利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

摘要

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。

摘要

利用下一代测序技术（NGS）对循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析，已成为临床肿瘤学研究的重要工具。然而，由于血液中ctDNA含量极低，该方法在实际应用中面临灵敏度不足的挑战。此外，测序及后续分析过程可能产生假阳性或假阴性结果。为了提高ctDNA检测在临床应用中的可行性与可靠性，本文介绍一种可富集稀有突变用于测序的技术——稀有突变富集测序（Enrich Rare Mutation Sequencing, ER-Seq）。ER-Seq能够在1×10⁷个野生型核苷酸中识别出单个突变，因而有望成为检测极低频遗传变异的有力工具，对研究疾病异质性具有重要意义。该方法通过独特的测序接头连接，实现了ctDNA分子的高效回收，同时能够对正链和反链进行双向错误校正。我们选用的1021 kb探针可富集12种肿瘤中超过95%的肿瘤相关驱动突变所覆盖的目标区域。这一经济高效且通用的方法，能够独特地成功积累遗传数据。在有效滤除背景错误后，ER-Seq可精确检测稀有突变。本文通过一个案例研究，详细展示了探针设计、文库构建及目标DNA捕获的方法流程，并包含了数据分析的工作流程。该方法的实施通常需要1至2天。

引言

下一代测序（NGS）是一种强大的工具，可用于探究基因组的奥秘，能够提供大量信息，从而揭示遗传变异。NGS分析在临床中的应用日益普遍，尤其在个体化医学领域。然而，NGS最大的局限性之一是其较高的错误率。尽管该技术被认为适用于研究遗传性突变，但在分析来自"液体活检"的DNA时，对稀有突变的分析受到极大限制^1，2。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是血液中来自肿瘤细胞释放的无细胞DNA（cfDNA）。在大多数情况下，ctDNA的含量极低，使其检测与分析极具挑战性。然而，ctDNA具有诸多优势：其分离过程属于微创操作，可在肿瘤生长的早期阶段被检测到，ctDNA水平可反映治疗效果，且其携带了原发灶和转移灶中均存在的DNA突变^3,4,5。因此，随着下一代测序（NGS）技术及分析方法的快速发展，ctDNA检测的应用前景日益广阔。

尽管已采用多种高通量并行测序方法用于ctDNA检测，但由于其灵敏度低、缺乏通用性以及相对较高的成本等局限性，目前尚无任何一种方法被广泛接受用于临床常规检测⁶

方案

肿瘤标本和血液样本的获取均遵循经北京大学人民医院伦理委员会批准的方案。所有患者均签署了书面知情同意书，同意使用其样本。纳入研究的参与者需满足以下筛选标准：女性，晚期非小细胞肺癌，既往通过Sanger测序检测出EGFR p.L858R突变，接受过两轮厄洛替尼EGFR靶向治疗后疾病进展，以及应用ER-Seq技术对循环肿瘤DNA（ctDNA）进行分析，以探究耐药原因并寻找新的靶向药物。

1. 用于cfDNA和基因组DNA（gDNA）的外周血DNA提取

1. 在采集管中收集 10 mL 外周血，轻轻上下颠倒 6–8 次以混匀，避免细胞剪切。血液样本可在采集管中于 6–37 °C 条件下保存最长 72 小时。
2. 在室温下以 1600 (±150) ×g 离心 10 分钟。
3. 使用一次性移液器将上清液（血浆）从采集管转移至四个洁净的 2 mL 离心管中，离心管需适当标记，转移时勿扰动沉淀层（白细胞）。
4. 使用洁净的一次性移液器转移 1 mL 细胞至一个适当标记的 2 mL 离心管中。细胞可在进行步骤 1.8 前于 -20 °C 或更低温度保存。
5. 将血浆（来自步骤 1.3）在 4 °C 条件下以 16000 (±150) ×g 离心 10 分钟。
6. 将血浆转移至正确标记为 "plasma" 的洁净离心管中，底部保留约 0.1 mL 残留体积，以避免污染。将血浆保存于....

结果

ER-Seq 中使用的 1021 kb 探针富集的目标区域见表 1，覆盖了 12 种常见肿瘤中超过 95% 的基因突变。这些探针的广泛覆盖范围使该方法适用于大多数癌症患者。此外，我们独特的测序接头和基线数据库筛选技术能够精确检测罕见突变。

由于从外周血中提取的基因组DNA（gDNA）和游离DNA（cfDNA）具有不同的特性，其数据质量存在差异，具体取决于所使用的不同仪器和质量控制方法，如表2所示。成功提取的cfDNA在生物分析仪质控分析中应显示约170 bp的主峰，如图1所示。较大片段的存在提示可能存在基因组DNA的污染，最终产物中不应出现此类片段。本患者样本提取的DNA在质量和数量上均满足ER-Seq检测的要求（cfDNA - 42.6 ng；gDNA - 3.426 µg）。

讨论

循环肿瘤DNA（ctDNA）的存在早在30多年前即被发现，然而ctDNA分析在临床实践中仍未成为常规应用。随着ctDNA检测与分析技术的发展，人们对ctDNA方法实际应用的兴趣日益增加。利用ctDNA进行肿瘤监测为评估微小残留病灶、治疗反应以及在肿瘤进化和瘤内异质性背景下肿瘤的分子特征提供了微创手段^13,14。分析灵敏度和特异性的提升将促进上述各项应用的发展^15,16。

在本研究中，我们介绍了ER-Seq这一有前景的方法，旨在提高循环肿瘤DNA（ctDNA）检测的灵敏度，并以非小细胞肺癌（NSCLC）病例为例进行说明。与传统分析方法相比，ER-Seq中使用独特的测序接头显著提高了检测的灵敏度和特异性，表现为测序覆盖深度增加以及能够检测到低频突变（例如EGFR p.T790M（0.53%））。该患者样本中T790M的存在可能是导致厄洛替尼耐药的因素之一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAamp 循环核酸提取试剂盒	Qiagen	55114	外周血cfDNA的DNA提取
QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒	Qiagen	51105	外周血gDNA的DNA提取
Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32854	测定cfDNA浓度
Quant-iT dsDNA BR 检测试剂盒	Invitrogen	Q32853	测定文库浓度
Agilent DNA 1000 试剂	Agilent	5067-1504	测定cfDNA和文库片段
NEBNext UltraII DNA 文库构建试剂盒（适用于Illumina）	NEB	E7645L	文库构建
Agencourt SPRIselect 试剂	Beckman	B23317	DNA片段筛选与纯化
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	溶解
xGen Lockdown 探针	IDT	——	xGen 定制探针
人Cot-1 DNA	Life	15279-011	靶向DNA捕获
Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠	Life	65305	靶向DNA捕获
xGen Lockdown 试剂	IDT	1072281	靶向DNA捕获
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	捕获后PCR扩增文库
KAPA 文库定量试剂盒	KAPA	KK4602	测定文库浓度
NextSeq 500 高输出试剂盒 v2（150个循环）	illumina	FC-404-2002	测序
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	测定gDNA浓度
Qubit 2.0	Invitrogen		定量
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		孵育
16管DynaMagTM-2 磁力架	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina