Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode waarmee gebruikers levensvatbaarheid van acute hippocampal en corticale segment preparaten tijdens het verzamelen van magnetische resonantie microscopie gegevens handhaven kunnen.
Abstract
Dit protocol beschrijft de procedures noodzakelijk ter ondersteuning van normale metabolische functies van acute hersenen segment preparaten tijdens het verzamelen van magnetische resonantie (MR) microscopie gegevens. Hoewel het mogelijk is voor het uitvoeren van MIJNHEER collecties op levend, verwijderde zoogdieren weefsel, dergelijke experimenten hebben traditioneel is beperkt door de grenzen van de resolutie en zijn daardoor niet in staat van het visualiseren van weefsel microstructuur. Omgekeerd, MIJNHEER protocollen die hebben bereikt microscopische beeldresolutie vereist het gebruik van vaste monsters aan de noodzaak voor statische onveranderlijke omstandigheden over langdurige cyclustijden. Het huidige protocol beschrijft de eerste beschikbare heer techniek waarmee beeldvorming van levende, zoogdieren weefselsteekproeven op microscopische resoluties. Dergelijke gegevens is van groot belang voor het begrip van hoe pathologie gebaseerde contrast veranderingen die zich voordoen op de microscopische niveau invloed wordt de inhoud van macroscopische heer scans zoals die in de kliniek gebruikt. Zodra dergelijke inzicht wordt gerealiseerd, diagnostische methoden met grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid kunnen worden uitgewerkt, dat rechtstreeks naar de behandeling van de ziekte van de oudere, meer accurate therapie monitoring en betere geduldige resultaten zal vertalen.
Hoewel de beschreven methodologie richt zich op de hersenen segment preparaten, is het protocol aanpasbaar aan elk segment van het verwijderde weefsel gezien het feit dat wijzigingen worden aangebracht in de gas- en perfusaat voorbereidingen om het weefsel van specifieke metabole behoeften tegemoet te komen. Succesvolle uitvoering van het protocol zou moeten resulteren in levensomstandigheden, acute segment preparaten die MIJNHEER diffusie signaal stabiliteit voor periodes tot 15,5 h vertonen. De belangrijkste voordelen van het huidige systeem over andere heer compatibel perfusie toestellen zijn de verenigbaarheid ervan met de heer microscopie hardware nodig om te bereiken hoger resolutiebeelden en mogelijkheid tot het bieden van constante, ononderbroken stroom met zorgvuldig gereglementeerde perfusaat voorwaarden. Deelmonster doorvoer is een overweging met dit ontwerp als slechts één weefsel segment kan image worden gemaakt op een moment.
Introduction
Magnetische resonantie beeldvorming (MRI) systemen hebben gestaag vorderde aan steeds hogere Veldsterkten, meer details over de samenstelling en de status van levende weefsels geworden waarneembaar. Ondanks de vooruitgang van dergelijke hardware is MIJNHEER denkbaar ter resoluties voldoende te visualiseren de cellulaire structuren van weefsels nog niet beschikbaar in de kliniek. Mobiele-niveau kenmerken van weefsels moeten dientengevolge worden afgeleid wanneer het overwegen van de inhoud van klinische scans. Dergelijke gevolgtrekking vereist kennis van gelijkwaardige processen die verkregen wordt uit de gegevens die in modelsystemen die rechtstreeks kunnen worden waargenomen. Traditioneel, deze modellen opgenomen cellen van aquatische organismen zoals de Xenopus laevis oöcyt en Aplysia californica L7 neuron1,2. Deze behoorden tot de eerste dierlijke cellen beschikbaar voor observatie met MIJNHEER methoden als gevolg van hun opslagruimte groot: ongeveer 1000 μm en 300 μm diameter, respectievelijk. Meer recentelijk, voorschotten in hardwareontwerp hebben toegestaan voor één van de grootste voorbeelden van zoogdiercellen — het α-motor neuron — aan het image worden gemaakt met behulp van MIJNHEER microscopie technieken op vaste weefsel3,4. Terwijl deze studies aangetoond directe visualisatie van zoogdieren celmateriaal met behulp van de heer dat, de vaste monsters dienst hun heer eigenschappen van levend weefsel aanzienlijk afwijken en dus niet kunnen dienen als een gelijkwaardige representatieve model5, 6. Wat nog belangrijker is, vereist MIJNHEER contrast veranderingen die zich in concert met complexe biologische processen voordoen observeren levende voorbeelden die kunnen worden verstoord en gemeten in de loop van de beeldvorming experiment.
Om te vergemakkelijken de heer microscopie studies over levende weefsels, wordt een protocol gepresenteerd waarin commerciële microimaging hardware7 geïnterfacet op een speciaal gebouwde, MIJNHEER compatibel, in-boring oxygenator en perfusie apparaat eerder beschreven8 . Unieke voordelen van dit ontwerp bevatten mogelijkheden voor mobiele-niveau probleemoplossing in zoogdieren weefsels en controle van de precisie over opgeloste gasinhoud en pH op de site van perfusie van het weefsel. Ook, in tegenstelling tot de meerderheid van explant heer studies die perfusie tijdens Beeldacquisitie om te voorkomen dat artefacten van de stroom te onderbreken, dit ontwerp ondersteunt het gebruik van continue perfusie tijdens het verzamelen van gegevens waarvan is aangetoond dat het verbeteren van de fysiologische toestand van geïsoleerd weefsels9,10. Tot slot, de hulp van de gesloten opname kamer en segment-retentie de hardware in het verminderen van de kans van beweging artefacten die anders kunnen ontstaan tijdens langdurige foto collectie.
Terwijl het huidige protocol procedures die geëigend zijn voor gebruik met acute hippocampal en corticale segmenten beschrijft, zorgt precieze controle over perfusaat metabolieten dit systeem voor een breed scala aan verschillende weefseltypes (HLA) en experimentele omstandigheden. Beperkingen van dit ontwerp bevatten een vermindering in monsters worden verwerkt in vergelijking met een multi segment perfusie kamer11; Nochtans, kan deze beperking worden overwonnen in de toekomst het gebruik van meerdere spoel arrays.
Ook, terwijl het beschreven systeem kan worden gebruikt in zowel horizontale of verticale configuraties, het huidige protocol beschikt over het gebruik ervan in een verticaal georiënteerd, 600 MHz spectrometer. Elk systeem staat van heer microimaging studies — meestal smal-boring (≤6 cm), hoge veld (≥500 MHz) spectrometers — geschikt is voor de apparatuur van het oxygenator en perfusie beschreven. Wijzigingen in de beeldvorming spoel, verloop, sonde systeem of andere essentiële imaging hardware werkzaam kunnen echter wijzigingen in de apparatuur perfusie en parameters van de scan van de heer vergen.
Protocol
alle dierproeven beschreven richtsnoeren uiteengezet in de nationale Academies van Wetenschappen ' gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden herzien en goedgekeurd door de Universiteit van Florida ' s Verzorging van de dieren van de institutionele en gebruik Comité (IACUC). Volg alle regels en voorschriften wanneer de uitoefening van dierlijke onderwerp onderzoek.
1. voorbereiding van perfusaat voor het onderhoud van de weefsels van de Central Nervous System
- maken van verse kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF).
- 2 L van bicarbonaat-gebufferd aCSF perfusaat genereren te meten uit 1500 mL water gezuiverd door dubbele distillatie of omgekeerde osmose in een maatkolf van 4 L. Breng een magnetische roer-bar in de kolf en de vloeistof met behulp van een bord roer doorroeren.
- In het gezuiverde water, Los de volgende hoeveelheden zouten: natriumchloride 14.03 g (120 mM), 4,37 g (26 mM) natriumbicarbonaat, 0.41 g (1,5 mM) monobasisch kalium fosfaat, 0,69 g (1,4 mM) magnesiumsulfaat-heptahydraat, 0.59 g (2 mM) calcium chloride (dihydraat) p.a., kaliumchloride van 0,45 g (3 mM) en 3.6 g (10 mM) glucose.
Opmerking: De chemische inhoud van het perfusaat zal verschillen afhankelijk van de specifieke metabole eisen van het weefsel en de gewenste omstandigheden van het experiment. - Meng deze oplossing totdat alle zouten hebben opgelost. Draai volume om 2 L met behulp van extra gezuiverd water.
- Test de osmolaliteit van de aCSF met behulp van een vriespunt depressie osmometer. Aanpassen aan 300 mOsm/kilogram bij gebruik van sorbitol. Toevoeging van 324 mg sorbitol tot 2 L van 299 mOsm/kg aCSF perfusaat zal toenemen osmolaliteit tot 300 mOsm/kg (ongeveer 1 mOsm per 324mg).
Opmerking: De aCSF kan worden achtergelaten bij 4 ° C in een luchtdichte, afgesloten fles voor een periode van maximaal 24 h.
2. Set Up the perfusie System
- bereiden het perfusaat aCSF.
- Uitgebalanceerd aCSF tot kamertemperatuur (~ 23 ° C) terwijl vergassing met 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) via directe doorgeven voor maar liefst 1 h.
Opmerking: Verschillende weefseltypes (HLA) of gewenste experimentele omstandigheden mogelijk aanpassing van de inhoud van het perfusaat temperatuur of gas. De gewenste voorwaarden opgeloste gasinhoud in het perfusaat controleerbaar juist door het variëren van de percentage concentraties van afzonderlijke componenten van het aanbod gas ( Figuur 1). - Zodra de aCSF bereikt de vereiste temperatuur en de verzadiging van de carbogen, bevestigen dat de pH in de fysiologische bereik (7.3-7.4). Blijven zeepbel gas direct in het perfusaat reservoir (1/16 L/min) in de loop van experiment om te handhaven juiste opgeloste zuurstofgehalte en pH voorwaarden dat bevorderlijk is voor gezond weefsel metabolisme.
- Uitgebalanceerd aCSF tot kamertemperatuur (~ 23 ° C) terwijl vergassing met 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) via directe doorgeven voor maar liefst 1 h.
- Prime van de lijnen van de perfusie.
- Submerge de inlaat buis op de micro-slangenpomp in de voorbereide aCSF (300 mOsm, pH 7,3-7.4 aangesloten, continu vergast).
- Pass de oxygenator apparaat ( Figuur 2) en perfusie lijnen zowel via de magneet droeg en kleurovergang spoel stack (van boven naar beneden) en de spoelen opzij tot sonde vergadering ingesteld. Hang de oxygenator boven een bekerglas om te vangen het afvalwater van elke aCSF.
Opmerking: Afhankelijk van het ontwerp van het systeem van de MRI, perfusie lijnen moet mogelijk worden doorgegeven via de magneet boring en kleurovergang spoelen of sonde lichaam basis voorafgaand aan priming het systeem met aCSF. Bevestigen dat perfusie lijn plaatsing zal niet interfereren met de vergadering van de sonde lichaam of het inbrengen van de sonde in de boring alvorens de procedure priming. - Bevestigen de beoogde debiet (2 mL/min) is geselecteerd en beginnen de perfusie-regels door over te schakelen op de pomp vullen.
- De lege, in-line waterventiel omkeren zodat aCSF de lucht voicemailsysteem verdringen zal.
- Verbinden de oxygenator ' s gas haven naar een tweede bron van carbogen (een variëteit of een secundaire carbogen cilinder) en het instellen van een debiet van 1 / 16L/min.
- Bevestigen dat carbogen stroomt over de oxygenator ' s gasuitwisseling membraan door de poort van de uitlaat op de top van de oxygenator dompelen in water.
- Zodra aCSF is gedetecteerd druipend uit de perfusie-zaal, purge elk zichtbaar gasbellen uit de instroom-regels door handmatige agitatie.
- Bevestigen de oxygenator functioneert naar behoren door dompelen de zuurstof-elektrode in de aCSF die voortvloeien uit de zaal perfusie.
Opmerking: De lezing op de zuurstofmeter moet benaderen het percentage zuurstof deel uitmaakt van het geleverde gas.
3. Weefsel voorbereiding
- euthanasie
- plaats een rat (125-150 g) in de kamer van de inductie van een verdoving machine en bloot aan 4% Isofluraan in een drager van zuurstof gas met een snelheid van 1 L/min gedurende 4 minuten
- Verwijderen van de onbewuste rat uit de zaal anesthesie.
- Een restarmen reflex test uitvoeren door het plaatsen van de rat in de liggende positie. Controleren voor eventuele bewegingen — hoofd draaien, been opheffen, wervelkolom buigzame, etc. — indicatieve die het dier op haar maag draait. Een oog-blink reflexieve test uitvoeren
- door het aanraken van het open oog van het dier met een wattenstaafje. Controleer voor elke reactie — deksel sluiting, spier twitching, etc. — aan deze sensorische input.
- Ten slotte uitvoeren een ledemaat-intrekken reflex test door het knijpen van de huid tussen de tenen van de rat ' s gestrekt achterste been met pincet of hemostats. Check voor flexie van de leg.
Opmerking: in het geval van een positieve reflexieve testresultaat, Ga niet verder met euthanasie. - In het geval dat een van de drie reflex tests lokt een reactie, de rat onmiddellijk terug naar de kamer van de verdoving en zorgen voor een extra 2 min van blootstelling aan 4% Isofluraan.
- Presteren alle drie reflexieve tests via in hun geheel. Herhaal de 2 min verdoving blootstelling zo nodig en alleen gaan als een compleet gebrek aan respons op alle drie reflexieve tests geconstateerd.
- De rat via guillotine onthoofding euthanaseren.
- Resectie van de hersenen
- rat hersenen door bruto dissectie verwijderen. Begin met het hoofd in de vatbaar positie. Met behulp van schaar, rostrally doorbreken naar de huid aan de achterkant van de nek tot de neus en de schedel bloot.
- Verwijderen van de zachte weefsels van het oppervlak van de schedel met een botte sonde.
- Werken uit de caudal einde, verwijder de occipitale, pariëtale en frontale botten van de schedel met behulp van rongeurs.
- De dura intrekken door te snijden langs de longitudinale kloof met micro schaar en peeling terug van de laag van beide halfronden.
- Verwijderen van de hersenen van de schedel door draaien van het hoofd naar de liggende positie en versnijden van de hersenzenuwen aan de ventrale zijde.
- Slice isolatie
- de hersenen terug te keren naar de vatbaar positie en het centrale gedeelte met het zeepaardje door het verwijderen van alle weefsels caudal naar de dwarse horizontalis en rostraal van de fimbria isoleren. Twee sneden langs het dwarsvlak (d.w.z. coronale segmenten) maken met een rechte scheermes.
- Brengt de hersenen ' s caudal-meeste vliegtuig naar het midden van een vibratome snijden bad met Cyanoacrylaat lijm.
- Toevoegen ijskoud, carbogen aCSF tot de vibratome snijden bath borrelen en plaats de nylon retentie hardware binnen.
- Gesneden 300 μm dikke sneden te verkrijgen van 3 tot en met 4 bruikbare segment preparaten per halfrond (6 tot 8 totaal).
- Isoleren van een zeepaardje of corticale sectie van een halfrond en trim van het segment, zodat het past binnen de microcoil ' s 5 mm diameter weefsel goed.
4. Plaatsing en perfusie systeem vergadering proeven
- Coil voorbereiding
- vullen de microcoil ' s weefsel kamer met zuurstofrijk aCSF van de vibratome ' s snijden bad met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Neemt de bijgesneden hersenen monster en de positie van de regio van belang (bijv. piramidale cellaag) over de microcoil met behulp van een ontleden scope.
- Invoegen het weefsel borginrichting (nylon gaas netto op nylon ring aangebracht) om monster positie gedurende het gehele experiment imaging te behouden.
Opmerking: Ga snel door het monster positionering van de procedure om te minimaliseren van de blootstelling aan intens licht. Voorzien van extra zuurstofrijk aCSF, zo nodig met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Monteren van de in-boring oxygenator, de microcoil en de sonde
- zorgen voor de vergadering van de gewijzigde microcoil ( Figuur 3) op een Tafelklem en brengt het in loop oxygenator apparaat door het invoegen van de Acetaal ondersteuning PIN in het gat op de top van de spoel.
- Zegel van de perfusie-systeem door het plaatsen van de perfusie-zaal over de microcoil ' s weefsel goed en cinching van de twee samen met behulp van een miniatuur Kabelbinder.
- Trim de lengte van de overtollige vanaf de kabelbinder met behulp van wire cutters.
Opmerking: Op succesvolle afdichting, perfusaat nageleefd moet worden verlaten via de uitstroom regels en geen lekkage moet duidelijk rond het silicone zegel van de perfusie-kamer. Niet bevestigen deze voorwaarden voorafgaand aan de vergadering van de sonde kan leiden tot ernstige schade aan hardware imaging. - Zodra aCSF kan worden gezien in het afval reservoir druipen, neem de microcoil en oxygenator en bevestig de vergadering aan de bovenkant van het lichaam sonde beeldvorming.
- De kleurovergang stack schuif over de vergadering en zitting van het verloop op de top van de sonde. Foto's betreffende de relatieve plaatsing en het juist aansluiten van spoel, oxygenator en sonde hardwarecomponenten zijn bedoeld als ( Figuur 4).
5. Uitvoeren van de heer foto collectie
- Invoegen de geassembleerde sonde in de magneet droeg
- plaats het lichaam van de sonde in de nabijheid van de spectrometer droeg opening aan de onderkant van de magneet.
- Intrekken van de overtollige lengte van perfusie lijnen door de opening aan de bovenkant van de magneet boring.
- Zodra alle van de toegestane vertraging heeft overgenomen van de perfusie-lijnen, vooraf het lichaam van de sonde in de magneet droeg aan de voet terwijl tegelijkertijd meer speling te verwijderen uit de perfusie lijnen vanaf de bovenkant van de boring.
- Schroef de twee beveiligen schroeven aan de voet van de sonde in de overeenkomstige sleuven van de stack shim.
- Voordat u verdergaat, controleren dat perfusie lijnen niet geknepen of opgerold tijdens het inbrengen van de sonde door het bevestigen van aCSF uitstroom in het afval reservoir.
Opmerking: Niet bevestigen perfusaat uitstroom kan leiden tot permanente schade perfusie lijnen en risico's catastrofale schade aan MR imaging hardware. - Ingeval geen perfusaat is gezien de retourregel verlaten in het afval reservoir, het lichaam van de sonde te verwijderen en bevestigen dat deze stroom heeft hervat voordat u probeert herintegratie. Een schematische lay-out van de geassembleerde perfusie systeem en imaging spectrometer is eerder beschreven 8.
- De sonde lichaam aansluiten
- hechten van de instroom en uitstroom water lijnen van de kleurovergang chiller.
- Zet de pomp voor de kleurovergang chiller en bevestig de water temperatuur instelling (19 ° C).
