Summary
Assay for Transposase-tilgængelige kromatin kombineret med høj overførselshastighed sekventering (ATAC-FF.) er en genome-wide metode til at afdække tilgængelige kromatin. Dette er en trinvis ATAC-seq-protokollen fra molekylære til den endelige beregningsmæssige analyse, optimeret til humane lymfocytter (Th1/Th2). Denne protokol kan vedtages af forskere uden forudgående erfaring i næste generations sekventering metoder.
Abstract
Assay for Transposase-tilgængelige kromatin med høj overførselshastighed sekventering (ATAC-FF.) er en metode, der anvendes til identifikation af åbne (tilgængelige) regioner af kromatin. Disse områder repræsenterer regulerende DNA elementer (f.eks.promotorer, smagsforstærkere, locus kontrol regioner, isolatorer) til hvilke transskription faktorer binde. Kortlægning af de tilgængelige kromatin landskab er en kraftfuld tilgang til afsløring aktive regulerende elementer på tværs af genomet. Disse oplysninger tjener som en fordomsfri tilgang for at opdage netværket af relevante transkriptionsfaktorer og mekanismer af kromatin struktur, der styrer gen expression programmer. ATAC-seq er en robust og følsom alternativ til DNase jeg overfølsomhed analyse kombineret med næste generation sequencing (DNase-seq) og formaldehyd-assisteret isolation af regulerende elementer (FAIRE-seq) for genome-wide analyse af kromatin tilgængelighed og til sekvensering af micrococcal nukleasen-følsomme steder (MNase-seq) til at bestemme nucleosome placering. Vi præsenterer en detaljeret ATAC-seq protokol optimeret nemlig menneskelige primære immun celler dvs CD4 + lymfocytter (T hjælper 1 (Th1) og Th2 celler). Denne omfattende protokol begynder med celle høst, så beskriver den molekylære procedure af kromatin tagmentation, prøveforberedelse til næste generations sekvensering, og også omfatter metoder og overvejelser i forbindelse med de beregningsmæssige analyser bruges til at fortolke resultaterne. Desuden, for at spare tid og penge, vi indført kvalitetskontrolforanstaltninger til at vurdere ATAC-seq biblioteket før sekvensering. Vigtigere, tillader de principper, der er præsenteret i denne protokol dets tilpasning til andre menneskers immunforsvar og ikke-immune primærelementer og cellelinjer. Disse retningslinjer vil også være nyttigt for laboratorier, der ikke er dygtige med næste generations sekventering metoder.
Introduction
ATAC-seq1,2 er en robust metode, der muliggør identifikation af regulerende3 åbne kromatin regioner og nucleosome placering. Disse oplysninger anvendes til at udlede placering, identitet og aktivitet af transkriptionsfaktorer. Metodens følsomhed for måling af de kvantitative variationer i kromatin struktur giver mulighed for undersøgelse af kromatin faktorer, herunder kromatin remodelers samt modificeringer og RNA polymerase II1transcriptional aktivitet aktivitet. Dermed giver ATAC-seq en kraftfuld og fordomsfri tilgang til decifrere mekanismer, der styrer transkriptionel regulering i enhver celletype af interesse. Vi beskriver tilpasningen af ATAC-seq til primære menneskelige Th1 og Th2 celler.
I ATAC-FF., hyperaktiv Tn5 transposase fyldt med adaptere til næste generation sequencing (NGS) par DNA opsplitning med mærkning af DNA med adaptere (dvs., at "tagmentation")1. Efter PCR-amplifikation er de resulterende DNA biblioteker klar til næste generation sequencing (figur 1). Den privilegerede tagmentation af tilgængelige kromatin registreres af analysen af lokale berigelse af ATAC-seq sekventering læser.
Kort eksperimentel procedure og krav om mindre råvaren, i forhold til andre metoder til måling af kromatin tilgængelighed og nucleosomal positionering som DNase-seq4, FAIRE-seq5og MNase-seq6, har fremmet brugen af ATAC-seq i flere biologiske systemer, herunder menneskelige primærelementer1,7 kliniske prøver8, samt og encellede organismer9, planter10, bananfluer11 , og forskellige pattedyr12.
Identiteten af transskription faktorer, der er bundet til tilgængelige loci kan blive afsløret ved at analysere berigelsen af deres bindende sekvens motiver eller kombinere ATAC-seq med kromatin immunoprecipitation (ChIP) efterfulgt af høj overførselshastighed DNA-sekventering ( ChIP-seq). Denne tilgang aktiveret identifikation af afstamning-specifikke transkriptionsfaktorer vigtigt for bloddannelsen i mus13. ATAC-seq saglig og globale natur giver mulighed for at studere RIBOREGULATION i organismer som reagenser som antistoffer for ChIP analyse ikke er tilgængelige. For eksempel evolutionære variationer i cis-regulerende regioner er blevet identificeret ved at studere kraniel neurale crest celler fra mennesker og chimpanser14, udviklingsmæssige variationer i regulerende elementer under tidlige mus embryogenese15, ændringer i den lovgivningslandskab i løbet af en livscyklus af encellede C. owzarzaki9, og udviklingen af initiativtagerne og smagsforstærkere i hele 20 pattedyr arter12.
ATAC-seq har også været medvirkende til at måle kromatin tilgængelighed i enkelt celler, således afslørende variation inden for cellepopulationer, som normalt undviger genome-wide undersøgelser7,16. Derudover kan ATAC-seq bruges til at studere forandringer, der sker i DNA regulerende regioner i sygdomstilstande, hvor prøverne er sjældne. For eksempel, ATAC-seq kan bruges til at studere ændringer på den reguleringsmæssige landskab under udbruddet af akut myeloid leukæmi (AML)17 eller Ras-drevet oncogenesis11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedurerne, der blev godkendt af institutionelle review board Bar Ilan Universitet og protokollen følger retningslinjer fastsat af udvalget godkender eksperimenterne.
1. rensning af naive menneskers CD4 + celler og polarisering T hjælper 1 (Th1) og Th2 celler
Note: her vi beskriver den procedure, der starter fra frosne humant perifert blod mononukleære celler (PBMC). Det første trin består af isolere CD4 + celler ved hjælp af microbeads og kolonner der normalt give os mere end 95% af CD4 + celler. Dette trin kan dog variere efter den foretrukne protokol i hvert lab. Protokol for T-celle aktivering og polarisering blev ændret fra Jenner et al. (2009) 18. isolation af CD4 + celler fra 10 millioner PBMC giver anledning til 4-6 millioner af CD4 + celler. De er opdelt i to kolber og dyrkes under Th1 og Th2 polariserende forhold højtydende 3-5 millioner Th1 og Th2 celler inden for blot en uge.
Bemærk: Cool ned centrifuge til 4 ° C før igangsætning.
- Tø 1 mL af human PBMC (10 7 celler) i en 50 mL tube indeholder 10 mL af RPMI medium suppleret med 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum. Der centrifugeres 500 g ved x i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med en steril 25 mL pipette med 15 mL suppleret RPMI medium. Overfør celler (med steril 25 mL pipette) til en T75 kultur kolbe.
- Forlade celler natten over i en fugtig inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Overføre de flydende celler med en steril 25 mL pipette til 50 mL tube. Bestemme cell antal og levedygtighed af trypan blå udelukkelse.
- Isolere CD4 + celler fra 10 millioner bor ikke-tilhænger PBMC ved positiv markering med CD4 + microbeads og kolonner ifølge producenten ' s henstillinger (Se Tabel af materialer/udstyr) med følgende ændringer: 10 7 PBMC er mærket med 30 µL af CD4 microbeads i 120 µL af 0,5% BSA i PBS.
- Aktivere CD4 + T-celler i 72 timer ved rhIL-2 (10 ng/mL), plade-bundet anti-CD3 (5 µg/mL) og fedtopløselige anti-CD28 (2 µg/mL). For Th1 polarisering, tilføje rhIL-12 (20 ng/mL) og anti-IL-4 (10 µg/mL). For Th2 polarisering, tilføje rhIL-4 (40 ng/mL) og anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- Kultur cellerne for yderligere 7 dage i nærværelse af rhIL-2 (10 ng/mL) og den samme polariserende cytokiner (rhIL-12 til Th1 og rhIL-4 til Th2).
2. Kerner Isolation
Bemærk: ATAC-seq udføres med intakt kerner. Lysis buffer indeholdende 0,05% nonylphenyl polyethylenglycol var (Se Tabel af materialer/udstyr) kalibreret til at isolere kerner fra primære menneskelige Th1 og Th2 celler. Vi anbefaler kalibrering dette trin med laboratoriereagenser og celler. Et overskud af intakt celler fra utilstrækkelig vaskemiddel formindsker effektiviteten af gennemførelsen reaktion. Celle lysis effektivitet bestemmes af antallet af kerner (trypan blå positive celler) i forhold til det samlede antal celler.
