G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Resumo

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

Resumo

Inúmeras técnicas têm sido desenvolvidas para acompanhar o progresso da replicação do DNA através da fase S do ciclo celular. A maioria destas técnicas tem sido direcionada para elucidação do local e hora de início da duplicação do genoma, ao invés de sua conclusão. No entanto, é fundamental que nós entendemos de regiões do genoma que são última para concluir a replicação, porque essas regiões sofrem níveis elevados de quebra cromossômica e mutação, e eles têm sido associados com doenças e envelhecimento. Aqui descrevemos como nós estendemos uma técnica que tem sido usada para monitorar a iniciação de replicação para em vez disso, identificar as regiões do genoma última a replicação completa. Esta abordagem é baseada em uma combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento. Embora este relatório centra-se sobre a aplicação desta técnica a levedura, a abordagem pode ser usada com qualquer uma das células que pode ser classificada em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA.

Introdução

Replicação do genoma eucariótico é iniciada em vários locais discretos, chamados origens de replicação, de que a replicação garfos procedem em ambas as direções (revistas em Fragkos et al, 2015¹). Origens variam em seu tempo e a eficiência de queima, e várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar a atividade de origem de replicação e elucidar as causas desta variação. A atividade de origens individuais pode ser inferida níveis de single-stranded DNA², que se forma em torno de origens ativas, ou por meio de eletroforese em gel 2D para monitorar a replicação específico intermediários³....

Protocolo

1. preparação de células para Flow Cytometry classificação

1. Inocular tubos de ensaio de 15 mL contendo 8 mL de caldo YEPD tal que as culturas atingem uma densidade de 5 x 10⁶ a 1,5 x 10⁷ células / mL após crescimento durante a noite (ver discussão Nota 1).
2. Spin para baixo de células de levedura (1.400 x g, à temperatura ambiente ou 4 ° C) em um tubo de centrifugação de tampa de rosca 15 mL por 5 min, Ressuspender as células em 1,5 mL de etanol a 70% e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mL, deixando este sentar-se por 1h à temperatura ambiente ou pelo menos 3 h no gelo ( podem ser armazenados indefinidamente a 4 °....

Resultados

Temos utilizado o procedimento descrito acima para identificar sites replicação finais no fermento de brotamento. Esta abordagem usando uma região de replicação final conhecida em um cromossomo artificial de teste provou a técnica para ser precisa e confiável. Nossos resultados também demonstraram a importância biológica da conclusão atempada da replicação, mostrando que uma tarde região replicam no cromossomo 7, que identificamos como replicação final com base nos nossos resultados de G2.......

Discussão

Enquanto esta técnica é robusta e relativamente direta, deve ser prestada especial atenção ao seguinte:

(1) recomendamos que culturas crescem pelo menos 12 h antes que eles atinjam a fase de registo, desde que diferenças se manifestar no ciclo celular distribuições se culturas são colhidas após ter alcançado a densidade desejada apenas 4 h após a inoculação. Nossa suposição é que uma distribuição de ciclo celular que atingiu um equilíbrio relativamente estável melhor representa uma distribuiçã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de DNA Genômico YeaStar	Genesee Scientific	11-323
1 µ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	ressuspender em 50 mM de citrato de sódio, pH 7,2
50 mM de citrato de sódio, pH 7,2
Solução de RNase (0,25 mg / mL)	Sigma	R6513	0,25 mg / mL RNaseA ressuspenso em 50 mM de citrato de sódio, pH 7,2, ferver a solução de RNase por 10 minutos antes do primeiro uso apenas, e a partir daí armazenar a -20°
solução de proteinase K (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	ressuspende em 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% de glicerol, armazenar a -20° C
Modelo 50 Desmembrador Sônico	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Colunas Zymo-spin III	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA Kit de Ensaio HS	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorômetro	ThermoFisher	Q33216
Covaris Modelo LE220 Ultrasonicator Focado	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Kit de Preparação de Amostras	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500	instrumento Illumina	SY– 401– Software de alinhamento 2501
gsnap	software de código aberto / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap