Summary
Vi visar en snapin chip-teknik för att utföra Cross-Country-reactivity-fri multiplexade smörgås immunanalyser genom att helt enkelt fästa två bilder. En snapin-apparatur används för tillförlitligt överföra reagenser från microarray-till-microarray. Snapin chipet kan användas för alla biokemiska reaktioner som kräver colocalization av olika reagenser utan förorening.
Abstract
Multiplexade proteinanalys har visat överlägsen diagnostisk känslighet och noggrannhet jämfört med enstaka proteiner. Antikropp microarrays möjliggör tusentals mikroskala immunanalyser utföras samtidigt på ett enda chip. Sandwich assay format förbättrar analysens specificitet genom att upptäcka varje mål med två antikroppar, men lider av korsreaktivitet mellan reagenser sätt begränsa deras multiplexering kapacitet. Antikropp colocalization microarray (ACM) har utvecklats för Cross-Country reactivity-fri multiplexade protein upptäckt, men kräver en dyr spotter på plats för microarray tillverkning under analyser. I detta arbete visar vi en snapin chip-teknik som överför reagens från microarray-till-microarray av enkelt knäppa två marker tillsammans, ingen spotter behövs således under provet inkubation och efterföljande ansökan av upptäcka antikroppar (sandskädda) vid lagring av pre fläckig diabilder, separera bild preparatet från assay utförande. Både enkel- och Dubbelrum överföringsmetoder presenteras för att uppnå korrekt anpassning mellan de två microarrays och bild tillverkning för båda metoderna beskrivs. Resultaten visar att < 40 μm anpassning har uppnåtts med dubbel överföring, att nå en array täthet av 625 ställen/cm2. En 50-plexed immunoassay har utförts för att påvisa användbarheten av snapin chip i multiplexade proteinanalys. Detektionsgränser för 35 proteiner är i spänna av pg/mL.
Introduction
En panel av biomarkörer som består av flera proteiner kan ge högre sensitivitet och specificitet än en enda biomarkör för diagnos av komplexa sjukdomar såsom cancer1,2. Den enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) har varit den guldmyntfot teknik som används i kliniska laboratorier att uppnå en detektionsgräns på låg pg/mL i plasma, men gränserna till ett mål per test3,4,5. Antikropp microarrays har utvecklats för rymmer tusentals miniatyriserade analyser genomförs parallellt på en enda Mikroskop bild6,7,8. Men denna metod multiplexering förmåga begränsas av reagens-driven korsreaktivitet, som följer av tillämpningen av en blandning av sandskädda, och blir det mer problematiskt med ett ökande antal mål9,10 , 11. Pla et al. har förklarat att den resulterande sårbarheten i en multiplex sandwich assay skalor som 4N(N-1) där N är antalet mål12.
För att mildra korsreaktivitet i antikropp microarrays, antikropp colocalization microarray har (ACM) utvecklats i vårt laboratorium för multiplex sandwich assay12. Fånga antikroppar (hytter) är spotted på ett substrat med en microarray spotter. Efter blockerande prover appliceras på ytan, och sedan individuella sandskädda är fläckig på samma fläckar med cAb-antigen komplex. Alla korsreaktivitet scenarier mellan antikroppar och antigen kan lindras med ACM och detektionsgränser pg/ml har uppnåtts. Assay protokollet kräver dock förbereder och spotting sandskädda under experimenten med en Hotellets microarray spotter med hög precision för justering syfte, vilket är dyrt och tidskrävande, att begränsa den breda tillämpningen av denna teknik i andra laboratorier. En handhållen ACM, heter snapin chip har utvecklats för Cross-Country reactivity-fri och spotter-fri multiplex smörgås immunanalyser13,14,15. Hytter och sandskädda är pre fläckig på en test bild och en överföring bild respektive i microarray format och lagras. Under analysen, bilderna är Hämtad och en microarray av sandskädda överförs kollektivt till assay bilden genom att helt enkelt fästa två marker tillsammans. En snapin-apparatur används för tillförlitlig reagens överföring. Nitrocellulosa belagda diabilder med en relativt stor antikropp bindande kapacitet har använts som assay bilderna för att absorbera flytande droppar och därmed underlätta reagens överföring, men bilderna är dyrare än vanlig glasskivor och microarray skannrar som är kompatibla med icke-transparenta bilder behövs för signal förvärv.