Bemærk: Forberede lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Cool ned en centrifuge med en swing-spand rotor 4 ° C. pelleringsmidler celler i en gynge-spand centrifuge i stedet for en fast vinkel centrifuge reducerer cellekerner/tab. At undgå kerner eller celletab, afpipetteres nøje når udsmid supernatanten.
- Tilføj frisk nonylphenyl polyethylenglycol (til en endelig koncentration på 0,05%) og 100 x proteasehæmmere (til en endelig koncentration på 1 x) til den kolde lysisbuffer umiddelbart før brug. Holde bufferen på ice.
- Antal T-celler til at bestemme deres mængde og levedygtighed benytter trypan blå metode. Levedygtighed, der er lavere end 90% resulterer i højere uspecifikke fordøjelse.
- Overførsel 0,5 x 10 6 T celler (Th1 eller Th2) til 1,5 mL microtubes. Spin ned på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Celle resuspenderes i 1 mL koldt phosphat bufferet saltvand (PBS) løsning. Spin ned på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Celle resuspenderes i 1 mL koldt lysisbuffer (indeholdende nonylphenyl polyethylenglycol og proteasehæmmere). Hold røret på is. Pipette forsigtigt at undgå at forstyrre atomkerner.
- Hurtigt tage 10 µL og tælle celler med en automatiseret celle counter, mens microtube med mængden celler er på isen. Dette skridt bør ikke overstige fem minutter for at undgå at beskadige kerner. Mindst 80% af celler skal være mængden.
- Fortsæt straks med gennemførelse reaktion. Holde rede kerner på ice.
3. Transponering reaktion
NOTE: på dette trin, isolerede kerner inkuberes med prokaryote Tn5 transposase (TDE1) fyldt med adaptere til NGS sekvensering. Hyperaktive Tn5 samtidig fragmenter DNA og ligates adaptere til tilgængelige regioner i genomet (tagmentation proces). Forholdet mellem kerner og Tn5 transposase er afgørende for fordelagtige Waterbondage på tilgængelige kromatin. Denne protokol er kalibreret til 100.000 kerner i en 100 μL reaktion volumen. Men reaktionen kan nedtrappes.
- Sæt temperaturer i en termisk shaker til 37 ° C.
- Overføre 100.000 kerner til en 1,5 mL microtube.
- Centrifugeres 500 x g i 10 min. ved 4 ° C og forsigtigt fjerne supernatanten.
- Tilføje gennemførelse reaktion komponenter til atomkerner som angivet i tabel 1.
- Resuspend af blid pipettering.
- Ruger gennemførelse reaktion i en termisk shaker ved 37 ° C i 30 min med blid ryster (500 rpm).
Bemærk: DNA oprydning er udført af fast-fase reversible immobilisering perler 19 (Se Tabel af materialer/udstyr) eller PCR rensning kolonner. For enden af oprydning elueres DNA-fragmenter i 20 µL af 10 mM Tris-HCl, pH 8. Undgå EDTA i bufferen til eluering.
4. PCR berigelse af ATAC-seq biblioteker
Bemærk: dette trin har til formål at forstærke ATAC-seq bibliotek dvs DNA-fragmenter med indsatte adaptere. At give mulighed for blanding af flere ATAC-seq biblioteker i det samme næste generation sequencing lane (" multiplexing ") Brug ikke-indekserede Primer 1 (Ad1_noMx) 1 for alle prøver, og en anden indekseret (barcoded) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 for hver prøve. Primer sekvenser findes i det suppleres med Tabellen af materialer/udstyr.
- Første PCR-amplifikation
Bemærk: arbejde koncentrationen af Primer 1 (Ad1_noMx) og Primer 2 er 25 µM. Alle primere er fortyndet fra oprindelige bestand af 100 µM til 25 µM. I alle PCR-reaktionerne, anvende Primer 1 (Ad1_noMx) og kun en af de indekserede Primer 2.- Tilføje komponenter af PCR reaktion som angivet i tabel 2 til en sterile PCR-rør.
- Sted PCR rør ind i en termisk cycler og udføre PCR-amplifikation ved hjælp af cykling betingelserne beskrevet i tabel 3.
- Vurdering af antallet af yderligere forstærkning cyklusser
Bemærk: antallet af yderligere PCR cykler bør give tilstrækkelig mængde af bibliotek fragmenter feller en vellykket næste generation sequencing køre, mens minimeret for at undgå GC og størrelse bias 20. Bestemmelse af antallet af PCR cyklusser (N) kræves til optimal bibliotek fragment forstærkning er udført af kvantitativ PCR (qPCR).- Fortyndes primere 1 (Ad1_noMx) og 2 (bruges til indledende bibliotek forstærkning) fra 25 µM til 6,25 µM.
- Tilføje komponenter til optisk PCR rør eller en plade, som anført i tabel 4.
- Sted i en qPCR instrument og cyklus som angivet i tabel 5.
- For at beregne det nødvendige antal ekstra forstærkning cyklusser (N), plot cyklus nummer på x-aksen og relative fluorescens (RFU) på y-aksen.
- Antallet af yderligere forstærkning cyklusser (N) er 1/3 af antallet af cyklusser på som qPCR reaktion nåede plateauet. figur 2 giver eksempler for tre ATAC-seq biblioteker, der nåede plateau på ~ 2.350 relative fluorescens enheder, RFU (tyk grøn linje). Antallet af PCR cyklus, hvor en tredjedel af den maksimale mængde (783 RFU, markeret på y-aksen) forstærkes svarer til 8 cykler til to af biblioteker (rød og blå forstærkning kurver) og 9 PCR cyklusser for den tredje bibliotek (pink).
- Endelige PCR-amplifikation
- forstærke de resterende 45 µL PCR reaktionen. Placer en PCR rør indeholdende forstærkning reaktion fra trin 4.1.2 i termiske cycler. Køre programmet PCR beskrevet i tabel 6. Bruge den tidligere beregnede (trin 4.2.5) antal forstærkning cyklusser (N).
5. Størrelse udvælgelse af ATAC-Seq biblioteker
NOTE: I vores erfaringer, størrelse udvælgelse af forstærkede ATAC-seq biblioteker forbedrer næste generation sequencing resultater fordi det eliminerer høj molekylvægt bibliotek fragmenter fra de endelige ATAC-seq bibliotek.
Bemærk: Tillade de magnetiske perler at varme til stuetemperatur 30 min før brug.
Forberede frisk 70% ethanol i nukleasen-gratis vand.
- Resuspend de magnetiske perler ved at blande.
- Tilføje nukleasen-gratis vand til ATAC-seq biblioteker (fremstillet i trin 4.3.1.) og bringe op til 100 µL.
- Tilsættes 50 µL (0,5 x) af resuspenderede DNA-bindende magnetiske perler til 100 µL af forstærkede biblioteker. Mix af pipettering op og ned på mindst 10 gange. Inkuber prøver for 5 min ved stuetemperatur. Om nødvendigt hurtigt spin ned af microtubes.
- Placere røret på en passende magnetiske står for 2 min til at adskille de magnetiske perler fra supernatanten. Efter 2 min, overføre supernatanten til en ny microtube.
- Måler rumfang supernatant, når der afpipetteres og tilføje 0,7 x af magnetiske perler. Mix af pipettering op og ned på mindst 10 gange.
- Ruger 5 min. ved stuetemperatur. Sted på en magnetisk stå i 2 min.
- Efter 2 min inkubation, supernatanten. Tilføje 200 µL frisklavet 70% ethanol for at vaske perlerne mens rørene er på den magnetiske stå.
- Holder microtube på magnet for 30 s og derefter udsmid ethanol. Gentag trin 5.7.for to sidste ethanol vasker.
- Helt at fjerne de resterende ethanol og lad perlerne lufttørre i 5 min, mens røret er på magneten. Om nødvendigt kortvarigt spin microtube. Fjerne spor af ethanol med p10 pipette spids.
- Fjerner microtube fra magneten og tilføje 22 µL af 10 mM Tris-HCl, pH 8. Ikke elueres ATAC-seq biblioteker i buffer der indeholder EDTA.
- Ruger rør i 2 min. ved stuetemperatur og derefter placere på den magnetiske stå.
- Når løsningen er klar, overføre 20 µL af elueret biblioteker til en ny steril microtube.
- Butik størrelsen valgt ATAC-seq biblioteker på -20 ° C.
6. Kvalitet analyse af ATAC-Seq biblioteker
- validering af kvaliteten af ATAC-seq biblioteker af Real-Time PCR
Bemærk: det er vigtigt at vurdere signalet støjforhold af ATAC-seq biblioteker før næste generation sekventering. Dette gøres ved at bestemme den relative mængde DNA fragmenter fra tilgængelige og utilgængelige loci bruger kvantitativ PCR (qPCR). De utilgængelige loci (negativ kontrol, chr1:48, 137, 860-48,137,934 og chr1:193, 093, 748-193,093,827) er forstærket af primer par 1 og 2. De tilgængelige loci (positiv kontrol, chr19:30, 336, 166-30,336,253 og chr19:11546154-11546237) er forstærket af primer par 3 og 4. Positive og negative loci blev defineret fra kromatin tilgængelighed (DHS-seq) profiler af menneskelige CD4 + celler (ENCODE tiltrædelser ENCSR000EQE og ENCSR000EQG). Negative primer 1 er beliggende i en stor heterochromatic intergenic region (230 kb fra TRADB2 og 88 kb fra FOXD2). Negativ kontrol region 2 er i inden for den første intron af CDC73 gen. Positive primer par 3 er inden for en åben kromatin region neden for Cyclin E (CCNE1) genet mens positive primer par 4 er centreret inden for promotor af protein kinase C substrat 80K-H (PRKCSH). Vigtigere, viser disse kontrol loci et lignende mønster af tilgængelighed i andre menneskers celletyper fra ENCODE projekt 3, tyder på, at de kan anvendes til at overvåge ATAC-seq biblioteker fra et bredt spektrum af menneskelige celletyper. Primer effektiviteten og specificiteten af alle primer par blev bekræftet af qPCR på en seriel fortynding af genomisk DNA (fra menneskelige Th celler) og en smeltende kurve analyse af opnåede forstærket produkter.- Isolere genomisk DNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (Se Tabel af materialer/udstyr).
- Fortyndes den forstærkede ATAC-seq bibliotek 1:10 (1 µL bibliotek + 9 µL nukleasen-gratis vand) og genomisk DNA til ~ 5 ng/µL.
- Forberede hver positive og negative kontroller primer par, under hensyntagen til at Reaktionerne er udført i tre eksemplarer reaktionsblandingen (tabel 7).
- Incubate i qPCR termisk cycler efter protokol anbefalet af qPCR master mix leverandør.
- Analysere resultaterne i qPCR instrument ' s software (Se Tabel af materialer/udstyr). Vælg genomisk DNA som en kontrolprøve. De opnåede værdier repræsenterer en berigelse af tilgængelige regioner (forstærket af positiv kontrol primere). Et eksempel er vist i tabel 8.
Bemærk: Estimering af den gennemsnitlige bibliotek størrelse og koncentration: størrelse fordeling af DNA fragmenter fra ATAC-seq biblioteker bestemmes af høj-følsomhed automatiseret elektroforese systemer ifølge producenten ' s instruktioner. Det er tilrådeligt at måle prøve koncentration på en fluorometer ved hjælp af dsDNA Højfølsom kit og mindst 2 µL af hver DNA-prøve,.
Bemærk: Næste generation sequencing - før multiplexing bibliotekerne, beregne molariteten af hver ATAC-seq bibliotek ved hjælp af formlen: (ng/µL x 10 6) / (660 x gennemsnitlig bibliotek fragment længde). Målet for > 30 mio læser i hver ATAC-seq bibliotek at vurdere åben kromatin regioner af menneskelige prøver. Hvis du ønsker at afgøre, om biblioteket er god nok til NGS sekvensering, i første omgang målet for ~ 10 millioner læser (5% af sekventering lane på DNA-sekventering instrument i hurtige kørselstilstand). Husk, for at udlede nucleosome positionering, parret ende sekventering er nødvendige 1.
7. Analyse af opnået næste Generation Sequencing resultater
- udlede kvaliteten af sekventering læsninger af inspicerende FastQC filer, særskilt for hvert bibliotek.
- Juster læser til menneskelige reference genom (hg19 samling) bruger butterfly 21 software i Unix/Linux-miljø. Kommandoen er ' Butterfly -m 1 - q -S genom register reads.fastq output_aligned.sam '. Genom bibliotek står for den mappe, hvor genom indekser af Butterfly er gemt. Parameter -m 1 er for ikke at tillade justering af læser til mere end én locus i genomet, - q er for input-filen, der skal være i fastq format, -S er i output, som er i SAM format.
