Summary
Este protocolo describe una técnica para la observación de la fluorescencia verde en tiempo real la proteína (GFP) etiquetado proteína del transportador de glucosa 4 (GLUT4) trata sobre la estimulación de la insulina y la caracterización de la función biológica de CCR5 en la insulina, GLUT4 señalización vía con microscopía de deconvolución.
Abstract
Diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) es una crisis de salud global que se caracteriza por el deterioro y la inflamación crónica en los tejidos periféricos de la señalización de la insulina. El hipotálamo en sistema nervioso central (SNC) es el centro de control de energía y la insulina regulación de respuesta de señal. La inflamación crónica en los tejidos periféricos y desequilibrios de ciertas quimioquinas (como CCL5, TNFα y IL-6) contribuyen a la diabetes y la obesidad. Sin embargo, los mecanismos funcionales de conexión de quimiocinas y la regulación de la señal de insulina hipotalámica todavía siguen siendo confusos.
In vitro la neurona primaria cultura modelos son modelos convenientes y simples que pueden utilizarse para investigar la regulación de la señal de insulina en las neuronas hipotalámicas. En este estudio, presentamos exogeneous GLUT4 proteína conjugada con GFP (GFP-GLUT4) en neuronas hipotalámicas primarias para seguimiento de translocación de membrana GLUT4 sobre el estímulo de la insulina. Imágenes de Time-lapse de tráfico de la proteína GFP-GLUT4 se registraron por microscopia de deconvolución, que permitió a los usuarios generar imágenes de alta velocidad, alta resolución sin dañar las neuronas significativamente durante la realización del experimento. La contribución de CCR5 en la translocación de GLUT4 de insulina regulada se observó en neuronas hipotalámicas deficientes CCR5, que fueron aisladas y cultivadas de ratones knockout de CCR5. Nuestros resultados demostraron que la eficiencia de desplazamiento de la membrana GLUT4 se redujo en las neuronas hipotalámicas deficiencias CCR5 después del estímulo de la insulina.
Introduction
Diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) es una crisis de salud global. T2DM se caracteriza por el deterioro y la inflamación crónica en los tejidos periféricos de la señalización de la insulina. El hipotálamo es el centro de control que regula la homeostasis de energía, apetito y los ritmos circadianos del cuerpo. Lo más importante, el hipotálamo también interviene en la capacidad de respuesta de señal insulina para regular el metabolismo sistémico1,2,3,4,5. Interrumpir la insulina hipotalámica señalización vía podría inducir insulina resistencia6,7. El hipotálamo coordina el estado energético celular y la secreción de hormonas, como insulina y adipokines (por ejemplo, leptina) de los tejidos periféricos, para regular el metabolismo de la glucosa sistémica, sensibilidad de la insulina y la ingestión de alimentos. Atascamiento de la insulina al receptor de la insulina activa la insulina receptor sustrato (IRS) las proteínas, que luego activan moléculas de señalización corriente abajo insulina, como PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa) y AKT (proteína quinasa B (PKB/AKT)), para inducir el GLUT4 desplazamiento de la membrana. Las neuronas no son el objetivo principal para la captación de glucosa en respuesta a la insulina; sin embargo, se han identificado niveles significativos de la expresión de GLUT4 en la región del hipotálamo núcleo arcuato (ARC). Por lo tanto, la regulación de GLUT4 en las neuronas hipotalámicas puede desempeñar un papel importante en la señalización en el eje cerebro-periférico de la insulina.
Muchos estudios han sugerido que la inflamación crónica y quimiocinas inflamatorias en el hipotálamo también juegan un papel importante en el desarrollo de diabetes y obesidad, y la inhibición de la inflamación hipotalámica puede revertir la resistencia a la insulina inducida por la dieta 8 , 9 , 10. por otra parte, chemokine-CCL5 (ligando de adorno C C 5, también conocido como RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) y sus niveles de receptor CCR5 también correlacionar con el desarrollo de T2DM11,12. Los papeles de CCL5 y CCR5 en metabolismo de la glucosa y la función de insulina siguen siendo confusos. Un estudio reportó que la deficiencia CCR5 protegido ratones de inflamación inducida por la obesidad, el reclutamiento de macrófagos e insulina resistencia11; en contraste, otro estudio informó que la deficiencia CCR5 deteriora la tolerancia a la glucosa sistémica, así como músculo y adipocito insulina señalización12. CCL5 se encuentra aumentar la captación de glucosa en las células T y para reducir la ingesta de alimentos por su acción sobre el hipotálamo13,14, sin embargo, tanto el mecanismo de acción y los receptores implicados son todavía ser identificado.
Es difícil estudiar los mecanismos celulares subyacentes el efecto de la inflamación de los tejidos periféricos a insulina en las neuronas hipotalámicas. Esto es debido a regulaciones de retroalimentación circuito celulares heterogeneidad y neurona. Por esta razón, un modelo de cultivo en vitro célula proporciona un modelo limpio para investigar los efectos de las quimioquinas en la regulación de la señal de insulina hipotalámica. Aunque hay que muchas líneas de células neuronales hipotalámicas inmortalizadas para uso de la investigación establecieron, estas líneas celulares expresaron marcadores diferentes y por lo tanto, representan diferentes tipos de neuronas hipotalámicas15. A pesar de que las culturas hipotalámicas primarias pueden ser difíciles de mantener, puede proporcionar la respuesta más realista de las neuronas hipotalámicas sobre el estímulo de la insulina y también puede evitar el potencial de efectos desconocidos que entran en juegan cuando se mantienen las células a largo plazo en medio de cultivo con factores de crecimiento artificiales.
Adjunto, utilizar las neuronas hipotalámicas primarias de CCR5 nocaut (CCR5- / -) ratón y del ratón C57BL/6 tipo salvaje (WT) y transfectar ambos tipos de células con estructura de GFP-GLUT4. Para investigar la contribución de CCR5 a la insulina mediada por GLUT4 membrana trata, GFP-GLUT4 transfectadas las neuronas fueron tratadas con insulina o CCL5 recombinante. A continuación se caracteriza el movimiento de GFP-GLUT4 en la membrana plasmática en las neuronas hipotalámicas primarias con microscopía de deconvolución.
Protocol
Todos los protocolos y métodos utilizados en sujetos animales han sido aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités de uso (IACUC) de la Universidad médica de Taipei (números de protocolo: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primaria neurona cultura
- Preparación antes de la cultura
- Capa de los platos de la cultura con poly-D-lisina (tabla 1) un día antes de la cultura. Para un plato de 6 pocillos, agregar 1.5 mL poly-D-lisina (0,05 mg/mL) en cada pocillo. Para vivir-la proyección de imagen, células en cultivo en un cubreobjetos de 12 x 12 mm en una placa de 6 pozos recubierto estándar.
- Quitar o recicle el poly-D-lisina y lavar los platos dos veces con 2 mL ddH2O.
- Preparar las herramientas quirúrgicas: un par de tijeras micro disección, pinzas de punta curva y pinzas con punta recta estándar. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y mantenerlos en etanol al 75% durante la cirugía.
- Platos de petri de 10 cm se llenan de medio de lavado de 20 mL (tabla 1) y mantener en hielo.
- Llene un tubo de ensayo de 15 mL con medio de lavado de 15 mL y mantenga el tubo en hielo.
- Aislamiento de tejido cerebral de regiones diferentes del cerebro
- Sacrificio de ratones hembra embarazadas de 16-19 días con protocolos estándar euthanization colocando ratones en una jaula sin ventilación y luego intoxicación con CO2. E15.5 ~ E16.5 embriones se recomiendan el cultivo neuronal hipotalámico y E16.5 ~ E17.5 son más adecuados para el cultivo neuronal hippocampal y cortical.
- Esterilizar la plataforma, microscopio de disección y las herramientas de cirugía con etanol al 75% para evitar la contaminación.
- Corte alrededor de la zona del cordón umbilical (área rojo oscuro, figura 1A, 1B dash línea) para aislar los cachorros fácilmente sin dañarlos (figura 1, D 1).
- Retirar la parte principal de cada perrito con un par de tijeras (Figura 1E, F), entonces Fije la porción principal en su lugar utilizando la pinza recta punta fina para la región del ojo (figura 1). Uso que otro fino con punta curva pinzas para quitar la piel externa y el cráneo de dos lados y retire de la parte anterior a la dirección dorsal (figura 1 H, negro flecha apunte a la dirección). El cerebro debe ser aislado sin ningún daño (figura 1I).
Nota: Es esencial para mantener la integridad del cerebro para asegurar la precisión cuando el aislamiento de regiones distintas del cerebro. - Mantener cerebros aislados en una placa Petri limpiarla con medio helada lavado para los pasos siguientes.
- Hacia el cerebro y mantener el lado ventral. El hipotálamo es una estructura redonda en el centro del cerebro (Figura 1J, puntas de flechas a la región hipotalámica). Aislar el tejido hipotalámico con pinza curvada punta fina. Quitar las meninges (que tienen un color rojo amarillento) con cuidado.
PRECAUCIÓN: Eliminación completa de las meninges es un paso crítico para evitar la contaminación del fibroblasto. - Sostenga el lóbulo olfatorio con las pinzas afiladas y desprenderse las meninges finas que rodean todo el cerebro con el fórceps curvo (figura 1 K, L).
- El hipocampo es una forma de plátano que se encaja en la parte inferior de la corteza. Tirón en la parte inferior de la corteza y separar el hipocampo la corteza tirando hacia el lado con el fórceps curvo (figura 1 MN y O). Asegúrese de quitar todas las meninges restantes que rodea el tejido cerebral.
- Cuando todas las regiones del cerebro se han aislado, cortar estos tejidos en los tubos de 15 mL que contiene medio de colada helada con la ayuda de las pinzas (paso 1.1.5).
Nota: Los tejidos de cerebro pueden conservarse en el medio de lavado helada de 2-3 h.
- Cultura, la galjanoplastia y la digestión del tejido
- Enjuague los tejidos por inversión del tubo de 15 mL que contiene el tejido 2 - 3 veces y luego mantenga el tubo recto para permitir que los tejidos colocar abajo (1-3 min).
- Retire el medio superior utilizando el pipeta Pasteur de vidrio conectado a un sistema de vacío. Para lavar el tejido, añada 15 mL hielo lavado frío medio e invertir el tubo de 2 - 3 veces. Repita los pasos de lavado 3 veces antes del siguiente paso.
PRECAUCIÓN: Sea cuidadoso de los tejidos en la parte inferior cuando quite el medio superior con un sistema de vacío. - Después del último lavado, eliminar el medio de lavado con la ayuda de una pipeta de 1 mL.
- Incubar los tejidos con tampón de digestión de tripsina papaína (tabla 1) en un baño de agua de 37 ° C durante 7-14 minutos agitar los tubos cada dos minutos para todos los tejidos están expuestos adecuadamente al buffer de digestión.
Nota: Tiempo de incubación y el volumen de buffer de digestión pueden ajustarse según el tamaño del tejido. Para el tejido hipotalámico de 6-8 cachorros, se recomienda 300 μL papaína-tripsina digestión buffer y 7 min tiempo de incubación. Tejido más requerirá más tampón de digestión. - Neutralizar la actividad de la enzima mediante la adición de 1 volumen de suero bovino fetal. Agite el tubo de ensayo 3 - 5 veces a temperatura ambiente.
- Mantenga el tubo en los estantes y esperar 1-2 minutos permitir que los tejidos colocar abajo; Quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL.
- Añadir 6 mL de la galjanoplastia medio (tabla 1) en el tubo de ensayo y la pipeta el tejido hacia arriba y abajo 50 veces con una pipeta 5 mL suavemente (para una placa de 6 pozos, medio de chapado de 1,5 mL por pozo se recomienda). Mayoría de las células se disocia en las células después de repetido el pipeteo.
Nota: Tratar de evitar la formación de burbujas durante la realización de este paso. Mayoría de los laboratorios usa pipetas de pasto vidrio flameado a disociar el tejido. Una pipeta de 5 mL con una punta estrecha puede ser una buena alternativa para este paso. - Mantener un tubo en la parrilla y esperar 1-2 minutos permitir que los tejidos gruesos, no disociados a establecerse. Tomar la fase superior que contiene disociar las células a un tubo nuevo y diluir con placas medianas (5 x medio de placas de volumen por volumen 1 x de células disociadas. Por ejemplo, agregar 5 mL de medio para 1 células mL disociado de la galjanoplastia.)
- Calcular la densidad de células usando un hemocitómetro y el número de células de la semilla en la placa de cultivo con poly-D-lisina como en el paso 1.1.1. Se recomienda 2-4 x 105 células por pozo para un plato de plato bien 6/35 mm se recomienda para estudios de imagen de la neurona. Una densidad más alta se necesitarían para el análisis y colección de proteína.
