Summary
我们提出了解剖垂体腺和准备垂体冠状区的发展小鼠的协议。
Abstract
脑垂体或垂体是一种重要的内分泌器官, 分泌荷尔蒙对体内稳态至关重要。它由两个腺体组成, 分别具有胚胎的起源和功能--垂体和垂体。发育中的小鼠垂体腺是微小的和微妙的细长椭圆形的形状。冠状部分是首选显示两个垂体和垂体在一个单一的切片的小鼠垂体。
该协议的目的是实现适当的垂体冠状部分与保存完好的组织结构从开发小鼠。在这个协议中, 我们详细地描述了如何解剖和处理脑垂体腺体正确地从开发小鼠。首先, 在解剖前, 用 transcardial 灌注甲醛来固定小鼠。然后应用三种不同的解剖技术, 根据小鼠的年龄, 获得完整的垂体腺。对于胚胎期小鼠 (E) 17.5-18.5 和4天的新生儿, 整个蝶鞍区包括蝶骨、腺体和三叉神经的解剖。对于幼崽的产后天数 (P) 5-14, 垂体腺连接与三叉神经是整体解剖。对于3周以上的小鼠, 脑垂体腺体是从周围组织中仔细解剖的。我们还显示如何在适当的方向上嵌入脑垂体腺体, 利用周围的组织作为地标, 以获得满意的冠状部分。这些方法可用于分析发育小鼠垂体腺的组织学和发育特征。
Introduction
脑垂体或垂体是一个重要的内分泌器官分泌荷尔蒙的必要的稳态1,2。从解剖学上来说, 脑垂体是一个由垂体和垂体组成的 "合一" 结构。这些部分有不同的胚胎起源和作用非常不同地。垂体来源于神经外胚层, 分泌催产素和抗利尿激素。垂体起源于拉特克的囊, 并负责释放激素, 包括生长激素, 催乳素, 促甲状腺激素, 卵泡刺激激素, 促黄体激素, 肾上腺皮质激素激素,黑刺激激素3,4,5。
脑垂体在小鼠颅骨的蝶骨 (蝶鞍鞍) 的背表面上, 由一个脆弱的茎附着在大脑的地板上。它由三叉神经和前在侧面围拢由光学交叉6,7。腺体有一个细长的椭圆形, 其长轴与头部垂直。在它的背表面上, 垂体和垂体可以很容易地被标定, 前者占据背内侧区, 后者在侧面和腹上伸展。在产后发育过程中, 垂体的大小在出生后的第一个月内迅速增加8,9。然而, 鼠脑垂体仍然是非常小的大小与平均重量1.9 毫克和轴直径的〜3毫米在成人10, 轴直径 2-2.5 毫米在产后日 21 (P21), 只有 1-1.5 毫米在 P0。
冠状节是首选显示两个垂体和垂体在一个单一的切片的小鼠垂体。然而, 由于其体积极小, 解剖结构独特, 因此需要一些技术技能来获得令人满意的垂体腺的冠状部分。在这篇视频文章中, 我们将展示如何解剖小鼠脑垂体, 并在不同发育阶段制备垂体冠状切面。
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Protocol
C57BL/6 鼠在特定的无病原体条件下繁殖。所有动物实验方法都符合第二军医大学动物保育和伦理委员会批准的指导方针.
1. 产后发育性垂体的解剖
- 执行麻醉: 将新生小鼠 (P0-P5) 放在被压碎的冰上以诱发体温过低。对于年龄超过5天的小鼠, 注射5% 的氨基甲酸乙酯 (30 和 #181; 体重的腹腔) 以诱导麻醉。评估对尾部/脚趾捏的反应。只有在鼠标对有害刺激没有反应时才进行.
- 将前爪和 hindpaws 轻轻地贴在一个能被固定在一个化学油烟罩内的工作表面上 ( 即 " 发泡胶"), 将鼠标固定在仰卧位 (背面与脸向上).
- 执行 transcardial 的灌注.
- 用外科剪刀切开小鼠胸腔以暴露心脏 (和其他胸腔器官).
