Summary
ويصف هذا البروتوكول وضع في المختبر البشري السريري نموذج من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف مع خطوط خلايا سرطان الثدي لمحاكاة التفاعل اوستيوكلاست خلايا السرطان. يمكن استخدام النموذج زيادة فهمنا لتكوين ورم خبيث العظام وتحسين الخيارات العلاجية.
Abstract
الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام في المكروية العظام أمر حاسم لفهم إليه تكوين ورم خبيث العظام. لقد طورنا في المختبر بشرية الكامل السريري نموذجا لثقافة المشارك من خلايا سرطان الثدي ووحيدات تمر التمايز تجاه الآكلة. نحن الأمثل نموذج أوستيوكلاستوجينيسيس بدءاً من عينة دم التي جمعت من الجهات المانحة صحية. أول مرة مفصولة بكثافة التدرج الطرد المركزي خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس)، والمصنف في كثافة عالية والمستحث للتمييز عن طريق إضافة اثنين من عوامل النمو (GFs): المنشط مستقبلات النووية عامل-κB يجند (رانكل) وبلعم عامل تحفيز مستعمرة (مكسف). الخلايا كانت تترك في الثقافة لمدة 14 يوما وثم الثابتة وتحليلها بواسطة تحليل المتلقين للمعلومات. في الانبثاث العظام عظمية، من آثار وصول خلية سرطان في العظام، تحريض أوستيوكلاستوجينيسيس. وبالتالي نحن تحدي نموذجنا مع الثقافات المشارك من خلايا سرطان الثدي لدراسة قوة تمايز الخلايا السرطانية فيما يتعلق بإحصاءات المالية الحكومية. طريقة مباشرة لدراسة سرطان خلايا اوستيوكلاست التفاعل لأداء الثقافات المشارك غير مباشر استناداً إلى استخدام مكيفة المتوسطة التي تم جمعها من الثقافات الخلية في سرطان الثدي ومختلطة مع متوسطة جديدة. ثم يستخدم هذا الخليط للحث على التمايز اوستيوكلاست. ونحن أيضا الأمثل طريقة مباشرة الثقافة المشارك فيها السرطان في الخلايا ووحيدات تمر التمايز تقاسم المتوسطة وتبادل يفرز عوامل. هذا تحسن كبير على أسلوب ثقافة المشاركة غير المباشرة الأصلية كما يمكن مراقبة التفاعلات المتبادلة لأنواع الخلايا اثنين الباحثين وإجراء تحليلات المتلقين للمعلومات لكل من خلايا السرطان والأكلة. هذا الأسلوب يتيح لنا لدراسة تأثير الأدوية على المكروية العظام المنتشر وخطوط الخلايا البذور غير تلك المستمدة من سرطان الثدي. يمكن أيضا استخدام النموذج لدراسة أمراض أخرى مثل هشاشة العظام أو غيره من الظروف العظام.
Introduction
العظم موقع مشترك لورم خبيث لأنواع مختلفة من الأورام الأولية مثل سرطان الثدي والبروستاتا، والرئة، مع 20-25% مرضى تطوير الانبثاث العظام أثناء المرض1،،من23. على وجه الخصوص، تحمل 70 في المائة مرضى سرطان الثدي دليل على عظم ورم خبيث في وفاة4. الورم والخلايا اللحمية التفاعل ضروري لتطور السرطان في سرطان الابتدائي والثانوي الآفات. في المكروية العظام، الانبثاث العظام عظمية من سرطان الثدي تعتمد على إنشاء دائرة مفرغة المرضية التي تحدث بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام المكروية العظام. الخلايا السرطانية زعزعة التوازن العظام، وزيادة العظام ارتشاف5،،من67.
في الظروف العادية والمرضية، هي الآكلة الخلايا المسؤولة عن ارتشاف العظام، بينما خلايا الاوستيوبلاستس، في إيداع مصفوفة جديدة، المسؤولة عن تكوين العظام الجديدة8. وينظم نشاط اوستيوكلاست خلايا الاوستيوبلاستس من خلال التعبير عن رانكل، الذي تربط به مستقبلات مرتبة على سطح اوستيوكلاست قبل، حمل اوستيوكلاست قبل الانصهار، عملية ضرورية للتمايز في الآكلة ناضجة. ويزيد تحريض أوستيوكلاستوجينيسيس ارتشاف العظام. عدد كبير من الدراسات في فيفو تحسنت كثيرا أن فهمنا لعظم خبيث تشكيل9،،من1011. خلايا سرطان الثدي من الورم الرئيسي وفي المكروية العظام التشويش التوازن العظام، تعزيز أوستيوكلاستوجينيسيس والعظام ارتشاف8. في هذا السيناريو، يتم كل الجزيئية التفاعلات التي تحدث بين خلايا السرطان والأكلة ذات أهمية حاسمة. وكما سبق ذكره، وقد تم توضيح إليه تكوين ورم خبيث العظام في فيفو نماذج الفئران. ومع ذلك، بالإضافة إلى الحاجة إلى الموافقة على جميع في فيفو التجارب على الحيوانات "لجنة الأخلاقيات"، هناك عدة عيوب أخرى لإجراء تجارب في فيفو بما في ذلك ارتفاع التكاليف وتستغرق وقتاً طويلاً من أساليب. وقد تضافرت العديد من المؤلفين نماذج في الجسم الحي وفي المختبر الإكلينيكية من أوستيوكلاستوجينيسيس استخدام خط مورين من قبل الآكلة تسمى RAW246.79،،من1011. المآخذ على هذا الطراز تنبع من حقيقة أن الخلايا ملتزمون بالفعل لأن تصبح الآكلة قبل وليسوا من أصل الإنسان. لهذه الأسباب، البحوث متعدية الجنسيات يمكن أن تستفيد كثيرا من التوافر في المختبر البشرية الكامل نماذج الإكلينيكية لدراسة التفاعلات بين خلية سرطان العظام.
نحن الأمثل طريقة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر بدءاً من عينات الدم المحيطي البشري12،13. وتستمد الآكلة وحيدات، التي موجودة، أن كان ذلك بدرجة صغيرة، في عينات الدم المحيطي. الخلايا وحيدات النوى مفصولة أولاً من الكريات الحمراء والمحببة في الدم كله بالتدرج فيكول الكثافة؛ ثم يتم اختيارهم بفضل قدرتها على الانضمام إلى الركازة البلاستيكية، خلافا للخلايا الليمفاوية. بعد البذر، تستزرع خلايا لمدة 14 يوما. مكسف ورانكل هي إحصاءات المالية الحكومية تتطلبها وحيدات التفريق أولاً إلى الضامة ثم إلى الآكلة14،15. مكسف المسبق لكامل مدة الفحص، بينما يستخدم رانكل لحفز عملية التمايز في المراحل المتأخرة من أوستيوكلاستوجينيسيس. في المرحلة المبكرة من التمايز، يساعد مكسف وحيدات تتكاثر والبقاء على قيد الحياة14،15. خلال الجزء الثاني من أوستيوكلاستوجينيسيس، خلايا تلتحم معا وناضجة الآكلة، لائحة توزيع مميزة "و الأكتين" في حلقات والإعراب عن علامات معينة مثل طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) ومستقبلات كالسيتونين (الظهور) 14 , 15-يتكون لدينا طريقة من إضافة مكسف لثقافة الوحيدات الأيام السبعة الأولى من التجربة، ومزيج من مكسف ورانكل من 7 إلى 14 أيام. في نهاية هذه التجربة، هو تحليل أوستيوكلاستوجينيسيس بواسطة عد الخلايا المتمايزة، كما هو مفصل أدناه.
الثقافات الوحيدات التي يسببها للتفريق بإحصاءات المالية الحكومية تشكل الأساس لنموذجنا الإكلينيكية. نحن الأمثل نظام ثقافة المشارك دون إحصاءات المالية الحكومية فهم أفضل للسلطة أوستيوكلاستوجينيك من خلايا سرطان الثدي. قمنا بتطوير نموذج للثقافات المشاركة غير المباشرة أولاً بإضافة وسيلة (α 80%-"الحد الأدنى الأساسية المتوسطة" (α-الفنزويلية) ومتوسطة 20% مكيفة جمعت من ثقافة خلايا سرطان الثدي أن كانت حوالي 90% روافد للخلايا تمر بالتمايز12 . المتوسط مكيفة (لا تجمع تحت ظروف الحرمان المصل) جمعت بعد 24 ساعة ومختلطة مع متوسطة جديدة في نسبة من 1:4. المتوسطة مكيفة الناجمين عن التمايز اوستيوكلاست هامة فيما يتعلق بمراقبة سلبية. ومع ذلك، كما يتم فقدان المعلومات حول التفاعل المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام عند استخدام الثقافات المشاركة غير المباشرة، نحن تحسين نظامنا بالاضطلاع بالثقافات المشاركة المباشرة. نحن المصنف الخلايا السرطانية في 0.4 ميكرومتر بإدراج ووضعتهم في الآبار حيث كانت مطلي بالخلايا وحيدات النوى. باستخدام هذا الأسلوب، خلايا تتقاسم نفس المتوسط وتبادل البروتينات يفرزها. وهكذا أنشأنا نموذج الإكلينيكية بشرية الكامل من أوستيوكلاستوجينيسيس الناجمة عن سرطان خلايا13.
هذا النظام هو مرنة للغاية ويمكن استخدامها لأغراض بحثية مختلفة، مثلاً، في الدراسات الدوائية التحقيق في دور المخدرات في الانبثاث العظام. لدينا نموذج يجعل من الممكن لدراسة فعالية وآليات عمل العلاجات المستهدفة للعظام و/أو المخدرات انتيتومور في المكروية العظام وجود خلايا السرطان13. تصميم التجارب مع الضوابط الصحيحة، أي، خلايا السرطان والأكلة مثقف فردي، يسهل فهم تأثير الثقافة المشارك في نشاط المخدرات. ويصبح هذا النهج حتى أكثر إثارة للاهتمام عندما يستهدف المخدرات تجري دراسة كل سرطان خلايا والأكلة، مثلاً، افيروليموس16. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتحديد مسارات جديدة للتفاعل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الآكلة البشرية كانت متباينة من ببمكس صحية من الجهات المانحة الذي أعطى الموافقة الخطية على المشاركة في الدراسة. وأقر البروتوكول دراسة "لجنة الأخلاقيات" المحلية، وفقا للمعايير الأخلاقية المنصوص عليها في "إعلان هلسنكي" عام 1964-
1-"التمايز اوستيوكلاست"
ملاحظة: جمع الدم المحيطي أو المعاطف بافي من المانحين بشرية صحية في يدتا. لا تستخدم أقل من 20 مل دم المحيطي. معاطف بافي الأفضل لأن لديهم وفرة أكبر من الخلايا وحيدات النوى. تنفيذ كافة الخطوات التالية في غطاء زراعة الأنسجة معقمة.
- الدم كله "يدتا تمييع" 1:1 مع 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). إعادة تعليق جيدا.
- طبقة على وسائط فصل اللمفاويات (الدم PBS: اللمفاويات فصل وسائط الإعلام، 2:1) في أنابيب 50 مل.
- "الماصة؛" 30 مل دم المخفف في برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل.
- بلطف تقوم عليها 15 مل من اللمفاويات فصل الوسائط في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (لا الفرامل) في 757 × ز.
- جمع الخلايا وحيدات النوى:
- جمع طبقة بيضاء من الخلايا وحيدات النوى مع ماصة 5 مل دون التحريض ووضعه في أنبوب 50 مل جديدة-
- تمييع ببمكس التي تم جمعها مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
- الغسيل ببمكس:
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 225 x ز.
- تجاهل المادة طافية بعكس الأنبوب. كرر مرة واحدة.
- تحلل ربك:
ملاحظة: إذا كان بيليه خلية أحمر، يعامل الخلايا مع خلايا الدم الحمراء ليسينج الحل المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد).- وضع أنبوب 50 مل في مدت
- إضافة 5 مل خلايا الدم الحمراء ليسينج المخزن المؤقت-
- الانتظار 3-5 دقائق لإتمام تحلل كرات الدم الحمراء. ويختلف الوقت تبعاً لدرجة التلوث بكرات الدم الحمراء.
- وقف رد الفعل بإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني. ز
- الطرد المركزي في 225 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية بعكس الأنبوب.
ملاحظة: اختياري: إذا كان يتم إجراء تحلل ربك، تغسل في ببمكس كما هو موضح أدناه.
- "ببمكس المياه والصرف الصحي":
- إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 225 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- تجاهل المادة طافية بعكس الأنبوب.
- إعادة تعليق الخلايا في كامل α-الفنزويلية (تستكمل مع الجلوتامين 1% (تركيز الأولى 100 X) و 10% مصل بقرى الجنين)-
- عد الخلايا بدائرة نويباور.
- تضعف عينة 1: 100 في حمض الخليك الجليدية واستخدام 10 ميليلتر من إضعاف لعد الخلايا.
- العد مرتين على الأقل، وحساب متوسط replicates للحصول على متوسط إجمالي عدد الخلايا التي تم جمعها-
- لوحة الخلايا:
- لوحة الخلايا بتركيز ببمكس 750,000 كل سم 2-
- تخزين خلايا مطلي في حاضنة في 37 درجة مئوية في جو 2 CO 5 ٪.
ملاحظة: تصميم التجربة تشمل عناصر السلبية، التي هي عبارة عن خلايا يتم التعامل مع العادي α-الفنزويلية كاملة دون مكسف أو رانكل GFs. تذكر لأداء كل شرط في مالا يقل عن 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة. أداء replicates البيولوجية على الأقل 3-
- تغيير المتوسطة وتستكمل مع إحصاءات المالية الحكومية:
- الانتظار حوالي 3 ح بعد البذر الخلية ثم قم بإزالة المتوسطة ماصة (200-1,000 ميليلتر) للتخلص من الحطام وفاتحة الخلايا والكريات الحمراء.
ملاحظة: كن حذراً عند تغيير وسيلة لتجنب الخلية المفرزة. - إضافة جديدة كاملة α-الفنزويلية وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من مكسف (500 ميليلتر في البئر).
ملاحظة: عندما يشترك استزراع خلايا السرطان، البذور السرطان خلايا اليوم بعد البذر ببمك.
- الانتظار حوالي 3 ح بعد البذر الخلية ثم قم بإزالة المتوسطة ماصة (200-1,000 ميليلتر) للتخلص من الحطام وفاتحة الخلايا والكريات الحمراء.
- تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام (α-الفنزويلية وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من مكسف):
- تجاهل المتوسطة بواسطة ماصة ميليلتر 200-1,000.
- إضافة جديدة متوسطة جديدة ماصة ميليلتر 200-1,000.
- 6-7 أيام بعد خلية البذر، بإضافة 20 نانوغرام/مليلتر من رانكل إلى α كاملة-MEM + مكسف-
- تغيير المتوسطة (α كاملة-MEM + مكسف + رانكل) كل 2-3 أيام:
- تجاهل المتوسطة مع ماصة ميليلتر 200-1,000. إضافة
- المتوسطة الجديدة مع 200-1,000 ميليلتر ماصة. وقف تحريض تمايز 14 يوما بعد خلية البذر.
- تجاهل متوسطة ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد:
- ترك الخلايا الجافة.
- إضافة بارافورمالدهيد 4 في المائة (انظر الجدول للمواد)-
- إينكوباتي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تجاهل بارافورمالدهيد ويغسل مرتين مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ يرجى ارتداء القفازات والقناع والنظارات الطبية- - تسمح للخلايا الجافة.
- "فخ أداء" تلطيخ وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s (انظر الجدول للمواد)-
- عد خلايا اوستيوكلاست تشبه يدوياً تحت المجهر بتكبير 10 ×؛ 0.30 غ.
ملاحظة: يتم تعريف خلايا اوستيوكلاست مثل كفخ + بوليكاريون الخلايا التي تحتوي على الأقل 4 أنوية.
