يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

6.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

نوفمبر 9, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

هنا يصف لنا أساليب لتقييم الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة. في التحليل القائم على الفحص المجهري، ندرس تعريب هذه الأجهزة بعد التحفيز مختصرة مع تدفق القص المسمى فلوريسسينتلي. ونحن أيضا اختبار تنشيط البروتينات المختلفة لمصلحة في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة المتحلل.

الملخص

به، أو هجرة يصل تدرج تشيمواتراكتانت، هو أفضل طريقة مفهومة من موجه الهجرة. كشفت دراسات استخدام أميبا الاجتماعية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن شبكة توصيل إشارة معقدة من مسارات متوازية يسهب الرد على تشيمواتراكتانتس، ويؤدي إلى بلمرة الأكتين متحيزة ونتوء من بسيودوبود في اتجاه التدرج. وفي المقابل، الآليات الجزيئية القيادة أنواع أخرى من الهجرة الموجهة، على سبيل المثال، بسبب التعرض للقص تدفق أو المجالات الكهربائية، غير معروفة. العديد من المنظمين إنزيمية يحمل التعريب الرائدة أو متخلفة عن حافة خلية المهاجرة، فضلا عن إظهار التغييرات عابر في الترجمة أو التنشيط بعد التحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت. لفهم الآليات الجزيئية لأنواع أخرى من الهجرة الموجهة قمنا بتطوير أسلوب يسمح فحص الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة استناداً إلى موجز (2-5 ق) التعرض لإمالة تدفق. يمكن تسليم هذا التحفيز في قناة أثناء التصوير الخلايا معربا عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المسمى فلوريسسينتلي لدراسة سلوك الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن حفز السكان خلية في لوحة، وتفكيك، وإيمونوبلوتيد باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف بالإصدارات النشطة من البروتينات ذات الاهتمام. من خلال الجمع بين كلا فحوصات، واحدة دراسة مجموعة واسعة من الجزيئات تفعيلها من خلال التغييرات في الترجمة سوبسيلولار و/أو الفسفرة. باستخدام هذا الأسلوب عقدنا العزم أن التحفيز الميكانيكي الحاد يؤدي تنشيط إشارة chemotactic أكتين وتوصيل الشبكات cytoskeleton. القدرة على دراسة الاستجابات الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحاد مهم لفهم أحداث المبادرة اللازمة للقص الناجمة عن تدفق الحركة. كما يوفر هذا النهج أداة لدراسة شبكة توصيل الإشارات chemotactic دون التباس تأثير مستقبلات chemoattractant.

المقدمة

هجرة خلايا حقيقية النواة متحيزة بمختلف الإشارات الكيميائية والفيزيائية في البيئة، بما في ذلك تدرجات تشيمواتراكتانتس قابلة للذوبان أو الركيزة زمنياً، وصلابة متغيرة من ركائز، المجالات الكهربائية، أو تدفق القص. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم في فهمنا للآليات الجزيئية التي يقود به، يعرف عن الأنواع الأخرى من الهجرة الموجهة وكيف تتكامل هذه الإشارات المتنوعة على المستوى الخلوي لإنتاج موحد المهاجرة استجابة.

موجه الهجرة صوب بتركيز متزايد chemoattractant ينطوي على ثلاثة مكونات السلوكية: حركية والاستشعار اتجاهي والأقطاب1. حركية يشير إلى الحركة العشوائية للخلايا التي حققها نتوء بسيودوبود. الاتجاه الاستشعار هو قدرة الخلية على الكشف عن مصدر تشيمواتراكتانت، التي يمكن أن تحدث حتى في المعطل تداولها الخلايا. قطبية يشير إلى التوزيع غير متناظرة أكثر استقرارا من المكونات داخل الخلايا بين الرائدة ومتخلفة عن حافة الخلية، مما يؤدي إلى استمرار زيادة في الحركة.