- 用钝钳固定跳动的心脏, 并在左心室插入一个 26G (0.45 毫米) 针。针是附着在10毫升注射器充满素磷酸盐缓冲盐水 (PBS; 补充5毫克/毫升亚硝酸钠和 10 U/毫升肝素, pH 7.4, 温暖到37和 #176; 使用前)。立即用细剪刀切割右心房, 并开始灌注身体与温暖的 PBS, 直到液体退出右心房是明确的.
注意: 对于成年小鼠和 10-20 毫升 pbs, 需要大约 5-10 毫升 pbs. - 保持针到位, 并更换为4% 甲醛 (粉煤灰; pH 值 7.4) 的注射器。分别为新生儿和 P21 小鼠灌注10毫升和20毫升的定影液.
注意: 粉煤灰是有毒的。它可能导致皮肤和呼吸道过敏, 眼睛受损。戴上手套, 在化学罩下工作.
- 斩首固定的鼠标并用剪刀切开头骨骨.
- 用小镊子轻轻地将后脑从头骨底部抬起。在蝶鞍鞍的第一个标志, 停止举起, 但持有后脑, 切割垂体柄和神经纤维连接到大脑的底部与罚款剪刀。这一步是至关重要的, 以确保脑垂体是没有解除与大脑.
- 然后继续抬起大脑, 取出整个大脑, 使脑垂体完全暴露。剪下整个蝶鞍区, 包括垂体、外侧三叉神经、和剪刀下的蝶骨 (大约 3 x 和 #160; 5 mm 2 ).
- 将解剖的组织放入35毫米的盘中, 或将6个井板中的一个包含2毫升冷4% 的粉煤灰 (pH 7.4)。将组织固定在4和 #176; C 为40分钟为 P0 P7 垂体, 1 小时为 P14 垂体, 1.5 h 为 P21-P28 垂体, 和 3 h 为成人垂体.
- 垂体的进一步离解
- 用10毫升 PBS 洗涤固定组织, 5 个变化, 每15分钟。新生儿垂体与周围组织和蝶骨下方的结合, 可直接处理为脱水。然而, 5 天以上的小鼠垂体腺应在立体显微镜下进一步分离.
- 将固定组织放入含有1毫升 PBS 的 35 mm 盘中。对于 P5-P14 垂体, 用细钳和剪刀将神经和骨骼之间的结缔组织膜移除, 并仔细地将脑垂体与侧三叉神经分开, 但离开蝶鞍鞍。孤立的腺体和神经通过连接膜与 #34; H 和 #34; 类似的外观 ( 图 1B ).
- 对于 P21 和成人垂体, 移除垂体周围的神经和结缔组织膜, 并从周围组织中释放腺体。用晶状体清洁组织纸包裹脑垂体组织, 并将其放入嵌入盒中.
注: 用晶状体清洁纸巾包裹小脑垂体有助于防止任何潜在的标本丢失, 并在下面的石蜡植入过程中保持组织完整性。它可能没有必要包装的脑垂体, 如果它是在一个小瓶子处理冷冻嵌入程序.
2。石蜡嵌入和切片
- 在嵌入的磁带中脱水标本, 其中50%、65%、75% 和95% 乙醇溶液为15分钟。随后脱水以纯净的乙醇的3变动, 3 min 每个为 P0-P4 的腺体, 4 min 每 P5-P14 腺体和 5 min 每个为 P21 和更旧的腺体。与二甲苯清除, 3 变化, 3 分钟每 P0 P4 腺体, 4 分钟每 P5 P14 腺体, 5 分钟每 P21 和更老的腺体。渗透与熔融石蜡, 3 变化, 7 分钟, 每 P0-P4 腺体, 8 分钟, 其次是6分钟, 一次为 P5 和老腺体.
注: 组织加工的最佳参数可根据经验进行调整。要获得高质量的切片, 应避免不充分或过度脱水。用二甲苯清除组织也是如此. - 方向当在组织嵌入控制台系统上嵌入
- 时, 将标本从卡带中取出, 并将其放入带有熔融石蜡的基模半中。正确定位的嵌入垂体腺是必不可少的满足冠状切面.