Nota: No añadir demasiado medio de galjanoplastia, medio de galjanoplastia de 1-1.5 mL en un plato de 6 bien es suficiente para el accesorio. Una cantidad excesiva de medio prolongará el tiempo necesario para la fijación correcta de la célula. - Espere 2-3 h y compruebe las neuronas sembradas bajo el microscopio. Las neuronas se comienzan a crecer neuritis cuando coloque correctamente.
- Retire el medio forro y añadir 2 mL calentada lavado mediano (37 ° C) en el plato para lavar el medio forro. Repita este paso dos veces.
- Añadir 2 mL medio de cultivo completo (tabla 1) en cada pocillo en el plato de 6 pozos.
- Cambiar la mitad del medio cada 3-4 días. Preparar el medio completo fresco cada vez. Neuronas cultivadas de las regiones del cerebro de ratón diferente con diferente morfología y características (figura 2).
2. transfección de ADN plásmido en la neurona primaria con sistema de liposomas
PRECAUCIÓN: Para la transfección de la neurona, un kit de purificación de DNA de plásmido libre de endotoxinas (Tabla de materiales) se recomienda para la preparación de ADN. Precipitación del etanol adicional puede quitar exceso solvente y aumenta la concentración de ADN.
-
Basado en liposomas transfección de DNA en neuronas primarias.
Nota: El tiempo de transfección depende el estado de maduración necesario en los experimentos. Las neuronas hipotalámicas eran transfectadas en DIV 7-10 (DIV, días in vitro).- ADN: Preparación de la mezcla liposomas: diluir GFP-GLUT4 plásmido ADN16 (2 μg) en una microcentrífuga tubo con 300 μL de suero bajo cultura medio. Preparar otro tubo de microcentrífuga con 2 liposomas μl 300 μL del suero bajo medio de cultivo e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Combinar el contenido de los tubos e incubar durante 20-30 min a temperatura ambiente.
- Retire el medio de cultivo de neuronas de la placa de cultivo. Agregue la mezcla de liposomas ADN de 600 μL en cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 4-6 h.
- Después de 4-6 h, mezcla de liposomas ADN de Quite y agregue 2 mL medio de cultivo.
- Se observan señales fluorescentes, GFP solo como proteína GLUT4 conjugados con la etiqueta GFP (figura 3 y figura 4), después de 18-72 h.
3. grabación de imágenes en vivo
-
Preparar las células para viven imágenes
- PESO y el CCR5- / - neurona hipotalámica células expresan la proteína de fluorescencia verde etiquetada transportador de glucosa 4 (GLUT4-GFP) en la #1.5 (o 0,17 mm de espesor) la cultura cubreobjetos de cristal que ha sido previamente revestido con poly-D-lisina en el paso 1.1.1 en el pozo 6 placa.
- Cuidadosamente retire los cubreobjetos con neuronas con unas pinzas y colocar sobre el portaobjetos con cuidado.
- Retire el exceso medio/líquido con toallitas de tarea delicada. Doble las toallitas dos veces y les Coloque cuidadosamente sobre el cubreobjetos. Presione suavemente hacia abajo las toallitas sin mover el cubreobjetos.
PRECAUCIÓN: No presione con fuerza el cubreobjetos contra el portaobjetos de cristal. El propósito de este paso es asegurar que el cubreobjetos no mover/deriva en la adquisición de la imagen causada por la fuerza de flotación. - Coloque el cubreobjetos y portaobjetos en la platina del microscopio deconvolución, con el cubreobjetos hacia abajo y asegurado adecuadamente. Este paso es asegurar que la posición de la diapositiva permanece constante por lo que los usuarios pueden seguir el mismo conjunto de células de la blanco después.
- Observar el peso y el CCR5- / - neurona hipotalámica células con un 60 x / 1.42 NA aceite inmersión objetivo.
- Tratar las muestras de la celda seleccionada con CCL5 (10 ng/mL) o insulina (10 U/mL) para un mínimo añadir 1,5 μl de insulina diluida en el borde del cubreobjetos.
- Visualizar y grabar las muestras de la celda seleccionada inmediatamente. Programa el software de grabación de vídeo para grabar durante 30 minutos.
