transcriptomic analyser på 2 dpf omvänd18.
Bestämning av berikade spridningsvägar och gen ontologier i zebrafisk modellen av Alström syndrom:
För att tydligare belysa den molekylära profilen av Alström modell, identifierades de vägar och gen ontologier berikad i Differentiellt uttryckta generna. Berikad gen ontologier bestämdes genom att fråga Gene Ontology konsortiet som beskrivs i avsnitt 4.3-4,5 och berikade vägar bestämdes genom att fråga ConsensusPathDB. Den mest höganrikat bland de gener som uppreglerat i Alström modell, antal gener eller vik anrikning, analyserades. 31 totala vägar var uppreglerat i Alström modellen. Förutom bred gruppering av ”ämnesomsättningen”, den mest drabbade vägar var medfödd och adaptiv immunsystemet med 32 och 20 gener, respektive (figur 3A). Nedströms β-cell receptor signalering händelser var också berikad tyder på immunförsvaret Uppregleringen i denna modell. Flera signalvägar berikades också bland de upp-reglerade generna i Alström modellen, konsekvent med anslutningen av Alström syndrom med primära cilier dysfunktion, ett stort signalering centrum av cellen (figur 3A). Dessutom tre vägar är associerad med insulinutsöndringen var uppreglerat: fettsyror bundna till GPR40, fria fettsyror och acetylkolin (figur 3A). Detta är förenligt med mycket penetrant insulin resistens och typ 2-diabetes fenotyperna Alström patienter. Sex GO benämner berikades bland de upp-reglerade generna i Alström modellen, inklusive erytrocyt differentiering, erytrocyt homeostas, myeloida cell homeostas och homeostatiska processer (figur 3B). För att bedöma sammankopplingen av de uppreglerat vägarna, genereras ett pathway nätverk av den Alström modell uppreglerat vägar var (figur 3 c). Noden stora sammanlänkade vägar visade en hög grad av anslutning bland de vägar är associerad med immunförsvaret och signalering, medan en av noderna mindre avslöjade anslutning mellan de tre insulin rättsliga vägarna. Slutligen, vi verifierat gen uttryck ändringar identifieras av RNASeq genom bedömning av 5 gen mål, som var antingen upp - eller ner-reglerade i Alström modellen. Riktningen på genförändringar uttryck av qRT-PCR i aste, gck, bmb, btr26, och ifi35, relativt kontrollen, återgetts som observerades av RNASeq (figur 4A–B).
Figur 1. Representativa produktionen av gen uttryck analys efter RNASeq som tillhandahålls av core eller leverantören. Funktions-ID anger HÄCKNING gen ID-nummer. Läs räknas anger antalet läsningar i antingen kontroll eller experimentprover som anpassas till den genen i arvsmassan. Faldig förändring och loggen för vik ändringen anger graden av förändring i uttrycket av genen mellan de experimentella och styra urvalet i antingen positivt (ökning) i uttryck i experimental prov riktning, eller negativa (minskning) i uttryck i experimentella provet riktning. P-värde och FDR är statistiska tester för att avgöra betydelsen av resultat; för RNASeq experiment används ett strängare FDR värde på 0,05 att bestämma betydelse. Gene_symbol indikerar NCBI gen ID och gene_name visar det fullständiga namnet på genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Differentially uttryckt gener i BBS och Alström modeller. Antalet gener uppreglerat (röd) eller ner-reglerade (gul) i alms1 MO (grön) injiceras embryon, bbs1 MO (orange) injiceras embryon eller båda jämfört med standard kontroll MO injiceras embryon. * Betecknar antal gener förändrats i båda men att ha mittemot förändringar i uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
FIGUR 3. Uppreglerad vägar och berikade GO termer i Alström modellen. (A) uppreglerad vägar av antal gener. (B) uppreglerad gå termer av fold anrikning. (C) väg anslutning av ledhinnans vägar i Alström modellen. Väg anslutningar bestäms av minst 20% delade gener mellan vägar och minst 2 gener överlappar varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. qRT-PCR validering av uttrycket genförändringar. Förändringar i genuttryck som identifierats av RNASeq bekräftades i och behandling-åldersmatchade 5 dpf embryon, injiceras med kontroll, alms1 eller bbs1 MO. (A) delmängd av gener visar mRNA uttryck av gener med qRT-PCR. (B) motsvarande data visar Läs räknas från RNASeq datamängden. Alla data är relativt kontrollen och qRT-PCR var normaliserade till aktin. aste, asteroid homolog 1; GCK, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, blodtörstiga-relaterad gen familj, medlem 26; ifi35, interferon-inducerad protein 35. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll erbjuder en relativt snabb och kostnadseffektiv strategi för transkriptom analys av hela djur eller specifik källsorterat cellpopulationer. Zebrafiskar ger ett fördelaktigt modell för denna typ av studie på grund av den lätthet och snabbhet i genererar stora mängder utgångsmaterial, lättheten att genomföra genetisk eller experimentella miljöförhållanden, och tillgången till en stor spektrum av transgena reporter rader möjliggör isolering av celltyp specifika och vävnadsspecifika populationer.
Medan inte detaljerad här, kunde denna metod rymma vävnadssnitt samlas in från juvenil eller vuxen fisk som ett alternativ till FACs och samling. Vi har också utvecklat en grundläggande uppföljande analys strategi som endast bygger på användning av grundläggande kalkylblad kommandon och befintlig väg och gå databaser. Den stora fördelen med detta tillvägagångssätt är användarvänlighet tillgänglighet utan att kräva hög kompetens inom programmering eller databas Datorhantering. Som sådan, är denna strategi tillämplig för utredare av alla bakgrunder för informativ analys av stora gen uttryck datauppsättningar.
Vår strategi kombinerar grundläggande zebrafiskar embryo och larver kultur med standard RNA utvinning tekniker följt av RNASeq. RNASeq kräver en stor mängd högkvalitativa utgångsmaterial; vissa leverantörer kräver 2 µg av total-RNA. Som ett resultat, är ovanliga/sällsynta celltyper eller individuella embryot analys utom räckhåll. Men de senaste fem åren har visat dramatiska förbättringar av låg avkastning analyser, datamängder som genereras från mindre prover och lägre RNA mängder, och vi förväntar oss att dessa program kommer att vara möjligt i en nära framtid. För att säkerställa korrekta resultat, tillägg av både tekniska replikat, dvsär generera två RNA bibliotek från ett enda prov och biologiska replikat, dvssamla embryon från flera parningar, perfekt. Dessa steg möjliggör variation i prover forskarna till kontroll, och sekvenser som identifierats i alla prov är mer sannolikt att vara sant resultat, med minskade sannolikheten för saknas en lägre Läs-räkna resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) och T32DK098107 (T.L.H. och J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