- 对于 P21 和成人脑垂体, 将脑垂体与其短轴垂直于基底模的底面 (剖面平面) 定位。分别使用蝶骨和三叉神经作为 P0-P4 和 P5-P14 垂体的解剖标志。定向标本与他们的三叉神经或横向椎板的蝶骨垂直于底部表面的基础模具.
- 用加热好的镊子轻轻地将组织置于所需位置, 直到蜡变成半固态的冷却盘。用熔化的石蜡把模具顶起来。允许石蜡冷却, 直到蜡完全凝固.
注意: 在胚胎日 18.5 (E18.5) 的垂体可以用与新生儿垂体相同的方式治疗。但垂体 (拉特克和 #39; s 袋) 比 E16.5 年轻, 应嵌入整个头部, 并以矢状轴 (从口到枕) 垂直于基本模具的底面.
- 在-20 和 #176 上冷却石蜡块; C 为 10-20 min, 然后将其切成薄片 (4 和 #181; m 厚度是首选) 与切片。为获得满意的冠状切面, 在切片期间微调石蜡块的位置。在下面的过程中, 将组织切片安装到赖氨酸涂层的玻璃幻灯片上, 以防止切片脱落.
注: 另一种方法是, 在4和 #176 的蔗糖溶液 (PBS) 中, 试样可以在15%、30% (W/V) 中脱水, 直到它们沉到底部, 然后用相同的方向法嵌入到低温埋入化合物中, 然后在干冰中快速冷冻。然后将冰冻的组织块切成 8-10 和 #181 的切片; m 使用低温。然而, 冰冻切片的形态通常不如石蜡切片.
3。H 和 #38; E 染色和免疫荧光标记
- 在55和 #176 的热块上预热幻灯片; C 和脱与二甲苯, 2 变化, 每4分钟。用95% 乙醇两次和75% 乙醇两次脱水样品, 每份3分钟。用蒸馏水在振动筛上洗5分钟的幻灯片.
- 用于 H 和 #38; E 染色, 在明矾苏木精溶液中染色切片6分钟, 冲洗奔跑自来水为2分钟, 区分与0.2% 氨水为四十五年代, 和 re-rinse 在自来水中2分钟。然后将95% 乙醇用于1分钟的脱水切片, 以曙红为2分钟, 依次脱水、清除和装入.
- 免疫荧光标记
- 在室温下对含有 3% H 2 O 2 和 0.01% NaN 3 的部分进行处理, 使内生过氧化物。在一个高压锅中用沸腾的部分 (1 毫米 EDTA 和1毫米三盐酸, pH 7.4) 在一个压力锅中提取抗原2分钟, 用阻塞缓冲液 (PBS 中5% 山羊血清) 在30和 #176 中孵育.
- 用兔 anti-growth 激素 (GH) 抗体 (1:2、000) 或兔 anti-glial 纤维酸性蛋白 (胶质) 抗体 (1:2, 000) 在阻断缓冲液中过夜, 在4和 #176; C.
- 孵育部分与二次抗体 (山羊兔 IgG-HRP, 1:300 在阻拦缓冲) 为 35 min 在37和 #176; C.
- 在室温下使用 Biotinyl Tyramide (1:50 在含有 0.3% H 2 O 2 的三缓冲盐水中放大信号, 并以 Streptavidin-Alexa594 或 15 (488 在阻塞缓冲器中, 1:300 min, 30 和 #176 C) 进行可视化.
- Counterstain DAPI (PBS 中的50毫克/升) 在室温下为5分钟.
注意: 使用 Tyramide 信号放大 (TSA) 系统可能不需要放大信号。或者, 一个荧光共轭的二次抗体可以用来可视化信号.
- 使用带有 DAPI、德州红和 FITC 过滤器集的荧光显微镜获取图像, #215; 4/0.13 至 #215; 40/0.75 目标和5.0 像素摄像头。使用 360, 488, 594 nm 激光波长成像 DAPI, alexa 488-, 和 alexa 594 染色部分分别。优化的激光功率 (0.8 一般使用) 和曝光时间达到所需的水平为每个通道。在图像采集软件的控制下捕获图像, 然后使用图像处理软件叠加荧光图像.
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Representative Results
本协议提出了一种解剖小鼠垂体腺的方法。对新生小鼠, 从颅底解剖了整个蝶鞍区, 包括垂体、三叉神经和蝶骨下方。在过程中 (图 1A) 中, 细小而精致的脑垂体保持完好。对于5天以上的小鼠, 附着在三叉神经外侧的垂体腺则被隔离。从 P7 小鼠中分离出的脑垂体的总结构保持完好 (图 1B)。对于 P21 小鼠, 与新生小鼠相比, 垂体腺的大小明显增加。在切除周围组织 (图 1C) 时, 脑垂体腺被成功地隔离, 并有隐形损伤。
要查看垂体和垂体在一个单一的脑垂体切片的最大区域, 一个冠状区是首选。经解剖的垂体腺是正确的定向, 以达到满意的冠状段。H 和 #38; E 染色显示 P0、P7 和 P21 垂体腺体的垂体和垂体的保存形态良好 (图 2)。
处理后的切片也与免疫荧光标记相容。例如, 垂体和垂体分别显示 GH 和胶质蛋白的特定 immunolabeling (图 3)。
图 1: 剖产后发育的垂体腺.P0、P7 和 P21 小鼠的脑垂体和周围组织的背侧观。A, 前面;P, 后部;L, 左;R, 对;某人, 蝶骨;三叉神经;啊, 垂体;NH, 垂体。刻度线, 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠垂体腺的组织学.P0、P7、P21 小鼠垂体冠状段染色。(A、 B和C) 是日冕垂体的低放大率视图。(D、 E和F) 分别放大 (a、 B和C) 中的框架区域。缩放条形图 = 1 mm (A、B 和 C);和20µm (D、E 和 F). 请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 垂体腺有代表性的荧光染色.(A) GH (红色) 是在 P7 小鼠的垂体中明确表达的。(B) 在 A. (C) 中的框架区域的放大图像 (绿色) 是在 P21 小鼠的垂体中明确表达的。(D) 在 c 核中的框架区域的放大图像用 DAPI (蓝色) 染色。刻度栏 = 300 µm (A 和 C);和30µm (B 和 D)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
对于发育中的小鼠垂体, 由于其细小而脆弱的特征和独特的解剖特征6,8, 在技术上很难获得合适的冠状切面。因此, 一些研究小组选择 mid-sagittal 切片来分析胚胎和新生儿垂体的形态学11,12。虽然垂体的 mid-sagittal 部分也能够显示前、中、后叶在一个单一的切片, 冠状区是高度优先, 因为它可以显示这三叶的最大视图。特别是, 对于定量的研究, 如确定脑垂体的体积和面积和计数的凋亡和增殖细胞的数量, 冠状切面优于 mid-sagittal 节的代表。在这里, 我们提出了一个有用的方法解剖脑垂体腺体和准备垂体冠状段从开发小鼠。
为了避免在过程中损害垂体腺, 本协议中使用了几种技术。首先, 在解剖前, 用 transcardial 灌注甲醛来固定小鼠。这种固定剂不仅有助于保护器官的结构, 还能去除经常导致自动荧光13的红细胞。其次, 解剖整个蝶鞍区, 避免用任何 hard-surgical 工具接触垂体腺。周围组织有助于保持脑垂体在其原来的位置, 也作为地标的嵌入方向。使用这些方法, 小动物的产后垂体可以解剖, 同时减少不受欢迎的损害的可能性。
本议定书中的解剖程序也适用于分离未被灌注 pre-fixed 的小鼠垂体。在这种情况下, 应更加小心, 以避免任何不受欢迎的损害和腺体也应尽快解剖。
由于发育中的小鼠垂体的体积较小, 所以在嵌入时很难正确定位它们。该协议使用三叉神经或蝶骨作为地标, 使方向的步骤更容易。正确的定向垂体是实现冠状部分的必要条件。
总之, 我们提供了一个改进的脑垂体解剖和嵌入协议, 这是适合于不同发育阶段的小鼠。这些程序的应用可以获得满意的小鼠垂体冠状切面, 用于常规组织学、免疫组织化学、原位杂交和发育研究14的分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31201086、31470759和 31671219) 和上海自然科学基金 (12ZR1436900) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
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