Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine allgemeine Strategie zur kommerziellen angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für ein Label-freie Zelle Analyzer zur Einsparung auf die hohen laufenden Kosten Ofmicrochip basierende Assays zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt, der wiederholte Verwendung von Mikrochips ermöglicht.

Zusammenfassung

Markierungsfreie zellbasierte Assays ist vorteilhaft, biochemische Untersuchung wegen der Verwendung von Versuchstieren nicht erforderlich ist. Aufgrund seiner Fähigkeit, dynamischer Auskunft über Zellen unter physiologischen Bedingungen als klassischen biochemischen Assays zieht dieser markierungsfreie Echtzeit-Zelle-Assay basiert auf dem Prinzip der elektrischen Impedanz mehr Aufmerksamkeit in den letzten zehn Jahre. Seine praktische Nutzung kann aufgrund der relativ teuren Kosten für Messung, begrenzt jedoch in denen teure Verbrauchsmaterialien Einweg gold Mikrochips für die Zelle-Analyzer verwendet werden. In diesem Protokoll entwickelten wir eine allgemeine Strategie zur angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für einen kommerziellen markierungsfreie Zelle Analyzer zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt. Die vorgeschlagene Methode wurde getestet und gezeigt, dass effektiv für die Regeneration und die wiederholte Verwendung der kommerziellen elektronischen Platten mindestens drei Mal die Forscher speichern auf die hohen laufenden Kosten für Echtzeit-Zelle-Assays helfen.

Einleitung

Dank seiner effizienten und weniger arbeitsintensiv experimentellen Prozess erlebte markierungsfreie zellbasierte Technologie rasante Wachstum im letzten Jahrzehnt für analytische sowie Screening Zwecke wie z. B. unter dem Aspekt der Proteomik^1,2 , Drogen-Lieferung³, usw.^4,5 im Vergleich mit traditionellen biochemischen Methoden zur Zellanalyse, markierungsfreie Echtzeit-Zelle Assay mit zuvor von Giaever und Kollegen entwickelten Prototyp⁶ basiert auf dem Prinzip der Erfassung elektrisches Signal....

Protokoll

Hinweis: In der Regel beinhaltet der Regenerationsprozess Trypsin-Verdauung und spülen Schritt mit Ethanol und Wasser. Die Dauer der Verdauung ändert sich entsprechend der Anzahl der verwendeten Zellen, und die Art und Anzahl der verwendeten Zellen können je nach den experimentellen Zwecken. Es wird empfohlen, die regenerierten Mikrochips mit optischen und elektrochemische Methoden zur Optimierung der Regeneration Bedingungen zu überprüfen. Während des Experiments lösliche und unlösliche Chemikalien beteiligt sein können, und hier sind diese zwei typische Fälle der Regeneration Verfahren detailliert.

1. Vorbereitung der Regeneration-Lösungen<....

Ergebnisse

Oberflächeneigenschaften von gold Mikrochips: die Regeneration Verfahren in diesem Protokoll verwendeten waren in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt die mikroskopische Bilder von frischen Oberfläche und elektronische Platten, indem das optische Mikroskop regeneriert. Wie in Abbildung 2A und Abbildung 2, mikroskopische Beobachtun.......

Diskussion

Wir für Sie mehrere Methoden^{17,23,24,25,26} zum Regenerieren von Mikrochips in Tabelle 1zusammengefasst. Diese Methoden beteiligt grundsätzlich relativ harte Versuchsbedingungen, die vollständige Regeneration der Chips wegen der Anwesenheit von starken Molekül-Molekül Interaktionen wie derjenigen der immun Komplex verwendet für SPR-Chips zu err.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ratte: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
Maus Anti-Ratte CD11b monoklonal (Klon OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1.000; Färbung: 1:500
polykolonale Anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Färbung: 1:500
Kaninchen polyklonales Anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Färbung: 1:500
Alexa Fluor Donkey Anti-Maus 594	Invitrogen	Cat# 11055	Färbung: 1:500
Alexa Fluor Donkey Anti-Ziege 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Färbung: 1:500
Alexa Fluor Donkey Anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Färbung: 1:500
Triton-X (Reinigungsmittel in ICC-Färbung)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparansulfat	Galen Laborbedarf	Kat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Pepton aus Milchfeststoffen	Sigma	Cat# P6838
TGF-β 2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R& D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Schafwolle Cholesterin	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Kollagen IV	Corning	Kat# 354233
Ölsäure	Cayman Chemicals	Kat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoin) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM Farbstoff	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium Homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamin	Gibco	Cat# 25030-081
N-Acetyl Cystein & nbsp;	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-Transferrin	Sigma	Cat# T1147
Natriumselenit	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (hoher Glukosegehalt)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysin	Sigma	Cat# A-003-E
Primärplatten	VWR	Cat# 62406-456
Stock Reagenzien	Rekonstitution	Konzentration verwendet	Lagerung
Apo-Transferrin	10 mg/ml in PBS	1:100-20	°; C
N-Acetylcystein	5 mg/ml in H2O	1:1.000-20	°; C
Natriumselenit	2,5 mg/ml in H2O	1:25.000-20	°; C
Kollagen IV	200 μ g/ml in PBS	1:100-80	°; C
TGF-b2	20 μ g/ml in PBS	1:10.000-20	°; C
IL-34	100 μ g/ml in PBS	1:	1.000-80°; C
Cholesterin in Schafwolle	1,5 mg/ml in 100% Ethanol	1:1.000-20	°; C
Heparansulfat	1 mg/ml in H2O	1:1.000-20	°; C
Ölsäure/Gondoinsäure	Gondoinsäure: 0,001 mg/ml; Ölsäure: 0,1 mg/ml in 100 % Ethanol	1:1.000-20	°; C
Heparin	50 mg/ml in PBS	1:100-20	°; C
Lösungen	Rezept		Kommentare
Perfusionspuffer	50 μ g/mL Heparin in DPBS++ (PBS mit Ca++ und Mg+ +)		Bei eiskalter
Zubereitung verwenden Douncing Buffer	200 μ L 0,4 % DNaseI in 50 mL DPBS++		Bei eiskaltem
Panning Buffer	verwenden 2 mg/mL Pepton aus Milchfeststoffen in DPBS++Mikroglia-Wachstumsmedium
(MGM)	DMEM/F12 mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μ g/mL Streptomycin, 2 mM Glutamin, 5 μ g/mL N-Acetylcystein, 5 μ g/ml Insulin, 100 μ g/mL Apo-Transferrin und 100 ng/mL Natriumselenit		Verwenden Sie eiskaltes MGM, um Mikroglia aus der Immnopanning-Schale zu schwenken.
Kollagen IV Überzug	MGM mit 2 μ g/mL Kollagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS ohne Ca++ und Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2		Zugabe von   CaCl2 und MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterinhaltige Wachstumsmedien (TIC)	MGM mit humanen 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murinem IL-34, 1,5 μ g/mL Cholesterin aus Schafwolle, 10 μ g/mL Heparansulfat, 0,1 μ g/ml Ölsäure und 0,001 μ g/ml Gondoinsäure		Achten Sie darauf, Cholesterin in Medien zu geben, die auf 37 °C erwärmt sind; C und fügen Sie nicht mehr als 1,5 μm hinzu. g/mL oder es fällt aus. Filtern Sie keine cholesterinhaltigen Medien. Äquilibrieren Sie TIC-Medien mit 10 % CO2 für 30 min - 1 Stunde, bevor Sie sie den Zellen hinzufügen, um einen optimalen pH-Wert zu gewährleisten.

Nach