2. سرطان الخلية الثقافات
ملاحظة: يمكن إجراء التجارب مع أنواع مختلفة من الثدي خطوط الخلايا غدية مثل SCP2 17، خط خلية أوستيوتروبيك مصدرها الإنسان السلبي الثلاثي خط خلية سرطان الثدي (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231)، والخط الهرموني إيجابية مستقبلات الخلية MCF7.
- الثقافة
- الخلايا كأحادي الطبقة في قوارير 75 سم 2.
- الخلايا السرطانية 1,000,000 البذور في قارورة 75 سم 2.
- تخزين الخلايا عند 37 درجة مئوية في المتوسط كاملة α-الفنزويلية تستكمل مع 1% الجلوتامين و 10% من مصل البقر الجنين في جو 2 CO 5%-
- فصل الخلايا في كونفلوينسي من حوالي 90%:
- تجاهل المتوسطة وتغسل ببرنامج تلفزيوني، وإضافة 2-3 مل التربسين 1 X في برنامج تلفزيوني.
- احتضان خلايا لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا المنفصلة من قارورة 75 سم 2 ماصة 10 مل، مشيراً إلى 8 مل متوسطة كاملة لوقف رد الفعل الأنزيمي.
- أجهزة الطرد المركزي في 225 x ز للحد الأدنى 5
- تغسل الخلايا السرطانية:
- إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- أجهزة الطرد المركزي في 600 x ز للحد الأدنى 5
- عد الخلايا السرطانية بدائرة نويباور.
- عد الخلايا السرطانية على الأقل مرتين وحساب متوسط replicates للحصول على متوسط إجمالي عدد الخلايا التي تم جمعها-
3. توجيه الثقافات المشارك "من الخلايا السرطانية" nd "وحيدات التمايز تمر" صوب الآكلة
- بذور الخلايا السرطانية على إدراج (المسامية قطره 0.4 ميكرومتر):
- بذور الخلايا السرطانية بتركيز الخلايا 4,000 كل سم 2.
- احتضانها في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
ملاحظة: البذور السرطان خلايا في اليوم بعد ببمك البذر لتجربة ثقافة المشارك في 0.4 ميكرومتر يدخل.
- انتظر 24 ساعة للسماح للخلايا للتقيد.
- مكان المصنف إدراج الثقافة عبر الثقافات وحيدات النوى لبدء ثقافة المشارك (انظر القسم 1، 10 من البروتوكول)-
- تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام مع اكتمال α-الفنزويلية.
- تجاهل المتوسطة مع ماصة ميليلتر 200-1,000. متوسطة
- إضافة 500 ميليلتر من جديد-
ملاحظة: الهدف الأساسي للثقافة المشتركة فهم الطاقة أوستيوكلاستوجينيك الخلايا السرطانية، لذلك، إحصاءات المالية الحكومية لا تضاف إلى α-الفنزويلية. وفي كل تجربة الثقافة المشارك، تشمل نيفرض ضوابط جاتيف (انظر الملاحظة في الخطوة 1، 10 من البروتوكول) وإيجابية للأكلة حسب رانكل ومكسف (لا الخلايا السرطانية). وتستخدم الخلايا السرطانية التي تبذر في إدراج لا توضع فوق الخلايا وحيدات النوى كعنصر تحكم سلبية لثقافة المشارك.
- أن نوقف ثقافة المشاركة واستخدام الخلايا السرطانية لتحليل المصب:
- 13 يوما بعد ببمك البذر و 12 يوما بعد سرطان الخلية البذر، مكان insert على لوحة جديدة.