الاستجابة الخلوية إلى تشيمواتراكتانت يعتمد على نشاط أربع شبكات المعرفة النظرية التنظيمية: مستقبلات/ز البروتين وتوصيل الإشارة، cytoskeleton أكتين، والأقطاب1. تشيمواتراكتانت ملزم لمستقبلات البروتين-إلى جانب ز ينقل الإشارة عن طريق هيتيروتريميريك ز البروتينات α و βγ بشبكة توصيل الإشارات المصب، التي تضخم إشارة الاتجاه. مسارات متعددة داخل الشبكة توصيل الإشارات تعمل بالتوازي، وتغذي الشبكة cytoskeleton أكتين بلمرة الأكتين التحيز، وبروز ما يترتب عليه من بسيودوبود، في اتجاه التدرج. بين المنظمين هامة من إنزيمية هي رأس جتباسي، TorC2، فوسفوينوسيتيدي 3-كيناز (PI3K)، homolog الفوسفاتيز وتينسين (فتن)، وسيكلاسي جوانيليل. آليات التغذية المرتدة داخل شبكة توصيل الإشارات وبين توصيل الإشارة واكتين المزيد cytoskeleton شبكات تضخيم الاستجابة. أخيرا، شبكة قطبية غير المحددة بوضوح يتلقى الإدخال من cytoskeleton أكتين، وكذلك التحيز شبكة توصيل إشارة لتشجيع الهجرة المستمرة في اتجاه التدرج.

جزء كبير من فهمنا آليا من إنزيمية ممكناً بسبب تطوير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية فلوريسسينتلي معلم للمكونات المختلفة للشبكات التنظيمية. يتمتع العديد من إنزيمية المنظمون إلى توزيع غير متناظرة أما الجزيء التنظيمية نفسها أو نشاطها. على سبيل المثال، أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تعترف بتنشيط إصدارات صغيرة رأس جتباسيس و Rap1 – المجالات الملزمة Ras من Raf1 (المشار إليها ك RBD هنا) وترجمة رالجدس، على التوالي – إلى حافة الرائدة في مجال تشيموتاكسينج الخلية2،3. وبالمثل، PI3K وفي فوسفاتيديلينوسيتول المنتج (3,4,5)-تريسفوسفاتي (PIP3)، المعترف بها مجال التماثل (PH) بليكسترين، كما تظهر الترجمة في الجزء الأمامي من الخلية4،5. وفي المقابل، فتن 3-الفوسفاتيز، الذي يحول PIP3 إلى فوسفاتيديلينوسيتول (4، 5)-بيسفوسفاتي، يموضع إلى حافة الخلية6متخلفة. الأهم من ذلك، تغيير هذه أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على التعريب في الاستجابة للتحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت. علامات الرائدة، التي هي سيتوسوليك أو على نصائح نتوءات في خلية يستريح، ريلوكاليزي للقشرة، بينما تخلف علامات الحافة، التي التعريب القشرية وهي غائبة من نصائح نتوءات في خلية يستريح، أصبح سيتوسوليك بعد التحفيز. تحليل لتوزيع بيوسينسور في الاستجابة للتحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت يقلل مساهمة حركية والاستقطاب، التي كثيرا ما يتيه في الملاحظات. التحفيز العالمية أو موحدة لتعليق خلية مع تشيمواتراكتانت يستخدم أيضا كأداة لتقييم التغيرات السكانية على نطاق المنظومة في تفعيل البروتين، وغالباً ما تكتشف بالبروتين الفسفرة7،،من89 . هذا التحليل الكيميائية الحيوية يستخدم في المقام الأول للحصول على المعلومات الزمنية، بينما يتم استخدام الفحص المجهري لجمع معلومات زمنية ومكانية معا حول السلوك المكونات المختلفة للشبكات التنظيمية.

شبكة توصيل إشارة يتضمن الميزات نظام منفعل10،11. الاستجابة للمحفزات chemotactic أعلاه العتبة هي "اللورنوني" وعرض فترات صهر. يتم أيضا تشغيل ستوتشاستيكالي الردود ويمكن إظهار سلوك متذبذبة. يتم ترجمة الأحداث توصيل الإشارات إلى مناطق القشرة التي تنتشر كموجات12،13،،من1415. الأمام أو إلى الوراء، علامات يعينون على، أو ننأى عن المناطق النشطة من موجات نشر. بسبب منطقة المقاوم للحرارة الزائدة في منطقة نشطة، إبادة موجات توجه معاكس كما يلتقون. نشر موجات توصيل الإشارات تكمن وراء نتوءات الخلوية التي تتوسط الخلية الهجرة10.

الكثير من المعلومات المذكورة أعلاه على إنزيمية جاءت من الدراسات على الاميبا الاجتماعية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم، على الرغم من أن آليات تنظيمية مماثلة تنطبق أيضا على العَدلات وغيرها خلية الثدييات الأنواع16 . ديكتيوستيليوم هو كائن نموذج راسخة لديه ردا قويا من تشيموتاكتيك أثناء المجاعة، عند ترحيل آلاف خلايا مفردة نحو مركز لتجميع، تشكيل هيئة الاثمار متعددة الخلايا التي تحتوي على جراثيم في نهاية المطاف. إنزيمية ضروري أيضا خلال مرحلة نمو الخلايا المفردة لهذا الكائن لتحديد مصادر الغذاء البكتيرية. الأهم من ذلك، هجرة خلايا ديكتيوستيليوم واحد ملحوظ مماثل لهجرة العَدلات الثدييات أو خلايا السرطان المنتشر، كلها تخضع للهجرة أميبية النوع السريع جداً. وفي الواقع، هي حفظت كلا طبولوجيا الشبكات التنظيمية الشاملة، وكذلك العديد من مسارات توصيل الإشارات الفردية المعنية في إنزيمية بين ديكتيوستيليوم والثدييات الكريات البيضاء17. وعلاوة على ذلك، تستخدم الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، مستقبلات تيروسين مؤنزم (راديو وتلفزيون كوسوفو) بدلاً من جبكرس؛ ومع ذلك، رتكس قد تصب في شبكات مماثلة.

وعلى النقيض من إنزيمية، تفتقر إلى فهم دقيق للآليات مما يشير إلى محرك أقراص مختلف الأساليب الأخرى للهجرة الموجهة. وبالمثل للخلايا المهاجرة في تدرج chemoattractant عدة أفادت الدراسات التنشيط و/أو الترجمة من علامات النموذجية الرائدة، بما في ذلك بلمرة الأكتين، PIP3 و/أو خارج الخلية ينظم إشارة كيناز (إيرك) 1/2، على الأمامي خلايا التي تمر بموجة الهجرة استجابة للقص تدفق أو التغييرات في المجالات الكهربائية18،19،،من2021. ومع ذلك، في هذه الدراسات التعرض المستمر للحافز الذي أدى أيضا إلى الهجرة الخلية، ترك مفتوحاً السؤال عما إذا كانت، على سبيل المثال، ترجمة العلامات الرائدة على وجه التحديد في استجابة لحافز، أو إذا كانوا ببساطة المعربة في طليعة بسبب زيادة عدد بسيودوبودس في الجزء الأمامي من خلية ترحيل.

قمنا بتطوير الاختبارات التي تسمح لنا بمراقبة استجابة الخلايا لاضطراب ميكانيكي الحادة تسليمها كتدفق القص على حد سواء على مستوى السكان والخلايا الفردية22. مشابهة لتحفيز عالمية مع تشيمواتراكتانت، ستيمولا الحاديسمح نشوئها مع تدفق القص الدراسة الخلوية استجابة لحافز ميكانيكية دون مساهمة التباس من حركية أو القطبية. الجمع بين هذه الاختبارات الكيميائية الحيوية والمجهرية والاضطرابات الوراثية أو الدوائي يتيح لنا أن نتعلم حول المنبهات الميكانيكية كيف ينظر إليها والمنقولة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النهج أيضا طريقة جديدة للاستفادة من نظام المصب مستقبلات تشيمواتراكتانت في غياب تشيمواتراكتانت، وبالتالي عزل إشارة أكتين وتوصيل الشبكات cytoskeleton من المستقبلات/ز شبكة البروتين.

باستخدام التقنيات الموضحة أدناه ونحن مؤخرا أظهرت أن الإجهاد القص الحاد يؤدي إلى تنشيط مكونات متعددة إشارة chemotactic تنبيغ واكتين cytoskeleton شبكات22. عن طريق تطبيق حافز الميكانيكية الحادة على فترات متفاوتة، أظهرنا، وبالمثل إلى تشيمواتراكتانتس، الاستجابة للمحفزات الميكانيكية أيضا معارض ميزات نظام منفعل، بما في ذلك سلوك الاستجابة تحت اللورنوني تشبع الظروف ووجود فترة المقاوم للحرارة. وأخيراً، من خلال الجمع بين التحفيز الميكانيكية والكيميائية أظهرنا أن المحفزات هما تشتركان في إشارة توصيل أكتين سيتوسكيليتون شبكات والتي يرجح أن السماح لتكامل محفزات المتعددة للهجرة الخلية التحيز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-"إعداد الحلول"