-
Microscopia de deconvolución y análisis
Nota: Esta parte del protocolo requiere el uso de un microscopio de deconvolución y software especializado para el análisis.- Encienda el sistema de proyección de imagen, permiten la platina del microscopio inicializar correctamente y luego encienda la fuente de luz LED.
- Agregar aceite de inmersión (índice de refracción 1.520 muestras vivo a 37 ° C) en una lente de objetivo de 60 x 1.42 NA. Colocar el portaobjetos de la muestra en el microscopio con el cubreobjetos hacia el objetivo y fijar correctamente la corredera.
- Utilice iluminación de campo claro o de la fluorescencia para identificar las células diana. Ajustar el enfoque hasta que se observan claramente las células diana. No mueva el objetivo fuera del área del cubreobjetos para evitar arañazos innecesarios.
- Identificar verde proteína de fluorescencia conjugado transportador de glucosa 4 (GLUT4-GFP) por la señal de la GFP. Identificar las células de la blanco deseada para la adquisición de la imagen. Posición de celda de destino seleccionado puede ser memorizado para futuras consultas (figura 4).
- Configuración de parámetros experimentales apropiados (incluyendo número de píxeles, longitud de onda de excitación, porcentaje de transmisión, tiempo de exposición, espesor de la pila, intervalo de tiempo y tiempo total de proyección de imagen) en cada célula de la blanco. Para este experimento, el número de píxeles de la imagen fue fijado en 512 x 512 (puede ser fijado a 1.024 x 1.024 para mayor resolución) para señales de GFP. El tiempo de exposición fue establecido entre 0.025 a 0.05 s cada 5 minutos menor lateral x, y, y ajustes de z puede ser controlado por el software recomendado ( tablademateriales ).
- Establezca el parámetro de exposición de aproximadamente 2.000 a 3.000 cargos para lograr la intensidad de píxel máximo. Para minimizar la fluorescencia fotoblanqueo, reducir el porcentaje de transmisión de luz de excitación tanto como sea posible mientras que el mantenimiento de la exposición tiempo menos de 1 s. Repita estos pasos para cada canal de fluorescencia adicional (es) y cada área individual de interés.
- Establecer el límite superior e inferior de la pila de Z en cada célula de la blanco. Esto se logra mediante el movimiento de la platina del microscopio hasta que la parte superior e inferior de la célula diana están ligeramente fuera de foco. Los usuarios pueden ajustar la resolución del eje z estableciendo el número de imágenes entre el límite superior e inferior (que se puede hacer mediante el establecimiento de la distancia entre cada imagen).
- Pilas de imágenes deconvolución y posteriormente analizadas con la ayuda del software respectivo – velocidad de PerkinElmer en este caso.
Representative Results
Las neuronas hipotalámicas cultivadas de ratones identificaron más immunostaining con proteína microtubule-asociado de proteína específica hipotalámico - anticuerpo de la pro-opiomelanocortina (POMC) y marcador neuronal - 2 (MAP2) (figura 2A). Confirmamos que las neuronas hipotalámicas cultivadas primarias expresaron proteína hipotalámica POMC. La expresión del receptor CCR5 y CCL5 en neuronas hipotalámicas eran identificadas con anticuerpos específicos y co marcados con anticuerpos POMC (figura 2A, 2B).
Después de 3 días de cultivo, las neuronas fueron transfectadas con GFP ADN (figura 3) o GFP conjugado GLUT4 (figura 4). Expresión de GFP se encuentra todo que el celular sin un patrón específico (figura 3) pero el GLUT4-GFP se expresa como una estructura punteada en el citosol (figura 4). El kit de transfección utilizado en este estudio no es el método más eficiente para la transfección de la neurona; sin embargo, es un método menos estricto para la mejor supervivencia de la célula después de la transfección, que contribuye al mejor celular de vivir la proyección de imagen y grabación más adelante. Las imágenes de neuronas expresa GFP-GLUT4 fueron tomadas antes películas de Time-lapse (Figura 4A-B, complementario video 1, 2) sobre insulina estimulación o estimulación CCL5 (figura 4, 3 video complementario). Las señales de GFP y GFP-GLUT4 son claras y fuertes en las neuronas.
