Summary
G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセット プラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々 なタンパク質。
Abstract
非正規の核酸の二次構造 G quadruplexes (G4) は、DNA 複製、転写、RNA プロセシング、テロメア伸長などの多様な細胞プロセスに関与しています。これらのプロセスの中に様々 な蛋白質はバインドし、職務の遂行に G4 構造を解決します。G4 の関数は、多くの場合その折り畳まれた構造の安定性に依存、G4 結合蛋白質が G4 の安定性を調節する方法を調査することが重要です。この作業は、リアルタイムで G4 分子に G4 結合タンパク質の制御の研究を可能にする磁気ピンセットを使用して単一の G4 分子を操作するためのメソッドを示します。一般的には、このメソッドは、タンパク質・ リガンド相互作用の様々 な DNA または RNA 二次構造に規制研究アプリケーションの広い範囲に適しています。
Introduction
4 本鎖 DNA や RNA の G4 の構造は、多くの重要な生物学的プロセス1に重要な役割を果たします。多くの蛋白質は、G4 のバインディングとテロメア結合タンパク (テロメラーゼ、POT1、RPA、TEBPs、TRF2) などの規制に関与している1,2, 転写因子 (ヌクレオリン化における PARP1)3、RNA プロセシング蛋白質 (hnRNP A1hnRNP A2)4ヘリカーゼ (BLM、FANCJ、RHAU、警告、Dna2、Pif1)5、DNA 複製関連蛋白質 (Rif1、REV1, PrimPolymerase)6に。蛋白質の結合を安定化したり G4 構造を不安定にします。したがって後続の生体機能を調節します。G4 の安定性は、熱溶融性 uv (紫外線) や円偏光二色性 (CD) の方法7を使用して測定しました。ただし、そのような条件は、生理学的な関連、タンパク質7のバインドの効果の研究に適用することは困難。
1 分子操作技術の急速な発展は、折りたたみとリアルタイム8ナノメートルの分解能での単一分子レベルでのタンパク質や DNA など、生体分子のアンフォールディングの研究を可能にしました。原子間力顕微鏡 (AFM)、光ピンセットや磁気ピンセットは、最も一般的に使用される単一分子操作方法です。原子間力顕微鏡、光ピンセット9と比較して、磁気ピンセットはドリフト防止法10,11を使用して、日間折り畳み展開単分子動態の安定した測定を許可します。
ここでは、結合蛋白質による G4 安定性の規制を検討する磁気ピンセットを用いた単一分子操作プラットフォームは報告された12,13です。この作品では、サンプルと流れチャネルの準備、磁気ピンセットのセットアップ力校正など、基本的な方法について説明します。コンスタント ・ フォース (力クランプ) など、さまざまな力のコントロールの下で長い時間測定を可能にする力の制御とドリフト防止プロトコルに記載されている手順 3 として、読み込み定数 (力ランプ)、速度し力ジャンプ測定。手順 4 で説明した力校正プロトコルによりの力校正 < 広い力短い綱を 1 μ m の範囲まで 100 pN は、10% 以内の相対誤差と。RNA ヘリカーゼの安定性の規則の例は、RNA G4 はこのプラットフォームの13のアプリケーションをデモンストレーションするために使用の解決に重要な役割を果たしている AU 豊富な要素 (RHAU) ヘリカーゼ (別名 DHX36、G4R1) に関連付けられています。
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Protocol
1 です単一分子の伸張のための準備の G4 DNA
- 準備 5 '-チオール ラベル及び 5 '-5 を使用してラムダ ファージ DNA テンプレートの DDNA ポリメラーゼを用いた PCR によるビオチン dsDNA ハンドル '-チオールと 5 '-ビオチン。プライマー 14 ( 図 1)。両方 dsDNA のハンドルがある高い GC の内容 (> 60%) DNA を防ぐために溶融高力または overstretching DNA 中に DNA を開催移行 15 。
- 浄化の PCR の製品のメーカーによると BstXI の制限の酵素と商業浄化キットとダイジェストを使用して ' s プロトコル 。
- 縛る G4 成形 ssDNA、および製造元によると T4 DNA リガーゼを使ってフランク ssDNA と dsDNA ハンドル ' s プロトコル。メーカーによると商業精製キットを使用してゲルの抽出による結紮製品を浄化 ' s プロトコル 。
2。流路の準備
- Coverslip のクリーニングと表面機能化
- 場所下の染色 (各 jar coverslips の 7 個セット出来る瓶カバー ガラスのトップ coverslips (#1.5、20 × 20 mm) に coverslips (#1.5、22 × 32 mm)ボリュームが ~ 20 mL)。リンス、coverslips 蒸留水の瓶で 2-5 倍です 。
- 追加 ~ 5 ~ 40% に各 jar ファイル、および 30 分の超音波洗浄で洗剤溶液の 20 mL 用蒸留水ですすぎ > 洗剤を削除する 10 倍 。
- 乾燥オーブンで瓶に coverslips (~ 150 ° C;注意、ホット)、または N 2 ガス。ドライ キャビネットの乾燥トップ coverslips を格納します 。
- 使用プラズマ (O 2 ガス) coverslips 10 分の瓶の中をきれいにします。10 分間の 1% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 液をメタノール 20 mL を準備 (注意 毒性・可燃性)。APTES をメタノールに溶解する化学発煙のフードを使用します
。 注: は、APTES ソリューションを格納するときに湿気を避けるため。古い APTES しばしば coverslips の表面機能性の問題が発生します 。
- プラズマ洗浄後すぐに瓶に 1 %aptes 溶液のすべてを追加し、1 h. 注ぐ 1 %aptes メタノールの特定廃棄物のボトルに廃棄物のためのインキュベートします。可燃性の化学薬品の発煙のフードでメタノールに関連の手順を実行します 。
- メタノールと一度瓶を洗うと > 10 倍蒸留水と (~ 150 ° C のオーブンで、ドライ注意、熱い)。2 週間使用中はともかく乾燥キャビネット APTES コーティング下 coverslips を格納します
。 注: 2.1.4 を 2.1.1 から各サブ手順の後洗浄プロセスを一時停止できる次のステップにします 。
- アセンブル流路
- 2 つの準備 " スペーサー "、すなわち、パラフィルムまたは両面テープ (〜 4 × 20 mm) 各チャネルの。長い端に沿って下部 coverslip のスペーサーの 2 つの作品を配置します。間にフローセルを形成、スペーサーのトップ coverslip の場所 (~ 10 mm × 20 mm 領域、 図 2 a B).