- وقف سرطان الخلية ثقافة أساسها تحليلات المتلقين للمعلومات التي يتعين القيام بها (انظر المناقشة)-
- في اليوم 14، وقف اوستيوكلاست التمايز وإصلاح الخلايا، وكما ذكرت في الخطوة 1، 15-
- "فخ أداء" تلطيخ فورا أو في غضون أيام 14-30-
ملاحظة: تلطيخ اختيارية: للتأكد من أن الخلايا بوليكاريون فخ + الآكلة، يمكن أداء الباحثين تلطيخ إضافية للكشف عن الظهور، علامة اوستيوكلاست على حدة. الكشف عن عصابات أكتين و هو آخر محددة اوستيوكلاست المصبوغة المقايسة 12 ، ، من 13 14-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أسلوب الأمثل لسهولة التفريق بين الآكلة وحيدات الدم المحيطي البشري. وكان مثقف ثقافة الوحيدات مع الخلايا السرطانية، مما يؤكد (كما تم وصفه في الأدب18) أن الخلايا السرطانية تكون قادرة على الحفاظ على أوستيوكلاستوجينيسيس في الانبثاث العظام. الآكلة متباينة من الخلايا السرطانية وإحصاءات المالية الحكومية مبينة في الشكل 1. خلية مثل اوستيوكلاست خلية مع نويات 4 أو أكثر وهو إيجابي لفخ تلطيخ (الأرجواني الخلايا). وقف المقبولة لعدد الأنوية المستخدمة لتعريف اوستيوكلاست هي 318، ولكن نحن وقررت استخدام 4 للحد من خطر المغلوطة إلى الحد أدنى.
النموذج يبين أن الثدي سرطان خلايا أوستيوكلاستوجينيسيس المطرد لعدد الآكلة في الآبار التي تحدثها الخلايا السرطانية كانت مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في مراقبة إيجابية (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2 ألف، عدد من الخلايا أيضا متباينة عفويا في الآكلة في مراقبة سلبية. وطعن النظام بغية تأكيد فائدة النموذج، مع12،المخدرات انتيتومور13. أرقام اوستيوكلاست كانت أعلى في ظروف الثقافة المشتركة وعينات مراقبة إيجابية (CTR +) مما في عينات مراقبة سلبية (للحد من الخطر-). أرقام اوستيوكلاست تناقص حضور المخدرات (افيروليموس) في ظروف الثقافة المشتركة وعناصر إيجابية (CTR +). تم استخدام الاختبار t للتحليلات الإحصائية. تم عد الخلايا في كل بئر. أرياوف السطحية اوستيوكلاست هي سمة من سمات النضج ويمكن تحليلها باستخدام برمجيات المصدر المفتوح مثل إيماجيج. وكانت الآكلة مستمدة من إحصاءات المالية الحكومية أكبر من تلك التي تحدثها الخلايا السرطانية (الشكل 2). العلاج بدواء مضاد انتيتومور (افيروليموس) إيقاف آثار إحصاءات المالية الحكومية. النموذج معلومات مفيدة عن دور المخدرات في تثبيط أوستيوكلاستوجينيسيس. ويبين الشكل 2 أن أوستيوكلاستوجينيسيس انخفض حضور المخدرات. تم الحصول على هذه النتائج التي أوستيوكلاستوجينيسيس الناجمة عن ثقافة المشارك. كما هو موضح في المقطع بروتوكول، يمكن إجراء عدد من تحليلات أخرى للمتلقين للمعلومات للتحقيق في الآليات الحديث المتبادل و/أو المخدرات تم تحليلها. النموذج الذي لخص في الشكل 3 عالية فيرساتيليند يمكن استخدامها لدراسة أثر المخدرات على الخلايا السرطانية، على وجه الخصوص، الآكلة.
رقم 1. الفحص أوستيوكلاستوجينيسيس. الخلايا الملون بعد 14 يوما في الثقافة. للحد من الخطر-وحيدات مثقف في غياب عوامل النمو؛ للحد من الخطر + وحيدات مثقف مع عوامل النمو رانكل ومكسف؛ كوكو، الآكلة التي حصل عليها المشترك استزراع خلايا الدم مع الخلايا السرطانية. 10 X التكبير. وكانت خلايا اوستيوكلاست-مثل الخلايا ذات الأنوية على الأقل 4 التي كانت إيجابية لفخ (الخلايا الأرجواني). تم قياس كمية الخلايا قبل عد الخلايا الموجودة في كل بئر؛ أجريت replicates 4 لكل حالة، وتم حساب المتوسط. شريط مقياس هو 400 ميكرون. تكبير الصورة في لوحة أقل (100 X) يوضح المساحة السطحية للأكلة 2 (دوائر حمراء). تشير الأسهم إلى نويات اوستيوكلاست. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تأثير افيروليموس على العلاج أوستيوكلاستوجينيسيس- (أ) عدد الآكلة وفقا للوجود/عدم وجود دواء؛ وأجريت replicates 4 لكل حالة. للحد من الخطر-وحيدات مثقف في غياب عوامل النمو؛ للحد من الخطر + وحيدات مثقف مع عوامل النمو رانكل ومكسف؛ كوكو، الآكلة التي حصل عليها المشترك استزراع خلايا الدم مع الخلايا السرطانية. يتم التعبير عن البيانات يعني ± سراج الدين. وتم تقييم أهمية بالاختبار t؛ * ف < 0.05. اوستيوكلاست (ب) كان حساب المساحة السطحية بواسطة ImageJ برمجيات المصدر المفتوح. وقيست الآكلة 50 على الأقل في كل حالة. للحد من الخطر-وحيدات مثقف في غياب عوامل النمو؛ للحد من الخطر + وحيدات مثقف مع عوامل النمو رانكل ومكسف؛ كوكو، الآكلة التي حصل عليها المشترك استزراع خلايا الدم مع الخلايا السرطانية. (ج) صور من الخلايا بعد 14 يوما في الثقافة في غياب أو وجود دواء انتيتومور (افيروليموس). 10 X التكبير؛ شريط مقياس هو 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. نموذج الثقافة المشارك. مخطط نموذج وممكن تحليل المتلقين للمعلومات والتطبيقات المستقبلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإكلينيكية في المختبر نماذج دراسة الآليات من الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام ضرورية لتحديد آليات لورم خبيث العظام التي يمكن استخدامها لإنشاء استراتيجيات علاجية جديدة. قمنا بتطوير نموذج الإنسان الكامل في المختبر من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطي البشري (الشكل 3). خلال الأمثل للمنهجية، حددت عددا من النقاط الحرجة وحلها. الأول يتعلق بكمية الخلايا وحيدات النوى للبذور. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من العد المجهر إجراء تقييم كمي تقريبي فقط كما أنه من الصعب التمييز بين الخلايا الليمفاوية ووحيدات، يجري الخلايا المستهدفة للبذور للتجربة أوستيوكلاستوجينيسيس. كنا قادرين على تحديد وحيدات لأن الخلايا الليمفاوية لا تلتزم الركازة البلاستيكية وهكذا ألغى الأغلبية في أول تغيير للمتوسطة. الخلايا كانت تبذر في كثافة عالية، كما أنها ضرورية للخلايا لتكون قادرة على التفاعل مع بعضها البعض للتمييز، وبخاصة في المرحلة الثانية من أوستيوكلاستوجينيسيس التي تحتاج إلى أن تكون قريبة من بعضها البعض للصمامات وتصبح الآكلة قبل الآكلة ناضجة. وثمة صعوبة أخرى تنشأ عندما تكون هناك ظروف تجريبية متعددة نظراً لأن هذه تتطلب وجود عدد كبير من الخلايا وكمية كبيرة من الدم. واحد الحلول الممكنة هو استخدام بافي المعاطف التي تحتوي تركيزات عالية من ببمكس، مثلاً،5-6 × 10 4 × 106 خلايا وحيدات النوى عادة جمعت من عينة معطف بافي 50 مل مقارنة بأقل من 1 × 105 ببمكس التي تم جمعها من عينة الدم 20 مل.
كما تم جمع عينات الدم من المتطوعين المختلفة، كان هناك قدر من التغير في الإنزيم أوستيوكلاستوجينيسيس. وبالتالي من المهم القيام بكل مقايسة مع replicates التقنية على الأقل 3-4. Replicates البيولوجي ضرورية أيضا، وكما استخدمت المانحين صحية مختلفة، ونحن لا تحسب عادة متوسط القيم التي تم الحصول عليها من تجارب مختلفة. علينا ضمان أن الاتجاهات المتعلقة باختبارات مختلفة كانت تعادل وثم اختيار تجربة واحدة من إحدى الجهات المانحة صحية لإدراجها في المخطوطة.
