Este artículo proporciona un procedimiento detallado sobre la síntesis en fase sólida, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN modificado en la posición C2'- O . Los análisis fotométricos del dicroísmo UV-vis y circular se usan para cuantificar y caracterizar aspectos estructurales, es decir , hebras simples o dobles.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Protocolo para la síntesis en fase sólida de oligómeros de ARN que contiene un 2'-
En este artículo
Resumen
Resumen
La síntesis en fase sólida se ha utilizado para obtener polímeros canónicos y modificados de ácidos nucleicos, específicamente de ADN o ARN, lo que la ha convertido en una metodología popular para aplicaciones en diversos campos y para diferentes propósitos de investigación. El procedimiento descrito en este documento se centra en la síntesis, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' que contiene cero, una o dos modificaciones situadas en la posición C2'- O . Las sondas se basan en grupos 2-tiofenilmetilo, incorporados en nucleótidos de ARN mediante síntesis orgánica estándar y se introducen en los oligonucleótidos correspondientes a través de sus respectivas fosforamiditas. Este informe hace uso de la química de la fosforamidita mediante las cuatro nucleobases canónicas (uridina (U), citosina (C), guanosina (G), la adenosina (A)), así como 2-tiofenilmetilo nucleótidos funcionalizados modificados en la 2'- O - posición; Sin embargo, la metodología es susceptible para una var grandeUna serie de modificaciones que se han ido desarrollando a lo largo de los años. Los oligonucleótidos se sintetizaron sobre un soporte de vidrio de poro controlado (CPG) seguido por escisión de la resina y desprotección bajo condiciones estándar, es decir , una mezcla de amoníaco y metilamina (AMA) seguida de fluoruro de hidrógeno / trietilamina / N-metilpirrolidinona. Los oligonucleótidos correspondientes fueron purificados mediante electroforesis de poliacrilamida (20% de desnaturalización) seguido de la elución, la desalinización, y el aislamiento a través de cromatografía de fase inversa (Sep-pak, C 18 -column). La cuantificación y los parámetros estructurales se evaluaron mediante el análisis fotométrico del dicroísmo (UV) y del dicroísmo circular (CD), respectivamente. Este informe pretende servir como un recurso y una guía para los investigadores principiantes y expertos interesados en embarcarse en este campo. Se espera que sirva como un trabajo en progreso a medida que se desarrollan nuevas tecnologías y metodologías. La descripción de las metodologías y técnicas dentro deS documento corresponden a un ADN / ARN sintetizador (renovado y comprado en 2013) que utiliza phosphoramidite química.
Introducción
La síntesis en fase sólida para obtener oligonucleótidos de ADN / ARN es una poderosa herramienta que ha servido a varias aplicaciones en diversos campos desde los años setenta 1 , 2 , 3 utilizando bloques de construcción de fosforamidita 4 . Ejemplos de su amplia influencia son: su impacto en el etiquetado (a través de las reacciones químicas) 5 , el sondeo estructural 6 y las tecnologías antisentido 7 , así como su elucidación de los mecanismos biológicos
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Síntesis en fase sólida de los oligonucleótidos de ARN
- Preparación de soluciones que contienen cada fosforamidita (Tabla 1).
- Contar el número de nucleótidos y ajustar en la ecuación n + 1 (donde n = número de nucleótidos) correspondiente a cada base y rellenar la tabla con los valores faltantes. Volumen = 0,15 ml por nucleótido a una concentración de 0,1 M, disuelto en acetonitrilo anhidro.
- Pesar cada fosforamidita en botellas ámbar de 10 ml secadas en horno (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm DI x 20 mm OD Top) y colocar inmediatamente bajo vacío usando un desecador que contenga un agente de secado.
- Llenar ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La síntesis de dodecámeros de ARN que contienen cero, uno o dos modificaciones de 2-tiofenilmetilo en la posición C2'- O se describe junto con su correspondiente purificación y caracterización. Además, se incluye una descripción detallada del análisis estructural que se llevó a cabo a través de CD.
Las cuatro cadenas de ARN (incluyendo una cadena con una secuencia complementaria) se obtuvieron mediante síntesis en.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La intención de este manuscrito es servir de guía a los investigadores en el campo, principiante o experto, para lograr con éxito o mejorar la síntesis de oligonucleótidos de ADN o ARN. La metodología descrita se centra en el uso de síntesis en fase sólida utilizando un sintetizador de ADN / ARN automatizado a través de la química estándar de fosforamidita. El informe describe una descripción paso a paso de la síntesis, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN. Además, se utiliza el uso de CD para identifica.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Preparación de este manuscrito fue apoyado a través de fondos de puesta en marcha de la Universidad de Colorado Denver (JMRE). AF quiere agradecer el apoyo de un premio de Investigación y Actividades Creativas (RaCAS, CU Denver). Se reconoce la financiación de la Oficina de Servicios de Investigación de la Universidad de Colorado Denver para cubrir los gastos de publicación. Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio, la Sra. Cassandra Herbert y el Sr. Yannick K. Dzowo por sus contribuciones en la parte de video.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrilo 99.9%, Grado de HPLC | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrilo 99.9%, anhidro para secuenciación de ADN | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrilamida, 99+% | ACROS Organics | 164850025 Cloruro | |
| de amonio 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Citrato de amonio, dibásico 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Fluoruro de amonio 98.0%, grado ACS | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Hidróxido de amonio 28 - 30% en agua, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Persulfato de amonio | ACROS Organics | 1444 | |
| Argón-pureza ultra alta | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrilamida Ácido bórico ultrapuro | VWR-Amresco | 172 | |
| Fisher Scientific | A73-1 | ||
| Pirocarbonato de dietilo, 97 % | ACROS Organics | ||
| Etanol, anhidro, grado histológico | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ácido etilendiamina tetraacético, sal disódica deshidratar 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamida | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Ácido clorhídrico, 36,5 - 38,0%, Certificado ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Metanol, 99,9 %, Grado de HPLC | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Metilamina 40% en agua | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Metil-2-pirrolidinona, andhidra, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Inserto de pozo (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNasa Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Acetato de sodio, anhidro 99,2%, Certificado ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Cloruro de sodio, 100,5%, Certificado ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Fosfato de sodio monobásico dihidratado 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2',4' Trietilamina, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Trihidrofluoruro de trietilamina, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Ácido trifluoroacético, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6'-Trihidroxiacetofenona monohidrato 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reactivos para la síntesis de ARN: | |||
| desbloqueante fuerte, ácido tricloroacético al 3% en diclorometano | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Mezcla de tapas A, THF/Piridina/Anhídrido acético | Glen Research | 40-4110-52 | |
| tapas B, 10% 1-metilimidazol en THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activador, 0,25 M 5-etiltio-1H-tetrazol en acetonitrilo anhidro | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Solución oxidante, 0,02 M de yodo en THF/Piridina/Agua | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Fosforamidita | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Fosforamidita | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Fosforamidita | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Fosforamidita | Glen Investigación | 10-3003-xx |
Referencias
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