- は、パラフィルム、スペーサーとして使用する場合はヒーター (60-120 ° C; に流路を配置します。注意、ホット) 2 つ coverslips をパラフィルムで一緒に固執するトップ coverslip の両側を軽く押して中に 5-10 秒のため。結果の流路の高さがあり ~ 100 μ m、それによりチャネルのボリュームが ~ 20 μ L 。
- 漏れを避けるためにシリコーン接着剤でチャネルの長い端を密封します。シリコーン接着剤を使用して、エントリとソリューションの出口として機能する流路の開放端の小さなシンクのような構造を作る
。 注: エントリと終了も可能 など、他の方法でワックスを使用して付着した小さなプラスチック製のリングで 。
- 4 週間乾燥キャビネットにチャンネルを保存します 。
- 流路の底面にテザー DNA
- アミノ酸コーティングのポリスチレン ビーズを希釈 (直径: 3 μ m) 蒸留水 1 X 200 X によるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファー。渦ビーズ ソリューションとチャンネルの流れ。孵化のためのチャネルでビーズ ソリューション 〜 30 分 1 × PBS バッファーの 200 μ L で洗浄することにより任意のバラバラのビーズを削除します 。
- 調整 (増加/減少) 50 mm × 50 mm の面積あたり 1-5 ビーズの表面密度を達成するために培養時間。3 日間参照ビーズ堆積チャンネルを格納します 。
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) パウダー 1 × PBS ソリューション (〜 0.5 mg/mL)。渦ソリューションとチャネルに、フローします
。 注: 使用する前に新鮮なスルホ SMCC ソリューションを準備し、SMCC の加水分解を避けるためにチャンネルにすぐにそれを追加します 。
- 加温 30 分のためのチャネルの SMCC ソリューション大量洗浄 SMCC ・ ソリューションを取り外します (1 mL 〜 チャンネル ボリューム X 50) 1 × PBS 溶液
。 注: 余分な SMCC を丁寧に洗います。この手順は、上の DNA の結合のために非常に重要です 。
- DNA テザリング の希釈、チオール-ビオチンは DNA の結果 DNA 濃度の 1 X PBS に 〜 0.3 nM。ソリューションをミックス、SMCC 被覆したチャネルに DNA の解決の流れ、室温で 30 分間インキュベートして優しくピペット (~ 23 ° C).
- 1x PBS 10 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) と 0.01 %2-メルカプトエタノールを含むソリューションをブロックの 200 μ L で自由な DNA を優しく洗い流す 。
- のためのソリューション (10 mg/mL 0.01 %2-メルカプトエタノール BSA) ブロック内のチャネルの孵化によってチャネル表面ブロック > 2 h; これはステップ後チャネルは実験のため準備ができています。4 ° C で準備されたチャネルを保つことができる 〜 1 日
。 注: ブロックのステップは DNA と、coverslips に磁気ビーズの非特異的結合を減らすために重要です 。
3。磁気ピンセット セットアップおよび単一の識別 dsDNA テザー
- 磁気ピンセット セットアップ
- スタート磁気ピンセット制御プログラム。ここで、磁気ピンセットは社内記述の LabVIEW プログラムによって制御されたします 。
- は、チャネルをマウントする前に磁石の中心を合わせます。4 X 対物レンズを使用して顕微鏡の光軸に磁石の x 軸と y 軸を調整します 。
- はコンピューター制御の電動マニピュレーターを使用して z 方向 ( 図 2 a) 磁石を移動し、d との距離を設定 = 0 (d: coverslip の磁石との間の距離) 磁石を付けるとき顕微鏡を観察 。
- プログラム (つまり、定数 d) 一定の力を含む力の制御を達成するためにマニピュレーターを磁石の動きと時間変動力 F (t) (すなわち、時間変化 d(t)).
