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방법 논문

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56340

⸱

2017년 10월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.

초록

Zebrafish 애벌레 발달 생물학 및 상처 치유에 대 한 중요 한 모형 유기 체 이다. 또한, zebrafish 애벌레 셀룰러 해상도 시간과 공간에 동적 생물 현상의 라이브 고해상도 현미경 이미징에 대 한 중요 한 시스템 이다. 그러나, 애벌레의 개발 및 조직 regrowth 라이브 이미징 agarose 캡슐화의 전통적인 방법 방해 수 있습니다. 따라서,이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치),이 설계 하 고 허용 하는 동안 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 애벌레 하 기능 compartmentalized 장치 조작 꼬리 지 느 러 미 transection 장치 및 후속 억제 꼬리 개발 시간과 다시 성장. 이 장치는 부상 및 생존 능력을 유지 하면서 장기적인 이미징에 대 한 수 있습니다. ZWEDGI 형 3D 인쇄는, 그 형상의 customizability 하기가 쉽게 다양 한 zebrafish 이미징 응용 프로그램에 대 한 수정. 또한,는 zWEDGI 실험 동안 유 충에 부상 또는 시 약의 응용 프로그램에 대 한 액세스와 같은 다양 한 혜택 paralleled 유선형된 이미징에 대 한 여러 애벌레의 방향 및 장치의 재사용성을 제공 합니다.

서론

Zebrafish 애벌레 Danio rerio 의 재생 용량 그들에 대 한 응답 상처 치유와 자라나1,2,,34검토 이상적인 모델 유기 체를 확인 합니다. 유전자 변형 zebrafish 라인과 zebrafish의 해부학 투명도 추가의 배열에 대 한 액세스 향상 장기 재생 프로세스4상처 응답 이벤트의 vivo에서 학문에 대 한 그들의 유틸리티. 따라서 고해상도 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이러한 생물 학적 과정의 연구는 생존 능력을 유지 하면서 높은 안정성과 제 브라 유 충의 최소한의 움직임을 허용 하는 라이브 이미징 zebrafish 장치를 요구 한다. 그것은 키 장치 허용 효과적인 부상 치유 하는 동안 재생 발생 장치에 의해 영향을 받지 않습니다.

라이브 영상 중 agarose에서 유 충을 포함의 표준 라이브 영상 안정화 방법 성장 제한 및 재생5 상처와 애벌레 4 후 심장 스트레....

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프로토콜

참고: 기본 zWEDGI 디자인 2 ~ 4 일 후 수정 (dpf)와 매디슨 위스콘신 대학 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 zebrafish 애벌레에 대 한 공식화 했다.

1. 디자인 및 3D 인쇄의 금형

원하는 형상 및 3d 모델링 소프트웨어 5 특성 장치
  1. 모델은 PDMS 구성 요소. 빈 형과 PDMS 부품의 어셈블리를 만들고 PDSM 부분에 해당 하는 금형에는 구멍을 만들어 PDMS 부분에 대 한 부정적인 형을 생성 합니다. 금형 ( 그림 2, 단계 1.1) 3D 인쇄는.stl 파일로 저장.
    참고: 금형 디자인 여기에 제시 된 ( 그림 1) 스테레오 리소 그래피 형식 (.stl) 파일은 https://morgridge.org/designs/에서 다운로드할 수.
  2. 인쇄 금형 photopolymer 3D 프린터 ( 그림 2, 단계 1.2)을 사용 하 여. 여러 개의 금형을 만들어 단일 인쇄에 가능 하다 면, 그래서 더 이상의 장치 주조 될 수 있다 PDMS의 단일 일괄 처리로.
    ....

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결과

ZWEDGI PDMS 미세 장치 관련 된 부상 치유 그리고 zebrafish 애벌레에서 자라나는 꼬리 지 느 러 미의 라이브 영상 (아래)의 주요 기능 4 개를 수용 하도록 설계 된 기능 compartmentalized 장치가 이다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있기 때문에 그리고 업계 표준 금형에서 잘 작동 뿐만 아니라 생체 적합성, PDMS zWEDGI 제작을 위해 선택 되었다. 또한, PDMS 만드는 장치 재사용 가능한 하드 또는 날카로운 모서리의 무효 장치 형성 되 면. zWEDGI 특별히 이미징, 3)의 꼬리 지 느 러 미, 그리고 4) 현미경 이미징, 부상에 대 한 적절 한 방향에서 1) 장치에 애벌레, 2) 자제의 로드를 허용 아래에서 상세히 설명.

로드

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토론

ZWEDGI 장치의 목적은 안정화와 고해상도 현미경 목표의 작은 작업 거리 물고기 방향을 이미징 3D 시간 경과 잡으려고. 이러한 설계 사양을 충족 하는 동안 그것은 또한 개선 라이브 이미징에 대 한 전통적인 천 기반 준비 에입니다. 제대로 하지 발생할 수 있습니다 결함이 있는 장치는, zWEDGI의 제작에는 3 개의 중요 한 단계 (아래 참조) 있습니다.

PDMS 준비 (그림 5A)

거품 방지, PDMS 추가 된 후 금형을 드. 모든 거품 기체 제거 후 제거 되었습니다 확인 하는 유리 디스크의 응용 프로그램에 주의 지불 합니다. 유리 디스크 공기는 되지 트랩 되 고 있음을 아래와 PDMS 되도록 경사에 적용 되어야 합니다. 먼지 과정의 대부분 단계 중 문제가 될 수 있습니다. 먼지를 방지 하려면 철저 하 게 청소 각 단계를 완료 하 고 단계 사이의 깨끗 한 후드 부분을 저장 .......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 기본 프로젝트 자금 광학 및 전산 장비에 대 한 연구 및 실험실을 위한 Morgridge 학회에서 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 NIH # R01GM102924에서 자금 인정 (아와 KWE). KH, JMS, RS, 아 KWE 잉태와 설계 연구. KH와 JMS DL, KP와 RS에서 지 원하는 모든 실험을 수행. KH, JS, RS, 아와 KWE 원고 쓰기에 공헌 했다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fabricate 금형
Solidworks Professional Accedemic Research 3D 모델링 소프트웨어Dassault SystemesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D 프린터3D Systems Inc.23200-9023D 시스템즈 Inc.
Accura 60 포토폴리머 수지3D Systems Inc.24075-9023D 시스템즈 Inc.
변성 알코올Sunnyside5613735Menards
UV 경화 후 장치3D Systems Inc.23363-101-003D 시스템즈 Inc.
TouchNTuff 니트릴 장갑Ansell92-600McMaster Carr
220B, 400B, 600 그릿 T414 블루-백 사포 Norton66261139359, 54, 52MSC
붕규산 유리 디스크, 직경 2인치McMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
초음파 세척기Branson1510R-MTH
이소프로필 소독용 알코올 70%Hydrox54845T43McMaster-Carr
10oz 투명 플라스틱 컵WNA 걸작557405아마존
6"공예 스틱Perfect StixCraft WTD-500Amazon
Name<strong>Company카탈로그 번호Comments
Fabricate zWEDGI PDMS 장치
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 Dow-Corning4019862Ellworth 접착제 
10mL 주사기Becton Dickinson305219Vitality Medical Inc
데시케이터Bel-Art SciencewareF42027-0000Amazon
4 in 래칫 바 클램프Pittsburgh68974Harbor Freight
lab ovenQuincy Lab Inc.20GC글로벌 산업용
핀셋 세트Aven549825McMaster-Carr
압축 공기 여과 노즐InnotechTA-N2-2000FT클린룸 공급
진공 벤치 바이스Wilton Tool Group63500MSC 산업용
55mm 유리 바닥 접시; 30mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리CellvisD60-30-1.5-NCellvis
플라즈마 클리너Harrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
NameCompany카탈로그 번호Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200GilsonF123601
100% 에탄올 (사용 전 물로 70%까지 희석)Pharmco-aaper111000200
전사 피펫Fisherbrand13-711-5AFisher Scientific
탈지유 분유2902887MP Biomedicals
이중 증류수
N-phenylthiorureaSigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
트리카인 (에틸 3-아미노벤조에이트)C-FINQ-UE웨스턴 케미컬
저융점 아가로스Sigma-AldrichA0701Sigma-Aldrich
열 블록 (건식 목욕 인큐베이터)Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 버퍼 
대형 오리피스 피펫 팁, 200 uLFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
일반 목적 피펫 팁, 200 uLFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 메스 블레이드 Feather2976아마존
25G 주사기 바늘BD BD305122Fisher Scientific
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Imaging
inverted microscope
Imaris 이미징 소프트웨어Bitplane

참고문헌

  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.

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