- De luchtslang vanuit de lucht chiller unit toevoegen aan het lichaam van de sonde met behulp van een slangklem.
- Draai van de stroom-knop op de lucht chiller unit aan de " 1 " standpunt.
- De Thermokoppeldraad hechten aan het lichaam van de sonde.
- De coaxkabel uit de voorversterker toevoegen aan de radiofrequentie (RF) input/output op het lichaam van de sonde ' s proton (H) kanaal.
- Het netsnoer uit de gradiënt versterkers toevoegen aan het lichaam van de sonde.
- Inside the RF kabinet, de macht om de B0 compensatie eenheid, alle drie gradiënt versterkers (x, y, z), en de master apparaat inschakelen
- Voorbereiden van de Spectrometer
- de temperatuur van de beoogde boring met behulp van de variabele temperatuur aanpassing module aan de console instellen.
- Wedstrijd (impedantie) en tune (frequency) de RF circuit door de variabele condensatoren binnen de sonde aan te passen. Dit wordt bereikt door het manipuleren van de wands aan de voet van de sonde lichaam.
- De huidige instellingen aanpassen voor de spectrometer ' s shim spoelen te maximaliseren van de homogeniteit van het magnetisch veld in het monster.
- Beginnen foto collectie
- verzamelen pilot beelden om de ruimtelijke positie van uw monster binnen de magneet droeg. Typische parameters voor een twee dimensionale gradient echo zijn als volgt (TR/TE = 100/4 ms, gemiddelden = 1, pulse hoek = 30 o, tijd = 6 sec, matrix = 64 x 64, gezichtsveld = 0,3 x 0.3 cm, resolutie = 47 x 47 μm).
- Verzamelen diffusie-gewogen piloten om goede scan geometrie en weefsel standpunt bevestigen indien van toepassing. Typische parameters voor een twee dimensionale diffusie-gewogen pilot scannen zijn als volgt (TR/TE = 2000/11,6 ms, tijd = 4.3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gemiddelden = 1, b = 1200 (1860 effectief) s/mm 2, matrix = 64 x 64, gezichtsveld = 0,2 x 0,2 cm Resolutie = 31 μm).
- Verzamelen een tijdreeks met diffusie-gewogen, om te bepalen van de kenmerken van de stabiliteit van het preparaat acute segment. Typische parameters voor een twee dimensionale diffusie gewogen beeld zijn als volgt (TR/TE = 2000/11,6 ms, tijd = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gemiddelden = 42, b = 1200 s/mm 2, matrix = 64 x 64, gezichtsveld = 0,2 x 0,2 cm, resolutie = 31 μm). Opmerking: Karakterisering van stabiliteit in een bepaald systeem zal variëren van het beschreven protocol afhankelijk van factoren zoals de heer contrast werkzaam (b.v. T1, T2, diffusie, gevoeligheid), de fysieke perturbation bestudeerd, en de heer signaal verandering per tijdseenheid Als gevolg van zei perturbation.
Representative Results
Deze voorbereiding
Op de succesvolle werkgelegenheid van het apparaat in-boring oxygenatie, zal gassen aanwezig zijn in de meegeleverde carbogen 100% verzadiging voorwaarden binnen het perfusaat aCSF bereiken. Dit kan worden aangetoond door het variëren van de zuurstofconcentratie van het geleverde gas en het meten van de verandering in het gehalte aan opgeloste zuurstof in de aanwezigheid van aCSF in de vergaderzaal van de perfusie met een zuurstof meter (Figuur 1)8. Volgens Hendriks de wet is de hoeveelheid opgeloste gas dat in evenwicht met een vloeibare steekproef recht evenredig met de gedeeltelijke druk van dat gas mits de temperatuur constant12 blijft. Met deze kennis en precisie gas-normen, is het mogelijk te kwantificeren van de hoeveelheid opgeloste zuurstof opgenomen binnen een aCSF monster zoals beschreven. Dit wordt bereikt door het kalibreren van de zuurstofmeter met behulp van verzadigde oplossingen (direct borrelen voor 1 uur of meer) van aCSF worden blootgesteld aan gassen van bekende samenstelling: een gas met hoge zuurstofconcentratie zoals carbogen (95% O2) en andere met lage zuurstof concentratie zoals stikstof (0% O2). Daarna, kunnen metingen worden verricht door de tip van de zuurstof-elektrode ondergedompeld in een steekproef. Bevestiging dat de in-boring oxygenator naar behoren functioneert kan worden bereikt door het meten van het afvalwater van de perfusie goed. Het percentage opgeloste zuurstof zoals gemeten door de zuurstofmeter moet overeenkomen met de percentage concentratie zuurstof in de levering gas geleverd. Als de gemeten waarden lager dan die in het aanbod gas zijn, stel dit een hardwarefout is opgetreden dat tot metabole insufficiëntie in het segment van het weefsel leiden kan.
Monster uiterlijk en gedrag
Acute segment preparaten die perfusie voldoende ontvangen te leveren van de nodige metabolieten en weg metabolische afvalstoffen snel bereiken een toestand van relatieve stabiliteit. Vanaf dat moment acute segmenten kunnen worden onderworpen aan externe perturbation en hun reacties op deze veranderingen kunnen worden gemeten voor wetenschappelijk onderzoek. Voor de heer experimenten is het bijhouden van het signaal van belang na verloop van tijd een veelgebruikte praktijk om aan te tonen van de relatieve stabiliteit van acute segment preparaten13. De diffusie-gewogen signaal is met name gevoelig voor veranderingen in een weefsel van water mobiliteit, inhoud, en distributie, zoals kan worden gewaardeerd door het gebruik van dit mechanisme contrast te detecteren infarcten in ischemische beroerte14,15. Uitzetten van het signaal van de genormaliseerde verspreiding na verloop van tijd in acute corticale plakjes stand gehouden op een verscheidenheid van perfusie voorwaarden blijkt relatief stabiliteit (2 ± 3% meer dan 15,5 h) nadat weefsel isolatie wordt bereikt (Figuur 5). Diffusie signaal stabiliteit was gewaarborgd blijft, ongeacht de perfusie voorwaarden (intermitterend of continu) of MRI scan lengte (korte [4 min] of lange [1,5 h])8. Als segmenten geen signaal stabiliteit vertonen na verloop van tijd, zoals de verhoging van de scherpe diffusie-signaal waargenomen in levende cortex die geen perfusie, is dit suggestief suboptimaal experimentele omstandigheden. Perturbation experimenten moeten niet worden geprobeerd vóór bevestiging van stabiele signaalcondities in segment preparaten.
Naast signaal stabiliteit, moet juiste monster positionering bevestigd worden op het moment van de foto collectie. Hoewel de positie van de steekproef wordt gecontroleerd tijdens de plaatsing van het weefsel op de ontleden Microscoop, kunnen verschuivingen in monster positie optreden tijdens de vergadering van de perfusie-apparaat, of als gevolg van de ruwe behandeling van de spoel of de sonde vóór opneming in de magneet. Bevestiging van de juiste plaatsing van de hippocampal kan worden bereikt door het verzamelen van kort (2 min), piloot scant met diffusie contrast (Figuur 6). Omdat de piramidale cellaag gevoeliger voor verspreiding weging dan het aangrenzende hippocampal laminae is, verschijnt deze structuur als een donkere band in diffusie-gewogen beelden. Opstellingen die dit kenmerk niet weergegeven uit het midden monsters bevatten en zal waarschijnlijk behoeven te worden herhaald.
Figuur 1: Opgeloste zuurstofgehalte van aCSF perfusaat als een functie van procent O2 inhoud in geleverde gas. Mengsels van variabele concentraties van zuurstof (95%, 60% en 19%) van de Carbogen als een levering gas werkzaam zijn. Percentage opgeloste zuurstof lezingen zijn genomen uit de perfusie ook en in vergelijking met twee bekende besturingselementen: een reservoir perfusaat borrelen direct met carbogen (95% O2), en een reservoir van de perfusaat blootgesteld aan weersomstandigheden (23% O2 ). In elk geval, het percentage zuurstof verzadiging op de site van weefsel perfusie benaderingen 100% van de O-2 -concentratie in het mengsel van de carbogen gebruikt. Foutbalken zijn gelijk aan de standaarddeviatie van de steekproefgemiddelden aangeeft. Figuur overgenomen met toestemming van het oorspronkelijke artikel8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische tekening van de in-boring oxygenator en perfusie kamer. Dit diagram toont gedetailleerde ontwerpelementen die verantwoordelijk is voor de functie van deze kritieke apparaten. Verse perfusaat die heeft gepompt door middel van een waterventiel treedt de oxygenator via de top van een 10 mm NMR buis. Daarbij het overgaat in een gas zeer doorlaatbare silicone buis (blauwe segment) die rond de buis van een open, 5 mm NMR is spiraalsnoer genest binnen. Carbogen gas geleverd door de top van de 5mm buis treedt de kamer via de open bodem en gaat voorbij aan de opgerolde silicone slang vóór het verlaten van de oxygenator door een vent gat in de dop van de tube 10 mm. Tijdens deze blootstelling, is het perfusaat stroomt door de Siliconen slang met de chemische bestanddelen van het gasmengsel van de meegeleverde verzadigd. Bij het afsluiten van de oxygenator, stroomt perfusaat rechtstreeks in de perfusie-zaal alvorens de retourregel leiden tot een reservoir afvalinzameling. Andere onderdelen die essentieel zijn voor dit ontwerp bevatten de Acetaal ondersteuning peg waarmee de oxygenator te staan verticaal boven de