  1. HL-5 إعداد الوسائط باستخدام ما يلي: سكر العنب 10 غرام/لتر، ببتون برتوس 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.965 غ/لتر Na 2 هبو 4 ·7H 2 س، خ 0.485 غرام/لتر 2 ص. ب 4، وكذلك، ما لم يبين خلاف ذلك، ستربتوميسين 0.03 غرام/لتر في المياه. اﻷوتوكﻻف المتوسطة وتخزين في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: بسبب الاختلافات بين استخراج ببتون والخميرة بروتيوسي المكتسبة من موردين مختلفين، وكذلك بين المجموعات الفردية، الأس الهيدروجيني لوسائل الإعلام قد تحتاج إلى تعديل لمجموعة نموذجية من 6.4 إلى 6.7.
  2. SM إعداد لوحات باستخدام ما يلي: 10 غرام/لتر سكر العنب، ببتون 10 غرام/لتر، 1 غرام/لتر الخميرة استخراج 2.31 غرام/لتر خ 2 ص 4، 1 غرام/لتر ك 2 هبو 4 واجار 20 غرام/لتر في المياه. اﻷوتوكﻻف، بارد، وصب 30 مل الحل أجار الواحدة 10 سم طبق بيتري. بمجرد أجار يتصلب، تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر 1-
  3. تحضير 10 × استخدام المخزن المؤقت للفوسفات (PB) 13.4 غرام/لتر Na 2 هبو 4 ·7H 2 س و 6.8 غرام/لتر خ 2 ص 4 في المياه. تخزين المخزون 10 x في 4 ° ديلوت جيم إلى س 1 مع المياه للاستخدام-
  4. إعداد المخزن المؤقت DB بتكميل 1 X PB مع 2 مم MgSO 4 و 0.2 مم كاكل 2-
  5. تحضير 100 ملم الكافيين في المياه. تخزين في − 20 درجة مئوية.
  6. إعداد 100 مم حل الأسهم المخيم بتذويب مونوهيدرات ملح الصوديوم المخيم في المياه.. إعداد 1 مم العامل المخزون في المياه.. تخزين كل الحلول الأسهم في − 20 ° C. تحضير المخيم الحل النهائي في التركيز المطلوب في DB في يوم التجربة.
    ملاحظة: حلول الأسهم يمكن إذابة تجميد بضع مرات.
  7. تحضير حمض الفوليك 25 مم 1 x في الجريدة الرسمية. إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم N 1 حتى يذوب المسحوق تماما. تخزين في − 20 درجة مئوية.
  8. إعداد المخزن المؤقت العينة x 3 باستخدام ما يلي: 187.5 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 6% (w/v) الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) والغليسيرول 30%، ديثيوثريتول 126 ملم و 0.03% (w/v) بروموفينول الأزرق. قاسمة ومخزن في − 20 ° C.
    1. مسبق استخدام، وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية والمضي قدما لإعداد نموذج المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز بإذابة 3 × عينة المخزن المؤقت إلى 1 x، وإضافة 50 مم NaF ومم 2 غ 3 فو 4 بيروفوسفات صوديوم 25 مم 1 x كاملة خالية من يدتا حوزتي المانع كوكتيل في المياه. إضافة مثبطات فورا قبل بدء الإجراء الموضح في الخطوات 3.1.2-3.1.3.
  9. إعداد 5 مم لاترونكولين الحل في [دمس]. قاسمة ومخزن في − 20 ° C.

2. إعداد الخلايا ديسكويديوم د

ملاحظة: الحفاظ على الخلايا ديسكويديوم دال- في وسائل الإعلام HL-5 أما في لوحات زراعة الأنسجة أو كما سبق وصف الثقافة في تعليق 23. عند الضرورة، تحويل الخلايا مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المسمى فلوريسسينتلي وفقا للبروتوكولات القياسية انهانسر 24. ويمكن الحصول على مختلف سلالات ديسكويديوم دال، فضلا عن والبلازميدات ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو جينات أخرى من الفائدة من مركز الأوراق المالية ديكتي (dictybase.org)-

  1. النمو ومجموعة من الخلايا النباتية ديسكويديوم د
    1. لتحليل الخلايا النباتية، تنمو خلايا البكتيريا الحد من عدد ماكروبينوسوميس، والتي عادة ما يلاحظ في حضور الخلايا المزروعة أكسينيكالي 25.
      1. تحضير ثقافة الكلبسيله الغازية بتطعيم عدد صغير من الخلايا من مخزون والغليسيرول أو من ثقافة سابقة إلى وحدة التخزين المطلوبة للمتوسطة HL-5 دون المضادات الحيوية. احتضان ثقافة البكتيرية في شاكر مداري 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز) في درجة حرارة الغرفة (20-22 درجة مئوية) حاء 16-18
        ملاحظة: ك. السلالة الغازية المستخدمة هنا غير ممرضة (انظر الجدول للمواد)-
    2. جمع ديسكويديوم دال- في مرحلة النمو الأسى من لوحات زراعة الأنسجة أو من ثقافة وقف، وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير حسب الشركة المصنعة ' تعليمات s. انتشار الخلايا ديسكويديوم دال- 5 1 × 10 ميليلتر 260 الغازية ك. تعليق على صفيحة SM. قم بتشغيل لوحة رأسا على عقب أسفل اليوم التالي. تنمو الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى تبدأ الخلايا ديسكويديوم دال- تطهير الحديقة البكتيرية ولكن قبل أن تبدأ تجميع (~ 36-48 ح)-
    3. جمع الخلايا ديسكويديوم دال في المخزن المؤقت لمل 5 DB بإلغاء لهم مع الناشرة زجاج. نقل الخلايا إلى أنبوب البولي بروبلين 50 مل. شطف اللوحة مع آخر 5 مل DB العازلة وتجمع مع التعليق الأصلي. ملء الأنبوب إلى 50 مل مع المخزن المؤقت DB.
    4. الطرد المركزي بتعليق ديسكويديوم د في غ س 360 للحد الأدنى 3-4 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 50 مل DB المخزن المؤقت. كرر الخطوات الغسيل حتى المادة طافية واضحة (يغسل ~ 3 إلى 4). ريسوسبيند بيليه الخلية الأخيرة في المخزن المؤقت DB إلى كثافة نهائي ~ 5 × 10 6 خلايا/مل.
  2. إعداد التجميع-الخلايا المختصة دال-ديسكويديوم
    1. وضع ديسكويديوم دال- الخلايا جوعاً ح 1 تليها ح 4 من المجاعة والنبض مع 50 نانومتر معسكر كل دقيقة 6 وفقا للمعيار بروتوكولات 23-
    2. وبعد التنمية، قياس الحجم النهائي لتعليق خلية.
    3. استناداً إلى العدد الأولى للخلايا المستخدمة للتنمية، وحساب كثافة الخلية تعليق نهائي-
      ملاحظة: إذا كان يتم تسليم معسكر في 100 ميليلتر حجم كل دقيقة 6، حجم الخلية زاد 1 مل لكل ساعة من النبض المخيم. وهكذا، الحجم النهائي للشروط القياسية باستخدام خلايا 7 8 × 10 مل 4 ديسيبل، بعد ح 4 التنمية 7 مل وكثافة الخلية النهائي ~1.1 x 10 7 خلايا/مل.