I detta arbete visar vi protokollet av utför en multiplex sandwich-immunoassay med en snapin-chip. En roman snapin-apparater utvecklats för mer bekväm och pålitlig reagens överföring från microarray-till-microarray. Ännu viktigare, har här vi etablerat reagens överföringsmetoden på regelbundna glasskivor med snap chip. 1024 ställen var framgångsrikt överförts och arrangera i rak linje på en glasskiva, betydligt ökad användning av denna teknik i de flesta laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning och lagring av snap marker
- enda överföringsmetod ( figur 1a)
- Spot cAb lösningar innehållande 400 µg/mL antikroppar och 20% glycerol i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på en nitrocellulosa (eller ett functionalized glas) assay bild med en bläckstråleskrivare microarray spotter 13 vid en relativ luftfuktighet på 60% (1,2 nL för varje plats) med 800 µm centrum-till-centrum avstånd. Kontrollera att bilden är fast på spotter däck enligt ett hörn (här, det nedre vänstra hörnet används).
- Inkubera fläckig assay bilden i rumstemperatur i 1 h med en relativ luftfuktighet på 60%.
- Klämma en bildspel modul packning med 16 fack i assay bilden dela in det i 16 brunnar. Skölj bilden tre gånger genom att lägga till 80 µL av PBS som innehåller 0,1% Tween-20 (PBST) till varje brunn, och skakningar på 450 rpm på en shaker, 5 min varje gång.
- Lägga till 80 µL blockerande lösningar för varje brunn och skaka för 1 h vid 450 rpm.
- Ta bort packningen och torka assay bilden med en kväveström.
- Fixa en överföring bild på spotter däck och skjut det nedre vänstra hörnet av bilden mot nedre vänstra hörnet av spotter däck. Inkjet spot en rad alignment marks (en lösning av polystyren mikro-pärlor) med samma layout som för förarhytterna.
- Låt de alignment marks torka. Vänd överföring bilden och sätta tillbaka den på spotter däck, fastställande mot det nedre vänstra hörnet.
- Förbereda den dAb spotting lösningar innehållande 20 µg/mL antikroppar, 20% glycerol och 1% BSA.
- Använder Spanaren ' s kamera, ta en bild av ett monteringsmärke. Genomföra denna bild i tubkikare programmet som ett relaterat och få bild erkännandesystem av inkjet Spanaren att identifiera den mest övre vänstra markeringen. Använda dess koordinat som första plats i dAb-matrisen. Plats 8 nL per droppe med en centrum-till-centrum avstånd 800 µm.
- Dubbel överföringsmetod ( figur 1b)
- Placera en överföring bild 1 på inkjet spotter däck mot det nedre vänstra hörnet. Spot taxibilar lösningar innehållande 400 µg/mL antikroppar, 20% glycerol och 1% BSA i PBS in i bilden med en bläckstråleskrivare microarray spotter vid en relativ luftfuktighet på 60% (0,4 nL för varje plats och ~ 200 µm i diameter). Centrum-till-centrum avstånd är 400 µm.
- Snap överföring bilden med en nitrocellulosa belagd (eller ett functionalized glas) test bilden med en snapin-apparatur ( figur 2) för att överföra cAb droppar in i assay bilden.
- Tur alla sex knappar på sidan av snapin apparaten 90 grader att dra och låsa alla kolvarna i öppet läge. Infoga överföring bilden i bildhållaren i dess kärl med urklippta hörnet inför fasta pogo PIN-koden. Vända den första uppsättningen av tre knappar att släppa kolvarna med gyllene pogo pin och kontrollera bilderna trycks mot justering stiften.
- Infoga en nitrocellulosa-belagda bild i den snapin apparater uppochnervänt sitter på 4 pogo stiften. Slå den andra uppsättningen av tre knappar för att släppa kolvarna med silver pin och kontrollera bilderna trycks mot justering stiften.
- Stäng snapin apparaten genom att placera det övre skalet på bild innehavaren med justering pelare och hål för en exakt positionering.
- Infoga stängda snapin apparaten i sin bur och tryck in fliken stängning helt för att föra microarrays ansikte mot ansikte samtidigt som det lämpliga trycket. Hålla stängt för 1 min.
- Separata bilder. Inkubera i assay bilden i rumstemperatur i 1 h med en relativ luftfuktighet på 60%. Tvätta, blockera och torka assay bilden enligt beskrivningen i steg 1.1.3 - 1.1.5.
- Placera en annan överföring bild på inkjet spotter däck och push mot det nedre vänstra hörnet. Spot dAb lösningar innehållande 50 eller 100 µg/mL antikroppar (se tabell 1), 20% glycerol och 1% BSA i PBS. Se till att varje plats är 0,8 nL och center till mitten avståndet mellan ställen är 400 µm.
- Lagra analysen och överföra bilden. Försegla både analys och överföra bilder i en lufttät påse som innehåller torkmedel och sätta i-20 ° C frys.
2. Multiplexed immunanalyser med snap marker
- Hämta assay bilden från frysen. Lämna påsen förseglas för 30 min tills bilden kommer rumstemperatur.
- Förbered 7-punkt följetong utspädda provet lösningar av tillsatta proteiner i PBS som innehåller 0,05% Tween-20.
Obs: Här en 5 gånger utspädningsfaktorn används. Start halterna för varje protein är listade i tabell 1. - Förbereda prov lösningar som är lämpligt. Till exempel späd humanserum 4 gånger i PBST buffert.
- Klämma en 16-fack packning i assay bilden.
- Fylla en kolumn med 8 brunnar med de 7 protein utspädning lösningarna och en protein-fria PBST buffertlösning genom pipettering. Pipettera prov lösningarna i de andra 8 brunnarna med samma bild.
Obs: 80 µL lösningar kan passa i varje brunn. Fler bilder kan användas för att mäta ytterligare prover vid behov. - Inkubera proverna på en shaker vid 450 rpm för 1 h i rumstemperatur eller för övernattning på 4 ° C. tvätt bilden tre gånger med PBST på shakern på 450 rpm, 5 min varje gång. Ta bort packningen och torka i bilden under en ström av kvävgas.
- Hämta överföring bilden med sandskädda från frysen. Håll påsen förseglas i 30 min i rumstemperatur. Sedan, inkubera i bilden i en sluten kammare (t.ex. tom tips box) innehållande 60% luftfuktighet stabilisering pärlor i 20 min för rehydrering.
- Snap överföring bilden med assay bilden med en snapin-apparatur ( figur 2) för att överföra dAb droppar. Se avsnitt 1.2.2 för drift av apparaten snapin.
- Separata bilder. Inkubera i assay bilden i en sluten kammare som innehåller 60% luftfuktighet stabilisering pärlor för 1 h. Clamp assay bilden med en 16-fack packning och skölj bilden 4 gånger med PBST på en shaker på 450 rpm, 5 min varje gång.
- Pipett 80 µL av lösningar som innehåller 2,5 µg/mL streptividin fluorophore i PBS i varje brunn. Inkubera i 20 min på en shaker vid 450 rpm.
- Skölj bilden 3 gånger med PBST och en gång med destillerat vatten på shaker vid 450 rpm. Ta bort packningen och torka bilden använder kvävgas.
3. Skjut skanning och dataanalys
- Scan test bilden med fluorescens microarray skanner använder 635-nm-lasern.
- Extrahera netto intensiteten i varje plats som använder en analys programvara (t.ex. matris-pro analyzer) 16.
- Beräkna detektionsgränsen (LOD) för varje protein med hjälp av ett statistikprogram och bestämma protein koncentrationerna i proverna.
Obs: LOD definieras som Y-skärningspunkten av cu-standardenRVE ökas genom tre gånger standardavvikelsen av tre oberoende analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysförfarandet för både singel och dubbel överföringsmetoder visas i figur 1. I enskild överföring, hytterna är fläckig direkt på assay bilden och sandskädda överförs till assay bilden vid användning i en spegel mönster av hytterna (figur 1a). Endast en överföring proceduren krävs, men denna metod lider av obalans mellan de två microarrays, orsakas främst av vinkel mellan bilden och inkjet utlastningsanordningen (figur 2). Ett sätt att ta itu med denna utmaning är att överföra både hytter och sandskädda sekventiellt in i assay bilden efter spotting och fastställande bilderna i den snap-apparaten ordentligt (figur 1b). Med den här metoden överförs både microarrays till exakt samma position. Ingen bild erkännande system eller justering markör krävs för metoden dubbel överföring. Feljusteringen för 98% av fläckarna var inom 41 µm, 6-fold förbättring jämfört med den enda överföring metod14.
Snapin apparaten har utformats för att vara lätt att använda utan någon utbildning och minimera risken för array förskjutning. Bilderna förs tillsammans med exakt positionering tack vare justering pins gemensamt för både analys och överföra bilder. Överföring bilden är något mindre att passa under assay bilden när tillfälligt av pogo stiften, tills snapin apparaten stängs. En spacer ingår i överföring bilden att upprätthålla en mikrometerstort lucka som tillåter tillförlitlig droplet överföring till glasskiva. Slutligen, buren och dess stängning flik är utformade för att applicera trycket som behövs för effektiv överföring på varje snapin för reproducerbara, hög kvalitet överföring. Ett foto av snapin apparaten visas i figur 3.
Representativa bilder som illustrerar resultaten av reagens överföring på en nitrocellulosa vattenrutschbana och en glasskiva visas i figur 4. Alexa 532 märkt IgG användes som första reagens och Alexa 647 märkt IgG användes som andra reagens. Efter överföringen, bilden skannades med 532 nm och 635 nm lasrar. Resultatet visar att 3136 (för nitrocellulosa slide) eller 1024 (för glas slide) microspots överfördes med noll fel på analysen bilderna och ingen korskontaminering observerades vid överföra andra reagens. När du använder glasskivor, är det möjligt att skapa mer hydrofoba yta av funktionalisering, vilket minskar storleken på varje plats och minskar plats att platsen avståndet för att överföra ett större antal ställen. Detta arbete expanderar tillämpningen av den snap chip tekniken till vanliga glas substrat.
Standard kurvor för en 50-plex immunoassay inriktning bröstcancer relaterade proteiner illustreras i figur 5, motsvarar den största multiplex smörgås antikropp microarray hittills utan korsreaktivitet. Dubbel-överföring metod användes i denna analys, bilden skannades och fluorescensintensiteten kvantifierades för att generera den standard kurvor. 35 av 50 proteiner nått LODs pg/ml (se tabell 1) och kan förbättras ytterligare genom att optimera assay villkoren. Colocalization av reagens underlättar användningen av flera antikropp par på en enda bild utan korsreaktivitet och tillåter optimering av varje par självständigt med inga störningar på andra par12. Dessa resultat indikerar att snapin-chip är en skalbar teknik som kan användas för multiplexering protein kvantifiering.
Figur 1. Schematisk av analysförfarandet jämföra a singel och (b) dubbel överföringsmetoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk visar skillnader mellan enkel - och dubbel-överföring. a en spegling av överföring reagenser förstärker vinkel mellan bilden och inkjet XY scenen. (b) dubbel-överföringsmetod övervinner vinkel. Anpassad från referens 14 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Foto av snapin apparaten. (a) öppnade enhet. (b) sluten enhet. (c) perspektivvy av enheten. Kort, (i) överföra bilder placeras i skjut hållaren och trycks mot justering pins med hjälp av den pogopin monterad på kolvarna. (ii) assay bilderna placeras ovanpå pogopins och trycks mot justering stiften med en andra uppsättning kolvar. (iii) det övre skalet är placerad ovanpå diapositivhållaren och infogas i buren. En tryck appliceras på fliken stängning att komprimera pogopin och sammanföra bilderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kollektiva överföring av ställen med en snapin-chip. Fluorescens scan med 532 nm och 633 nm lasrar att demonstrera överföringen av antikroppar mot en (a) nitrocellulosa slide (anpassad från referens 14 med tillåtelse) och (b) glas Skjut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Fluorescens bilden av en test bild och standard kurvor av 50 proteiner mätt parallellt med dubbel överföringsmetod. (a) fluorescens bild av en test bild för att generera en standardkurva. (b) Närbild av en matris. Skalstapeln = 2 mm. (c) Standard kurvor för 50 proteiner. Felstaplar beräknades som standardavvikelser från tre oberoende experiment. Anpassad från referens 14 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein namn | Start koncentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) | Protein namn | Start koncentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1,3 × 104 | IL-6b | 1 | 2.1 × 102 |
Tabell 1. Koncentration av protein och LODs i buffert från 50-plex-analysen. LOD för CA 15-3 är i U/ml (*). Anpassad från referens 14 med tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete, har vi presenterat en snapin chip-teknik som gör de Cross-Country-reactivity-fri multiplex immunanalyser allmänt tillgängliga för forskare med grundläggande experimentella inställning. Skiljer sig från befintlig antikropp microarrays, ingen microarray spotter behövs för slutanvändare. Både enkel och dubbel överföringsmetoder demonstreras och dubbel överföring ger överlägsen justering noggrannhet ner till ~ 40 μm för 98% ställen, med största feljusteringen av 63 µm14. En roman snapin-apparater utvecklades för att bekvämt knäppa två bilder med konsekvent tryck, gör denna teknik tillgänglig för forskare. Pålitlig reagens överföring realiseras inte bara på nitrocellulosa-belagd diabilder, men också på regelbundna glasskivor, avsevärt utvidga tillämpningen av denna teknik utan behov av omfattande utbildning. För att demonstrera användbarheten av den snap-chipet, en 50-plex immunoassay utfördes med pre fläckig och lagrade bilder, och 70% av proteiner uppnådde LODs utbud av pg/mL14. Jämfört med befintliga multiplex immunoanalyser som gäller sandskädda som en blandning, är en viktig fördel av ACMEN och snapin chip teknik att analyserna på ett chip är oberoende till varandra, vilket möjliggör att lägga till eller ta bort någon antikropp par utan störa några andra par. Tiotals till hundratals proteiner kan mätas samtidigt med en snapin-chip, alltså förkorta assay tid jämfört med andra metoder såsom den automatiserade seriell mätningen av sekventiell ruvningen som kräver seriell tillämpningen av varje antikropp 17. Endast sub-nliter av varje antikropp behövs för snapin chip tillverkning, vilket gör det mer ekonomisk än konventionella immunanalyser.