نموذجنا الإكلينيكية ينطوي على استزراع المشترك من وحيدات تمر التمايز مع الخلايا السرطانية. وكما أظهرنا سابقا، يمكن أيضا إدامة الخلايا السرطانية في المختبر أوستيوكلاستوجينيسيس12،13. يمكن استخدام هذا النظام لاختبار المخدرات أو للتحقيق في آليات التفاعل، كما أنه من الممكن لإجراء عدة تحليلات المتلقين للمعلومات على كل من خلايا السرطان والأكلة. وفي الواقع، من الممكن لإجراء فحوصات انتشار الخلايا السرطانية والجينات التعبير التحليلات الغربية وصمة عار فحوصات على كلا سرطان خلايا والأكلة13. أنها سوف تكون ذات الأهمية لفهم كيف يفرز البروتينات تختلف في ظروف مختلفة. لدينا نموذج يحتوي على عدد من المزايا، أي، وهو نموذج الإنسان الكامل الذي لا يعتمد على خطوط الخلايا مورين، خلافا للعديد من النماذج التي ذكرت في الأدبيات. هذا النموذج هو أيضا قوي وقابل لإعادة الإنتاج إلى حد ما، ويمكن استخدامها لأغراض أخرى. على سبيل المثال، يمكن أن تكون خطوط خلايا السرطان الأخرى مثقف يشترك مع الآكلة والفرق في قوتها أوستيوكلاستوجينيك درس. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا النظام لتقييم الآليات الفسيولوجية أو المرضية الأخرى لتحسين فهمنا للبيولوجيا العظام وأمراض اوستيوكلاست بوساطة، مثل هشاشة العظام. أيضا يمكن أن تكون أنواع السيتوكينات وخلية أخرى مثقف شارك إلى جانب الآكلة اعتماداً على الهدف من هذه التجربة.
عدة تحليلات المصب ممكن مع هذا النموذج. من المهم أن تقرر خلال مرحلة التصميم للدراسة ما سيتم إجراء تحاليل حتى أنه يمكن أن يكون المصنف عدد كاف من الآبار.
المصب فحوصات مع الآكلة:
(ط) الجينات تعبير تحاليل. خطة آبار إضافية من الآكلة لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي، كما لا تتوفر الآبار الملون للتقييم الملائمة لاستخراج الحمض النووي الريبي. (ثانيا) الغربية وصمة عار التحليلات. (ثالثا) التحديد الكمي للمساحة السطحية اوستيوكلاست. اوستيوكلاست حجم معلمة نضج اوستيوكلاست ويمكن قياسها كمياً باستخدام برمجيات المصدر المفتوح مثل إيماجيج.
المصب فحوصات مع الخلايا السرطانية:
(ط) انتشار فحوصات مثل بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT. (ثانيا) الجينات تعبير تحاليل. (ثالثا) تحليل لطخة غربية.
المصب فحوصات مع الآكلة والخلايا السرطانية (ثقافة المشارك):
خلايا السرطان والأكلة تشتركان في نفس الثقافة المتوسطة، يمكن دراسة تفاعلها مع المقايسة أليسا يفرز إفراز السيتوكينات معينة، وإحصاءات المالية الحكومية وغيرها التي أناليزيسثي البروتينات.
وضع هذا النموذج كان حاسما بالنسبة لمشروعنا، ونحن نخطط لزيادة تحسين في المستقبل القريب. سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام التفريق بين وحيدات في السقالات الكولاجين متمعدنة 3D لمصفوفة العظام تقليد. ثم من الممكن تقييم مباشرة النشاط اوستيوكلاست مع مقايسة ارتشاف العظام. ونحن نواصل لمزيد من المعلومات حول الأدوار المختلفة التي تقوم بها الآكلة في تجهيز الفسيولوجية والمرضية بدءاً من العظام يعيد البناء لتنظيم الانبثاث العظام، لدينا نموذج سوف تمكن الباحثين من عزل ودراسة الآكلة في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر كانغ احفورة لتوفير خط الخلية SCP2 ويرنا كريستيانو للمساعدة التحريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D.
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D.
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