Las neuronas hipotalámicas con transfección de GLUT4-GFP más fueron tratadas con insulina (40 U) para caracterizar el tráfico de GFP-GLUT4. Videos reprochable del movimiento del GLUT4-GFP sobre el estímulo de la insulina en las neuronas hipotalámicas- / - WT y CCR5 se muestran como Video 1 y Video 2, respectivamente.
Figura 1: aislamiento de tejidos de diferentes regiones del cerebro de ratón en la fase embrionaria (día 16,5). (A, D) Los pasos involucrados en la separación de los cachorros de la placenta. (E, F) La disección de una cabeza de cachorro del cuerpo. (G-I) Los pasos implicados en el aislamiento de todo el cerebro del cráneo. Los puntos de la flecha negra en la dirección al ser tirada mientras que quita el cráneo con unas pinzas. (J) el aislamiento del hipotálamo. La flecha negra señala la región hipotalámica entre pinzas. (K-L) Aislamiento de la corteza del cerebro del ratón. El asterisco negro indica la región cortical del cerebro del ratón y la flecha blanca apunte a la separación de la corteza de todo el cerebro. (M-o) La separación de la porción del hipocampo de la corteza. La flecha blanca superior marca el tejido hippocampal y la flecha blanca inferior marca el tejido cortical. Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 μm (G-O). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización del marcador neuronal hipotalámico - POMC y la coexpresión de CCL5 y CCR5. (A) primario neuronas hipotalámicas cultivadas fueron etiquetadas con marcador neuronal hipotalámico - POMC (rojo), la coexpresión de CCR5 (verde) y neurona marcador MAP2 (gris). (B) las CCL5 (verde) expresión en neuronas hipotalámicas positivo de POMC (rojo) (adaptado de los datos complementarios de referencia17). Aquí, DAPI había etiquetado el núcleo con el color azul. Barras de escala = 50 μm en (A) y (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: expresión de la proteína GFP en neuronas primarias ratón. GFP plasmid DNA transfected en neuronas cultivadas primarias después de la cultura 4 días (DIV4) con liposomas y expresado por otros 3 días (DIV7). (A-B) GFP se expresa en neuritis y soma. (C-D) Neuronas con transfección falsa; DAPI había etiquetado el núcleo (B, D). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: las instantáneas de GFP-GLUT4 en las neuronas hipotalámicas. (A, C) GLUT4 GFP proteína había expresado en neuronas hipotalámicas de tipo salvaje (WT) y (B) las neuronas hipotalámicas- / - CCR5. Las neuronas fueron estimuladas con insulina (A, B) o CCL5 (C). Las flechas señalan el GLUT4 de GFP punteado en la neuritis antes (-) y después (+) insulina o CCL5 estimulación y asteriscos señalan a la superficie GLUT4-GFP antes (-) y después (+) CCL5 estimulación en (C). (Figura adaptada de referencia17). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 5 x Buffer Borade | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768 | g 1,55 |
| Bórax | Sigma-Aldrich | 71997 | 2,375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrado, mantener a 4 ° C | |||
| 20 x bolsa Poly-D-lisina | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| Poly-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrado, mantener a-20 ° C | |||
| 1 x Poly-D-lisina | Volumen | ||
| 20 x Poly-D-lisina | 5 mL | ||
| 5 x Buffer Borade | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| Total | 100 mL | ||
| Mantener a 4 ° C | |||
| Medio de lavado | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| DMEM alta glucosa | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiótico Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Total | 500 mL | ||
| Mantener a 4° C | |||
| Tampón de digestión tripsina papaína: | Empresa | Número de catálogo | Concentración de volumen Final |
| Papaína (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 μl (2 mg/mL) |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0,05%) |
| Medio de lavado | 600 ΜL | ||
| Total | 1000 ΜL | ||
| Mantener a-20 ° C | |||
| Medio de la galjanoplastia: | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| Medio de Neurobasal | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Suero bovino fetal | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamato (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiótico Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Total | 200 mL | ||
| Mantener a 4 ° C | |||
| Medio de cultivo completo | Empresa | Número de catálogo | Volumen |
| Medio de Neurobasal | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| Suplemento de N2 (x 100) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 suplemento (x 50) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamato (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiótico Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Total | 100 mL | ||
| Recién preparado |
Tabla 1: Digestión de buffer y los medios de comunicación composición utilizada en este estudio.
