Method Article

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

DOI:

10.3791/56340

⸱

October 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.

Abstract

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Der Zebrafisch-Larven ist ein wichtiger Modellorganismus für Entwicklungsbiologie und Wundheilung. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Larven ein wertvolles System für live hochauflösende mikroskopische Aufnahmen von dynamischen biologischen Phänomene in Raum und Zeit mit zellulären Auflösung. Jedoch kann die traditionelle Methode der Agarose Kapselung für live Imaging Larvalentwicklung und Gewebe nachwachsen behindern. Daher beschreibt die Handschrift der zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die wurde entworfen und hergestellt als funktional unterteilte Gerät Larven für hochauflösende Mikroskopie und erlaubt zu orientieren Schwanzflosse Durchtrennung im Gerät und anschließende hemmungslos Schweif Entwicklung und nachwachsen. Dieses Gerät ermöglicht eine Verwundung und langfristige Bildgebung unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Angesichts der Tatsache, dass die zWEDGI Form 3D gedruckt, die Anpassbarkeit der Geometrien machen es leicht modifiziert für diverse Zebrafisch-imaging-Anwendungen. Darüber hinaus bietet die zWEDGI zahlreiche Vorteile, wie z. B. Zugriff auf die Larve während Experimente für verletzte oder für die Anwendung von Reagenzien, Ausrichtung der mehrere Larven für optimierte Bildgebung und Wiederverwendbarkeit des Geräts parallel geschaltet.

Introduction

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Die Regenerationsfähigkeit der Zebrafischlarven Danio Rerio machen sie eine ideale Modellorganismus für Wunde Reaktion sowie Heilung und nachwachsen1,2,3,4zu prüfen. Zugriff auf ein Array von transgenen Zebrafisch Linien und Zebrafisch anatomische Transparenz weiter erhöhen ihre Nützlichkeit für in Vivo Studien der Wunde Antwort Veranstaltungen sowie längerfristige Regenerationsprozesse4. Studie dieser biologischen Prozesse mit Hilfe hochauflösender Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie daher verlangt ei....

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Protocol

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Hinweis: das base zWEDGI Design für Zebrafischlarven, die 2 bis 4 Tage nach Befruchtung (Dpf) und befolgen Sie die Richtlinien der Universität von Wisconsin-Madison Forschung Tiere Resource Center formuliert wurde.

1. Design und 3D Druck von Formen

  1. Modell der PDMS-Komponente des Gerätes mit gewünschten Geometrien und Attribute in einem 3D modeling Software 5. Erstellen Sie eine Assembly eine leere Form und der PDMS-Teil und generieren Sie eine Negativform für PDMS-Teil durch die Schaffung eines Hohlraums in der Form entsprechend der PDSM Teil. Speichern Sie die Form als STL-Datei für den 3D-Druck (

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Results

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Die zWEDGI PDMS mikrofluidischen Gerät ist funktionell unterteilte entwickelt, um vier Hauptfunktionen (siehe unten) verbunden mit live-Bildgebung der Schwanzflosse Verwundung heilen und nachwachsen im Zebrafischlarven aufnehmen. PDMS wurde für die Fertigung von zWEDGI gewählt, weil es nicht nur leicht zugänglich ist und eine Industrie-standard für Biokompatibilität, sondern auch in Formen gut funktioniert. Darüber hinaus macht PDMS das Gerät wieder verwendbare und leer von harten oder sc.......

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Discussion

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Das zWEDGI-Gerät soll 3D Zeitraffer imaging zu stabilisieren und den Fisch in kleine Arbeitsabstand von einem hochauflösenden Mikroskop Ziel orientieren zu erfassen. Während diese Designspezifikationen erfüllt, ist es auch eine Verbesserung gegenüber traditionellen Agar-Basis Vorbereitung für live Imaging. Es gibt drei wichtige Schritte (siehe unten) bei der Herstellung von zWEDGI, die, wenn man nicht richtig Defekte Geräte führen kann:

PDMS-Vorbereitung (Abb. 5A).......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Autoren möchte anerkennen, primäre Projektförderung vom Morgridge Institute für Forschung und Labor für optische und Computational Instrumentierung. Wir anerkennen auch Finanzierung von NIH # R01GM102924 (AH und KWE). KH, JMS, RS, AH und KWE konzipiert und gestaltet die Studie. KH und JMS führten alle Experimente mit Unterstützung von DL, KP und RS. KH, JS, RS, AH und KWE trugen zu dem Schreiben des Manuskripts.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formen herstellen
Solidworks Professional Accedemic Research 3D-ModellierungssoftwareDassault SystèmesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D-Drucker3D Systems Inc.23200-9023D Systems Inc.
Accura 60 Photopolymer-Harz3D Systems Inc.24075-9023D Systems Inc.
vergällter AlkoholSunnyside5613735Menards
UV-Nachhärtungsgerät3D Systems Inc.23363-101-003D Systems Inc.
TouchNTuff NitrilhandschuheAnsell92-600McMaster Carr
220B, 400B, 600 Körnung T414 blue-bak Schleifpapier Norton66261139359, 54, 52MSC
Borosilikatglasscheibe, 2" DurchmesserMcMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
UltraschallreinigerBranson1510R-MTH
Isopropyl Reinigungsalkohol 70%Hydrox54845T43McMaster-Carr
10oz klarer KunststoffbecherWNA Masterpiece 557405Amazon
6" Craft StickPerfect StixCraft WTD-500Amazon
Name>Katalognummer<>Kommentare
Fabricate zWEDGI PDMS Gerät
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit Dow-Corning4019862Ellworth Adhesives 
10mL SpritzeBecton Dickinson305219Vitality Medical Inc
ExsikkatorBel-Art SciencewareF42027-0000Amazon
4 in RatschenstangenklemmePittsburgh68974Harbor Freight
LaborofenQuincy Lab Inc.20GCGlobal Industrial
PinzettensetAven549825McMaster-Carr
DruckluftfilterdüseInnotechTA-N2-2000FTReinraum Versorgung
Vakuumbank SchraubstockWilton Tool Group63500MSC Industrial
55mm Glasbodenschale; 30mm Micro-Well #1,5 DeckglasCellvisD60-30-1,5-NCellvis
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
NameCompanyKatalognummerKommentare
>Ladelarven
Pipetteman, P200GilsonF123601
100 % Ethanol (vor Gebrauch auf 70 % mit Wasser verdünnt)Pharmco-aaper111000200
TransferpipetteFisherbrand13-711-5AFisher Scientific
Magermilchpulver2902887MP Biomedicals
doppelt destilliertes Wasser
N-PhenylthiorharnstoffSigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat)C-FINQ-UEWestern Chemical
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktSigma-AldrichA0701Sigma-Aldrich
Heizblock (Inkubator im Trockenbad)Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 Puffer 
Pipettenspitze mit großer Öffnung, 200 μlFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
Allzweck-Pipettenspitze, 200 μlFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 Skalpellklinge Feather2976Amazon
25G SpritzennadelBD BD305122Fisher Scientific
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
>>
inverses Mikroskop
Imaris BildgebungssoftwareBitplane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.

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Zebrafish LarvaeWound HealingLive ImagingPDMS Device3D PrintingMultiphoton MicroscopyCollagen Fiber AnalysisTissue RegrowthMicrofluidic ChannelsAgarose Encapsulation

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