- Fjerne dublerede læsninger ved hjælp af SAMtools 22 rmdup indstilling i Unix/Linux-miljø. Kommandoerne er ' samtools Se -S output_aligned.sam -b | samtools sortere -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Den første kommando, se, ændrer formatet SAM til BAM-format, som derefter sorteres. Indstillingen af rmdup anvendes derefter på filen sorteret BAM. Eventuelt kan man justere læser for indsættelsesstedet transposon, som beskrevet i den oprindelige ATAC-seq papir 1. Dette gøres ved hjælp af BEDtools kommandoer 23 i Unix/Linux-miljø. Kommandoerne er ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genom > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Den første kommando, bamTobed, ændrer formatet BAM til BED-format, som derefter kan bruges til kommandoen shiftBed. Filen genom er en fane afgrænset tekstfil, der indeholder længden af hvert kromosom i genomet. Filen indsættes normalt i mappen BEDtools. - Udføre peak opkald ved hjælp af model-baserede analyse af ChIP-seq (MACS2) 24 software i Unix/Linux-miljø på filen flyttet seng med følgende parametre:--nomodel--extsize 75--Skift -30. Disse parametre bruges til at justere læser, så transposon indsættelsesstedet er i midten af hver sekventering Læs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det endelige resultat af denne protokol er en ATAC-seq bibliotek af typisk 3-20 ng/µL. Når kører på et system for DNA integritet analyse (Se Tabel af materialer/udstyr), de viser stigen-lignende udseende2 (figur 3A). Den gennemsnitlige størrelse af DNA-fragmenter er typisk ~ 450-530 bp.
Ordentlig kvalitetsstyring ATAC-seq biblioteker før du udfører næste generation sequencing er vigtigt at spare tid og penge. Vi anser bibliotekerne egnet til næste generation sequencing (NGS) når berigelse af positive kontroller er mere end 25 - og 75 - gange (for primer par 3 og 4, henholdsvis) i forhold til negative kontroller (figur 3B), og når de viser de tidligere nævnt nucleosomal, stigen-lignende udseende. Når du analyserer qPCR data, bekræfter vi også at Cq værdier for negativ og positiv kontrol primere lignende reaktioner med genomisk DNA som en skabelon, og at Cq værdier for negative kontrol regionerne (i reaktioner med ATAC-seq DNA fragmenter) er konstant mellem eksperimenter. For eksempel, i tilfælde af pludselig lavere Cq værdier mistænker vi at atomkerner var over gennemførte og dermed DNA fragmenter med oprindelse fra heterochromatin områder er overrepræsenterede. Desuden, hvis gel billedet (fremstillet ved høj følsomhed båndbaseret elektroforese) af ATAC-seq biblioteker indikerer tilstedeværelsen af adaptere (~ 120 bp), overdreven DNA nedbrydning (fleste af fragmenter er ~ 200 bp), eller store fragmenter (over 1 kb), vi ville ikke fortsætte tiltrin NGS.
Derudover udfører vi altid første NGS hvor vi stræbe efter 10 millioner læser per bibliotek. Hvis resultaterne af denne sekventering er tilfredsstillende (prøven passerer alle parametre i FastQC rapportfilen og vi kan få 1000-2000 toppe efter udfører peak kald), bibliotekerne er sekventeret mere dybt (mere end 30 millioner læser/ATAC-seq bibliotek).
I ATAC-seq eksperimenter på pattedyrceller, hvor som helst fra ~ 30-70% af den omkostningsstyring læser kan komme fra mtDNA10. I modsætning hertil indeholdt vores biblioteker 6-20% læser knyttet til den mitokondrielle genom. Dette er lavere end de rapporterede 46% i ATAC-seq bibliotek fra menneskelige CD4 + T-lymfocytter1. Efter at eliminere disse forurener læser, var vi tilbage med ~ 7-32 millioner unikke læser kortlægning til reference menneskelige genom (58-91% af alle læser). Fra disse, 0,1 - var 2 millioner læser (6,8% - 12% af alle læser) i ATAC-seq toppe (figur 4).
Figur 1 . Arbejdsgang for eksperimenterende trin. Repræsentation af store skridt i protokollens ATAC-seq. Grænseopholdet punkter er angivet med gule sekskanter. Et valgfrit trin er repræsenteret med en orange sekskant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Beregning af det yderligere antal PCR cyklusser kræves for den endelige berigelse af ATAC-seq biblioteker. PCR forstærkning kurver for tre forskellige ATAC seq biblioteker er vist i rød, blå og pink. Forstærkning reaktioner nået et plateau på 2,350 RFU (øverste grønne vandret streg). Antallet af yderligere PCR cykler skærer med 783 RFU (2.350/3) på forstærkning kurve. To biblioteker (rød og blå) kræver 8 ekstra forstærkning cyklusser, mens den tredje bibliotek (pink) kræver 9 cyklusser. Non-template control (NTC) er vist som den nederste grønne linje. X-aksen, cyklus nummer. Y-aksen, RFU enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Kvalitetskontrol analyse af ATAC-seq biblioteker. (A) resultaterne af tape-baseret automatiseret elektroforese af forstærkede ATAC-seq biblioteker. Larsen, stigen; A-D, biblioteker af biologiske gentager fra Th1 og Th2 celler. (B) qPCR kvalitetskontrol analyse af ATAC-seq biblioteker. Genomisk DNA og fire ATAC-seq biblioteker blev forstærket af negativ kontrol primer par (1 og 2) og positiv kontrol primere (3 og 4). De opnåede værdier for ATAC-seq biblioteker (blå) blev først normaliseret til forstærkning niveauer af genomisk DNA (vilkårligt indstillet til en værdi af 1 rød). Efterfølgende var værdier for positive kontrol regionerne normaliseret til regionerne negativ kontrol (lavere diagram). Biblioteker #1 og #2 blev sendt til NGS sekvensering. Værdierne repræsenterer gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Genom-browser øjeblik ots tilgængelige kromatin regioner i Th1 og Th2 celler. ATAC-seq spor er vist for NFKB1, JUN, CD28, IFNG (udtrykt i Th1) og IL4 og IL13 (udtrykt i Th2) loci i Th1 og Th2 celler (to biologiske gentages for hver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| TD buffer | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| Nukleasen-frit vand | 45 | ΜL |
| Samlede volumen | 100 | ΜL |
Tabel 1: Forberedelse af gennemførelsen reaktionsblandingen.
| ATAC-seq bibliotek | 15 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabel 2: Komponenter af indledende PCR-mastermix (trin 5.1.1.).
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Filtypenavnet * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ | |
| * Dette trin er nødvendig for at forlænge begge | |||
| enderne af primere efter gennemførelse reaktion. | |||
Tabel 3: PCR cykling betingelser for oprindelige bibliotek forstærkning (trin 5.1.2.)
| Alikvot af PCR reaktion (trin 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | ΜL |
| Primer 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 7.5 | ΜL |
| Nukleasen-frit vand | 0,5 | ΜL |
| Samlede volumen | 15 | ΜL |
| * For ikke-skabelon kontrol i stedet for skabelonen DNA tilføje ultra rent vand. | ||
| ** Den endelige koncentration af hver primer er 417 nM. | ||
| Brug foretrukne master mix for qPCR. | ||
| Det bør indeholde polymerase, dNTP'er, MgCl2og fluorescerende farvestof. | ||
Tabel 4: Forberedelse af qPCR reaktionsblandingen (trin 5.2.2).
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
Tabel 5: Cykling betingelser for qPCR-baseret vurdering af yderligere antal forstærkning cyklusser (N) (trin 5.2.3.)
| CYKLUS TRIN | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | N |
| Udglødning | 63 ° C | 30 s | |
| Udvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
Tabel 6: Cykling betingelserne for den endelige PCR berigelse trin (trin 5.3.).
| For en enkelt PCR reaktion: | ||
| Fortynding af biblioteket af genomisk DNA | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 eller F2 eller F3 eller F4) * | 0,3 | ΜL |
| 10 μM Primer Rasmussen (R1 eller R2 eller R3 eller R4) ** | 0,3 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 5 | ΜL |
| Nukleasen-frit vand | 1.9 | ΜL |
| Samlede volumen | 10 | ΜL |
| * Den endelige koncentration af hver primer i reaktionsblandingen er 300 nM. | ||
| ** Hvis bruger primer F1 end R primer bør være R1 osv. | ||
| Brug foretrukken 2 x master mix egnet til qPCR instrument i dit laboratorium. | ||
Tabel 7: Reaktionsbetingelser for QC analyse (trin 7.1.3.).