Video adicional 1: Insulina estimulada movimiento GFP-GLUT4 en las neuronas hipotalámicas WT. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video adicional 2: Insulina estimulada movimiento GFP-GLUT4 en las neuronas hipotalámicas- / - CCR5. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video adicional 3: CCL5 estimulado movimiento GFP-GLUT4 en las neuronas hipotalámicas de WT (Adaptado de la referencia17del vídeo). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
La capacidad para controlar células vivas, sobre el estímulo CCL5 o insulina, es críticamente importante para estudiar el efecto rápido de CCL5 o insulina en movimiento del GLUT4. De hecho, nos permite visualizar la diferencia significativa entre peso y CCR5- / - hipotálamo las neuronas sobre el estímulo de la insulina. Hemos realizado el etiquetado superficial de proteína endógena de GLUT4 en WT y CCR5- / - hipotálamo las neuronas en diferentes momentos después de la estimulación de insulina17. El etiquetado de proteínas de la superficie celular requiere alta especificidad del anticuerpo con bajo fondo. Además, la cuantificación de la fluorescencia superficial también puede ser difícil y desperdiciador de tiempo. Así, grabación Time-lapse nos permite estar seguros de que el efecto de CCL5 o la insulina es un verdadero cambio fisiológico basado en condiciones experimentales, en lugar de una variación estadística. Junto con superficie de etiquetado de GLUT4 endógeno, proporciona fuerte evidencia y experimentos para demostrar cómo CCL5 y CCR5 participan en la translocación de GLUT4 y la señalización de la insulina.
En estudios de biología molecular y biología celular moderna, muchos experimentos requieren la utilización de microscopía de fluorescencia. Esta tecnología permite a los científicos a visualizar la relación espacial entre las proteínas y organelos celulares, además de la dirección del movimiento y velocidad, efectos estimulantes, cambios morfológicos y tráfico de proteínas. Sin embargo, esta tecnología todavía tiene su limitación: cuando se excitan los fluoróforos, las señales emitidas desde la proteína diana (o área) pueden ser abrumadas por fluorescencia del fondo. Como resultado, imágenes de fluorescencia pueden aparecer borrosos con señales esperadas enterradas profundamente en las señales de fondo. Este fenómeno es especialmente evidente por la observación de las proteínas de membrana-limitan.
Total interna reflexión fluorescencia microscopía (TIRFM) fue desarrollado para superar esta dificultad. Permite a los científicos a visualizar la excitación de fluoróforos superficie limite seleccionado sin afectar el fondo fluoróforos. Permite a los científicos caracterizar selectivamente características y acontecimientos en una región superficial muy delgada como una membrana plasmática. Microscopia de la deconvolución es una imagen computacionalmente intensiva elaboración técnica que es posible con la ayuda de los avances tecnológicos en los últimos años. Se ha utilizado con frecuencia para mejorar la resolución de la imagen de fluorescencia digital. Como se mencionó anteriormente, cuando fluoróforos son ser excitados por cualquier tipo de iluminación (como láser o LED), los fluoróforos emitirá señales de luz sin importar si están en foco o no, entonces la imagen será borrosa. Este desenfoque es causada por un fenómeno llamado "Punto de extensión función" (PSF), como luz proveniente de una pequeña fuente fluorescente (punto brillante) se extendió aún más y convertirse en fuera de foco (blur). En principio, este evento produce una señal fluorescente en forma de reloj de arena-como, y una imagen de fluorescencia puede ser formada por numerosos tales señales luminosas. El proceso de deconvolución puede reasignar todas las señales de fluorescencia a su original forma de punto brillante y eliminar la mayor parte de la luz fuera de enfoque para mejorar el contraste de la imagen.
En los últimos años, los algoritmos de deconvolución han generado imágenes con una resolución comparable a la de un microscopio confocal. Por otra parte, en comparación con el TIRFM, lo que impide que fuera de enfoque desenfoque detectados en una región limitada de la excitación, microscopía de amplio campo permite toda luz las señales para ser detectado y reasigna a su fuente a través del proceso de deconvolución. Por lo tanto, en la práctica, microscopia de deconvolución se ha convertido en no sólo un método más eficiente de adquisición de imagen, sino también un método más rentable en comparación con la microscopía TIRF.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos por las ayudas proporcionadas por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán - pago MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), salud y bienestar de productos de tabaco - MOHW106-TDU-B-212-144001 a S Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