gemodificeerde RF microcoil, een silicone ring (rode ring) die de vloeistofdichte zegel Killary Harbour tussen de de oxygenator perfusie kamer vormt en van het microcoil weefsel goed, en de kabelbinder inkeping die geschikt is voor plaatsing van een kabelbinder gebruikt om te vormen van dit omkeerbare zegel. Dit cijfer is gewijzigd en gereproduceerd met toestemming van het oorspronkelijke artikel8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: wijzigingen aan de vergadering van de microcoil die het mogelijk maken van interface naar de in-boring oxygenator. Twee groeven 3.0 x 1.5 mm (zwarte pijlen) werden gesneden in de zijkant van de vergadering die aangepast aan de breedte van een kabelbinder gebruikt voor het afdichten van de perfusie-zaal. Een kanaal (15 x 3 x 4 mm) verbindt de ' Groves ' in het achteraanzicht van de spoel. Twee nylon ruimten geplaatst in de zijkanten van de act van het kanaal (rode pijlen) als een vangst voor de kabel stropdas hoofd die de verzegeling procedure verlicht. Een boorgat (2 x 14 mm) in de top van de vergadering van de spoel (gele arrOW) ondersteunen joins aan de Acetaal peg om de oxygenator veilig te stellen. Dit cijfer is gewijzigd en gereproduceerd met toestemming van het oorspronkelijke artikel8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: foto montage detaillering van de relatieve plaatsing en de juiste samenstelling van microcoil, oxygenator en sonde onderdelen. Deze beelden zijn voorzien van belangrijke hardwareonderdelen van de in-boring oxygenator en microperfusion apparaat en illustreren hoe de afzonderlijke onderdelen communiceren met elkaar. (A) geëxplodeerde-weergave foto toont de relatieve plaatsing van alle onderdelen voordat het afdichten van het weefsel goed of samenstel van het lichaam van de sonde. Zorgvuldigheid is betracht om weer te geven van de relatieve locatie van delen nauwkeurig; echter is een deel van de perfusie-lijnen verdubbeld terug in deze serie zodat alle onderdelen binnen het frame van de afbeelding passen. (1 = sonde head, 2 = microcoil assemblage, 3 = nylon weefsel retentie ring, 4 = perfusie goed, 5 = Kabelbinder, 6 = in loop oxygenator, 7 = kleurovergang opgerold, 8 = waterventiel). (B) onderdelen na spoel en oxygenator montage. In dit beeld, is de nylon retentie ring geplaatst binnen de microcoil van weefsel goed te beveiligen van een steekproef. De peg Acetaal ondersteuning op basis van de oxygenator is verzekerd in de overeenkomstige gat op de top van de microcoil. De siliconen pakking op het open uiteinde van de perfusie goed is geplaatst dan het weefsel goed, en een kabelbinder is strakker geworden rond deze onderdelen te verzegelen de perfusie-zaal. Tot slot, de basis van de microcoil is verbonden met de bovenkant van het hoofd van de sonde. (C) onderdelen na montage van de sonde. In het laatste deelvenster is overtollige lengte vanaf de kabelbinder ingekort flush met de microcoil. De kleurovergang spoel stack is het vervolgens gleed in positie door zorgvuldig de cilinder naar de sonde terwijl de overtollige perfusie lijnen, oxygenator en microcoil passeren met zijn holle centrum. Zodra de hellingen zijn verbonden aan het hoofd van de sonde, zijn ze op zijn plaats gehouden door de schroeven van de beveiligen kraag op de sonde over de schroefdraad voet van de hellingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: diffusie signaal stabiliteit in superfused acute corticale plakjes. (A) Normalized diffusie signaal waarden in vier acute plakjes onderworpen aan verschillende paradigma superfusion's zijn uitgezet na verloop van tijd voor een periode van maximaal 21.5 h na euthanasie. Segmenten blijven binnen ± 5% van hun aanvankelijke diffusie signaal meting gedurende een periode van 15,5 h na euthanasie ongeacht of superfusion is continu of intermitterend en onafhankelijk zijn van de heer scan lengte (1,5 h of 4 min). Signaal opnames ontleend aan formaldehyde-vaste cortex dienen als positieve controle (n = 1) voor stabiliteit als gevolg van de statische, onveranderlijke aard van vaste weefselmonsters. Omgekeerd, diffusie signaal gemeten in een levende segment afwezig van superfusion ondersteuning (n = 1) fungeert als een besturingselement voor metabole deficiëntie. Experiment parameters van de verschillende superfusion proeven zijn als volgt: continu (superfusion altijd op, tijd per scan = 1,5 h), intermitterende (superfusion op voor 10 min interval tussen scans, tijd per scan = 1,5 h), lange interval, lange scan (superfusion op tijdens het scannen, maar onderbroken gedurende 10 minuten tussen scans, tijd per scan = 1,5 h), interval lang, korte scan (superfusion op voor 1,5 h interval tussen scans, tijd per scan = 4 min.). (B) de gegevensgroep weergegeven: Analyzed betekent van de vier live-delige superfusion experimenten van deelvenster (A). De verspreiding profiel signaal van de gegroepeerde, superfused corticale segmenten vertoont weinig variatie na verloop van tijd (2 ± 3% meer dan 15.5 h) Overwegende dat de controle van niet-geperfundeerd (n = 1) vertoont dramatische signaal instabiliteit in het begin van het experiment (15% door 6.5 h). Dit cijfer is gewijzigd en gereproduceerd met toestemming van het oorspronkelijke artikel8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: bevestiging van plaatsing van de hippocampal segment tijdens de pilot imaging. Voordat u een uitgebreide heer microscopie sessie, correcte plaatsing van het monster is kritisch om bronnen zoals scannertijd en dure perfusaat additieven niet verloren gaan. De piramidale cellaag CA1 regio van de hippocampus kunnen worden gevisualiseerd in sneller (4.3 min), lagere resolutie (31 μm x 31 μm in-plane) pilot scans om ervoor te zorgen dat het weefsel van belang op de juiste wijze is geplaatst ten opzichte van de micro-spoel. De parameters van de scan gemeen hebben beide afbeeldingen zijn als volgt: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, gemiddelden = 1. (A) b = 0 (227 effectieve) s/mm2. In dit voorontwerp scan is de stratum pyramidale pas zichtbaar als een grijs, diagonale band gecentreerd in de spoel van excitatie profiel. (B) b = 1.200 (1,860 effectief) s/mm2. Bij hogere diffusie weging, interlamellar contrast toeneemt naarmate de piramidale cellaag donkerder dan weefsels in de aangrenzende laminae wordt (boven: stratum oriens; hieronder: stratum radiatum). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft procedures voor standaard metabole onderhoud van acute hersenen segment preparaten magnetische resonantie microscopie ondergaan. Deze procedure is de enige methode die momenteel beschikbaar waarmee de visualisatie van levende zoogdieren weefsels met MIJNHEER bij resoluties staat te oplossen van cellen. Terwijl het perfusaat voorwaarden beschreven worden zijn speciaal afgestemd op centrale zenuwstelsel weefsels, het protocol is sterk aan te passen aan een manier van leven weefsel voorbereiding door aanpassingen van perfusaat en gas-bestanddelen, alsmede perfusie debiet en temperatuur.
De meest voorkomende problemen kunnen worden ondervonden tijdens de beschreven procedures omvatten die verband houden met fouten in het aanbod van de metaboliet. Neerslag van calciumzouten kan optreden binnen de aCSF tijdens de gasvormige insufficiëntie ten gevolge van storingen in het systeem buffer bicarbonaat. Dergelijke precipitaten kunnen verstoppen de perfusie-lijnen en leiden tot beschadiging van de ernstige hardware. Als zout precipitaten worden waargenomen in het perfusaat na montage van de sonde, ophouden perfusie stroom onmiddellijk door het uitschakelen van de peristaltische pomp. Aanwezigheid van voldoende natriumbicarbonaat niveaus (4,37 g/2 L) in perfusaat, CO2 niveaus (5,0%) in levering gas en carbogen gasstroom (1/16 L/min) in zowel reservoir en oxygenator bevestigen. Tot slot bevestigen pH niveaus zijn gestabiliseerd in de fysiologische bereik (7.3-7.4). In het geval dat zuurstof gas- en pH-niveaus zijn nog niet op de juiste manier geregeld, moet de gasuitwisseling membraan worden vervangen.
Als segmenten in de beoogde experimentele tijd-loop geen signaal stabiliteit vertonen, bevestigen dat de juiste chemische bestanddelen in het aCSF mengsel aanwezig zijn en dat de juiste osmolaliteit (300 mOsm) en de pH (7.3-7.4) worden gehandhaafd. Controleer ook carbogen gas wordt geleverd aan het perfusaat reservoir en oxygenator op 1/16 L/min. Als deze stappen niet de juiste perfusaat voorwaarden, wordt vervanging van de gasuitwisseling membraan geadviseerd. Weefsel stabiliteit, niet wordt bereikt na het oplossen van problemen met het perfusaat voorwaarden Overweeg verfijning van het chirurgische protocol met een focus op het minimaliseren van het tijdsinterval tussen weefsel oogst en perfusie toepassing.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), en de National Science Foundation (samenwerkingsovereenkomst nr. DMR-1157490) via de faciliteit van het nationale laboratorium voor hoog magnetisch veld (NHMFL) geavanceerde Magnetic Resonance Imaging en spectroscopie (AMRIS) op UF en de staat Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