| Target | Stikprøve | Betyde Cq | CQ SEM | Relative antal | Normaliseret | |
| 1 | Negativ kontrol | ATAC-seq | 30.39 | 0,11 | 1 | 1,01 |
| gDNA | 30,4 | 0,16 | 0,99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0,18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0,09 | 0,99 | 1 | ||
| 3 | Positiv kontrol | ATAC-seq | 23.27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30,7 | 0,06 | 0,01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Tabel 8: Beregning af berigelse af positiv kontrol over negative kontroller (trin 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq protokollen beskrevet her har været med succes ansat til analyse af tilgængelige kromatin i primærelementer (menneskelige Th1, Th2 celler og B-celler) samt kulturperler cellelinjer (MCF10A humane brystkræftceller og U261 glioblastom celler). Anvende ATAC-seq til andre celletyper kan kræve nogle protokol optimering, især i trinnet lysering. Hvis koncentrationen af nonionisk detergent er for højt, kan der være en højere procentdel af mitokondriel DNA forurening. Dette kan reduceres ved at mindske koncentrationen af vaske-og rengøringsmidler i lysisbuffer uden at reducere kerner udbytte. Vores erfaring gav lysisbuffer med 0,05% vaskemiddel de mest tilfredsstillende resultater. Derudover spinning kerner i en gynge-spand i stedet for fast vinkel rotor tilladt at reducere G force til 500, hvilket reducerede mitokondrier i toerstoffet. Forskere kan også afprøve andre typer af rengøringsmidler, for eksempel, digitonin17. Men selv med optimeret lysis betingelser, mtDNA forurening er uundgåelig. Hen til helt ophæve mtDNA, kan CRISPR/Cas9-system være brugt15. I dette tilfælde inkuberes ATAC-seq biblioteker med sgRNAs til target mtDNA og Cas9 nukleasen at fordøje mtDNA15.
Antallet af kerner, der kræves for denne ATAC-seq protokol (100.000) kan være begrænsende i tilfælde, hvor celle nummer fra kliniske prøver er knappe7. ATAC-seq har været succesfuldt at skaleret ned til 5.000 og 500 celler1,13,17 , ved at reducere reaktion bind1,13udfører oprydning med magnetiske perler i stedet for med kolonner 13, eller undgå oprydning trin1. Derudover kan encellede ATAC-seq (scATAC-FF.) udføres ved hjælp af en mikrofluid enhed til at adskille enkelte kerner16. Navnlig, kræver andre metoder til måling af kromatin tilgængelighed, DNase-FF. og FAIRE-FF., mere råvare, og et par dage mere til at udføre eksperimentet.
Det er nu meget værdsat, at bias i forskellige NGS metoder er almindelige fænomener25. En af årsager til variationer i forskellige kromatin tilgængelighed foranstaltninger er enzymatisk kavalergang trin25. Det har vist sig at DNase jeg viser kavalergang bias26 og nu det erkendes, at Tn5 transposase viser kavalergang præference samt27. Heldigvis kan den potentielle bias identificeres beregningsmæssigt ved hjælp af en kvalitetskontrol rørledning som ChiLin28. En anden fælles kilde af bias er PCR forstærkning trin20,25. Dette manifesterer ofte som en bias for forstærkning af GC-rige fragmenter25. Da bias stiger med hver PCR forstærkning skridt, overstiger vi ikke 9 yderligere cykler (N) i den endelige PCR-amplifikation af ATAC-seq biblioteker.
Det rette forhold mellem Tn5 transposase og kerner er afgørende for vellykket ATAC-seq2. Et overskud af enzym ville føre til "over gennemførelse" i utilgængelige loci og høj baggrund. Dette afspejles i høj forstærkning af negative kontrol regionerne i trinnet qPCR kvalitetskontrol. Et overskud af kerner ville føre til "manglende gennemførelse". I dette tilfælde vil for fjernt kavalergang sites resultere i færre PCR-forstærket fragmenter og lav bibliotek kompleksitet. For at bestemme antallet af kerner præcist, indført vi en yderligere tælle skridt efter celle lysis og før gennemførelse reaktion.
Kromatin tilgængelighed er en vigtig epigenetisk regulering lag som det tillader aktivitet af transskription lovgivere på bestemte genomisk steder. Således giver DNA-sekvens i det tilgængelige kromatin profil et væld af oplysninger om identitet og mål loci snesevis af mulige transkriptionsfaktorer. Ved at kombinere denne information (fremstillet ved ATAC-seq) med en RNA udtryk profil giver fokus på de relevante transkriptionsfaktorer, der kan analyseres yderligere af ChIP-seq13,22. Derudover er kun 10% af sygdom-associerede polymorfier i kodning genom30. Således anvender ATAC-seq til kliniske prøver kan afsløre, hvilke af de ikke-kodende varianter er på regulerende elementer, der kan påvirke RIBOREGULATION i tilstanden sygdom (for eksempel i systemisk lupus erythematosus8). Vi håber, at denne ATAC-seq protokol vil hjælpe og tilskynde interesserede Efterforskere bruge denne kraftfulde metode til at fremme deres forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie-Integration yde (CIG) - RP7-folk-20013-CIG-618763 og CORE Program af planlægning og budgettering udvalg og The Israel Science Foundation give nr. 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