- は明るい目的をビーズの後方散乱照明用光源は発光ダイオード (LED) を使用します。電荷結合素子 (CCD) カメラで 100 Hz のサンプリング レートでビーズ画像を収集
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Representative Results
この図の拡大版を表示するのにはここ。
G4 の展開図 5: ジャンプ力測定。
力中にビード高さ変化 (A) 代表的な時間トレース 1 pN と 54 pN 10 DmRHAU、なしで測定のサイクルをジャンプ nM DmRHAU が、ATP、なしと両方が 10 nM DmRHAU と 1 mM ATP、図パネルに記載されています。(B) (A) のデータからいくつかのジャンプ力サイクルで 54 pN にジャンプした後 G4 分子 (灰色データ) の拡張子の変更の代表的な時間トレース。(F) に対応する拡張機能と展開 (U) G4 は示されている;G4 展開イベントは、矢印で示されます。この図は、13 日から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記、G4 DNA の力学的安定性と G4 を使用して蛋白質の相互作用を研究するためのプラットフォームとして、単一分子磁気ピンセットが報告されます。プラットフォームを伴い、G4 DNA テザーと折り畳み展開ダイナミクス計測とナノメートル特別決議と G4 の構造安定性を見つけることの非常に効率的なプロトコルが開発されています。フォーカル プレーン ロックにより非常に安定したのドリフト防止制御を G4 など小さな構造変化を検出するために重要である (サイズのステップ 〜 7 nm) とバッファー交換実験でタンパク質との相互作用。このプラットフォームは、G4 結合タンパク質 RHAU ヘリカーゼ13の研究と同様、C-myc のプロモーター G412、テロメアの G414の折畳み・展開の原動力の研究に採用されている最近。
典型的な実験エラーは DNA と、coverslip のビーズの非特異的結合または複数の Dna が磁気ビーズにバインドします。まず、非特異的結合を減らすためは、APTES や SMCC など化学物質の貯蔵は、日常的にチェックする必要があります。第二に、磁気ビーズの適切な種類を選択し、非特異的結合をブロックすることが重要です。10 mg/mL BSA バッファーまたはポリ T などの小さな DNA オリゴを使用してビーズの疎水性表面をブロックを大幅に削減できます非特異的結合。最後に、単一 DNA テザー DNA 引き攣る遷移17,18,19の特徴によって、簡単に複数の DNA テザーと区別できます。
現在、プラットフォームの位置決定は、画像解析、ビーズに基づいています限られた空間分解能を持っている ~ 2 nm。さらに、それはの限られたサンプリング レート 〜 100 Hz、典型的な CCD カメラの限られたアクイジション ・ レートと画像の相関分析の主因。これらの制限は、全反射顕微鏡 (TIRF) 照明を使用して克服することができます。それはビーズ画像集録および解析26 を回避しながら高い信号対雑音比の短い分子の拡張子の変更を確認する使用ことができます表面から高さと指数関数的に減衰するエバネッ セント光の薄層を生成します。.別の制限は直接つながれた分子または行きのフォーカル プレーンで分子の伸張によって克服することができます垂直方向のストレッチ デザインで蛍光イメージングを使用してつなぎ縄でつながれた分子リガンドを視覚化するために挑戦です。横磁気ピンセット27。最後に、反応チャネルの現在の設計では、分子に流れ摂動のための迅速な解決に交換が許可されていません。さらに、高速フローで生成された大きな抵抗がもテザーを破壊する必要があります。この制限は、チャネル28の底面に配置マイクロウェル内部の綱を操作することによって克服できます。
G4 の安定化合物を含む癌疾患の潜在的な治療上のターゲットとして考慮される現在ウイルス関連疾患および神経変性疾患29,30,31。プロトコルは、G4 広い範囲結合蛋白質2と小配位子32に適用することができます。G4 研究のアプリケーションに加え、原則として、プロトコルと同様に、このプラットフォームが DNA および RNA ヘアピン、トリプレックス、i モチーフ33などの二次構造その他核酸の研究使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者が原稿を校正孟パンをありがちましょう。この作品はサポートによってシンガポール省の教育学術研究基金第 3 層 (MOE2012-T3-1-001) J.Y.; にJ.Y.; ことシンガポール メカノバイオロジー研究所を通じて国立研究財団国立研究財団、その NRF Investigatorship プログラム (NRF Investigatorship 賞号の下で総理大臣のオフィス、シンガポール、J.Y.; に NRF-NRFI2016-03H. Y に中央大学 (2017KFYXJJ153) の基礎的研究基金。
Materials
Name Company Catalog Number Comments DNA PCR primers IDT DNA preparations DNA PCR chemicals NEB DNA preparations restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation 2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup Labview National Instruments Magnetic tweezers setup OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis References
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生化学、問題 127、分子操作、磁気ピンセット、G quadruplexes、ヘリカーゼの折りたたみ・展開