De antikroppar koncentrationer används och antigen inkubationsstegen är avgörande för att uppnå hög assay känslighet. Inom fabrication snapin marker, kan antikroppskoncentrationen optimeras beroende på frändskapet av antikropp paren och typer av assay bilderna (nitrocellulosa eller icke-nitrocellulosa). Volymerna av varje antikropp spot kan justeras baserat på spotter kapacitet och justering noggrannhet och center till mitten avståndet mellan fläckarna kan ändras i enlighet därmed. Efter överföring hytter till assay bild, inkuberas vi assay bilden vid rumstemperatur för 1 h. natten inkubation vid 4 ° C kan ge bättre antikropp bindande kapacitet. BSA gratis stabilisator lösningar användes (se tabellen i material) här att blockera assay bilden efter inkubation hytter. Andra blockerande reagens såsom animaliska serum eller mjölk kan också arbeta för denna applikation.
I de multiplexade immunanalyser, kan protokoll för icke-nitrocellulosa bilder med olika ytkemi utvecklas och optimeras. En annan utspädningsfaktorn kan användas att göra standard kurvor beroende på målproteiner. Olika fluorophores kan användas för att märka sandskädda och bilden kan skannas med en laser på en annan våglängd för signal collection.
För närvarande har en densitet på 625 ställen/cm2 uppnåtts med dubbel överföring metod14. För att ytterligare förbättra funktionen multiplexering av snapin chip, finns flera strategier. För det första kan mindre volymer användas för att minska storleken på de ställen, vilket möjliggör kortare centrum-till-centrum avstånd mellan ställen och ökad array densitet. För det andra kan man välja en överföring bild med en mer hydrofoba yta för att minska storleken på plats. För det tredje kan bättre anpassning mellan de två microarrays uppnås genom att utföra finjustering av inkjet Spanaren, och ytterligare optimera de spotting parametrarna såsom avståndet mellan munstyckena och glida ytan.
När det gäller alla antikroppsbaserade immunanalyser är utförandet av den snapin chip immunoassay omfattas av tillgången till och kvaliteten av antikroppar. Snapin chipet fungerar med hjälp av en sandwich assay format, vilket är formatet analys som mest används i ELISA på grund av hög sensitivitet och specificitet som ges av dubbla, sekventiell bindningen av ett par av antikroppar inriktning olika epitoper, men det är beroende av tillgången till ett par av kompatibel antikroppar som behövs för att fånga och detektion av målproteinet.
Värdet av den snap chip tekniken fastställs för immunanalyser, och det förväntas att den kan användas för alla kemiska och biokemiska reaktioner som kräver tillämpning av olika reagenser utan kors-föroreningar18,19 , 20 , 21 , 22. egentligen snapin chip innehåller en allmän lösning för att leverera olika pre fläckig reagenser från microarray-till-microarray, således frikoppla chip tillverkning med analysförfarandet, och hjälper därför till att ta itu med den ” makro-till-mikro ”gränssnitt utmana23. Som ett exempel, har den snap-chipet använts för en 4-plex homogen enzym hämning analys analysera 128 villkor med exakt timing och jämförbara resultat till stor volym experiment14. Det har också tillämpats för multiplexering vävnad färgning. Dessutom kan det bidra till drug screening program att testa tusentals kemikalier på olika bakterier eller celler, för enstaka cell analys21,24, eller för att testa olika förhållanden i enstaka eller flera steg kemiska reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
McGill University har lämnat in en patentansökan på vissa aspekter av detta arbete med Huiyan Li och David Juncker som uppfinnare.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Rob Sladek för användning av inkjet Spanaren. Vi erkänner det slutliga stödet från de kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR), den naturliga vetenskapen och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC), Canadian Cancer Society Research Institute och stiftelsen Kanada för Innovation (CFI). D.J. tack stöd från en Kanada forskning stol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P.
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