3. تحليل الكيمياء الحيوية "للخلية استجابة" للميكانيكية أو الكيميائية التحفيز

الخلايا
  1. الحادة الميكانيكية التحفيز للخلايا متبوعة تحلل الخلية
    1. لوحة 2 × 10 6 التجميع المختصة (من الخطوة 2، 2) بعد ح 4 من التنمية في الأطباق 35 ملم مع 2 مل DB. السماح للخلايا إرفاق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل DB. احتضان خلايا في DB مع الكافيين 2.5 ملم لمدة 30 دقيقة دون أي اضطراب الصفائح.
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا تحتاج إلى أن تعامل مع مثبط الدوائي، إضافة المطلوب تركيز مثبط أو نفس الحجم من المركبات المناسبة خلال باساليشن مع الكافيين.
    2. إلى تطبيق التحفيز الميكانيكي، ووضع اللوحة (في وقت واحد) على شاكر مداري وتشغيله فورا 150 لفة في الدقيقة (0.24 س ز) 5 س.
      ملاحظة: اللوحة يمكن أيضا يدوياً حفز الحركة بطريقة كروسويسي لما يقرب من 5 س.
    3. Aspirate المخزن المؤقت في أشير مرات بعد بدء التنشيط. فورا الخلايا بإضافة 100 ميليلتر عينة من المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز.
    4. وضع اللوحة على الجليد، وجمع في في أنبوب 1.5 مل. ل ' الوقت 0 '، الخلايا دون المصافحة. نقل الأنابيب إلى كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد تحلل مباشرة. المضي قدما في إيمونوبلوتينج أو تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
  2. التحفيز من الخلايا التي تحتوي تشيمواتراكتانت
    1. باسالاتي خلايا تجميع المختصة بعد ح 4 التنمية بسرعة الهز لهم حضور الكافيين 5 مم 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز) على شاكر مدارية لمدة 30 دقيقة. ز
      1. أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية في العاشر 360 للحد الأدنى 3-4 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 10 مل المثلج DB العازلة. كرر الخطوة الغسيل.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية الأخيرة في المخزن المؤقت DB المثلج لكثافة نهائي 4 × 10 7 خلايا/مل استناداً إلى عدد الخلايا الأولية المستخدمة لتطوير الخلايا (راجع الخطوة 2، 2). ستبقى على تعليق خلية في الثلج قبل ستيمولالتعاون.
      1. ميليلتر 50 ماصة 10 ميكرون مخيم أو مركبة في كوب البوليستيرين المفروضة على شاكر مداري.
    3. لتحفيز الخلايا، إضافة 450 ميليلتر من تعليق خلية المثلج في نفس كوب وفورا تشغيل شاكر 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز). وفي أوقات مختلفة بعد بدء التنشيط (مثلاً 10، 30، 45، 60، 120 s)، بإيجاز وقف شاكر وإخراج 50 ميليلتر مختبرين لتعليق خلية والخلايا قبل إضافتها إلى 1.5 مل أنابيب تحتوي على 25 ميليلتر 3 × عينة المخزن المؤقت.
      1. على ' الوقت 0 '، استخدام الخلايا من تعليق خلية المثلج أونستيمولاتيد.
        ملاحظة: هو درجة الحرارة النهائية لتعليق الخلية أثناء التحفيز ~ 9 ° ج 26. في ظل هذه الظروف يحدث استجابة ذروة قليلاً يتجاوز ذروة لاحظ التحفيز التي يؤديها في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، تشيمواتراكتانت حفز الخلايا ملتصقة على المجهر، أو التحفيز الميكانيكي للخلايا ملتصقة).
    4. نقل الأنابيب إلى كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد تحلل مباشرة. المضي قدما في إيمونوبلوتينج أو تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
  3. تحليل استجابة الخلايا من إيمونوبلوتينج
    1. تشغيل ليساتيس (من الخطوات 3.1.3 أو 3.2.4) على جل polyacrylamide تريس-HCl 4-15%، ونقل إلى غشاء فلوريد الفينيليدن، كتلة، وإيمونوبلوت مع PKC والرمات Ζ Thr410 (للكشف عن PKBR1 والرمات وبكبا والرمات). الكشف عن الإشارة بالحضانة مع الفجل البيروكسيديز مترافق أرنب المضادة الثانوي الأجسام المضادة، تليها تشيميلومينيسسينسي باستخدام تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة.
    2. لكشف البروتينات متعددة، الشريط وصمة عار مع تجريد المخزن المؤقت، وإعادة التحقيق مع جسم الأولية ضد والرمات-p42/44 MAPK Thr302/304 (للكشف عن والرمات-ERK2). تأكيد المساواة البروتين تحميل تلطيخ الغشاء فلوريد الفينيليدن مع "أخذ الأزرق الرائعة".

4. الحاد التحفيز الميكانيكي ويعيش التصوير من الخلايا المفردة في المجهر

    1. من تقييم لاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحاد باستخدام جهاز تدفق جمع وتمييع الخضري أو تجميع المختصة الخلايا إلى ~ 1 × 10 6 خلايا/مل في قاعدة البيانات كما هو موضح في الخطوات 2-1 و 2-2، على التوالي. تحميل ~ 600 ميليلتر في الشريحة مع قناة (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل). السماح للخلايا إرفاق للحد الأدنى 10 تأكد من أن كافة المداخل في الشريحة تمتلئ تماما. أعلى حتى مع المخزن المؤقت إضافية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: قد الشريحة خاصة تستخدم لتحليل المدخلات الثلاثة التي تصب في قنوات ضيقة، 1 ملم، ولكن الدمج ثم إلى قناة واحدة واسعة، 3 مم. ارتفاع القناة 0.4 مم. على الرغم من أن يتم مطلي الخلايا في جميع أنحاء القناة، فقط الجزء واسعة يتم تصويرها.
    2. تمرير أحد خطوط متصل بخزان 50 مل من خلال صمام حق استقبال وحدة فلويديك (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل). باستخدام البرمجيات للمضخة، تأكد من إغلاق الصمام (أي إلى اليسار). ملء الخزان بالديسيبل. تعيين الضغط على 50 [مبر]
      1. وقم بتشغيله. ملء وشطف السطر مع DB بالنقر على صمام لفتحه. قم بالضغط مرة أخرى إلى 0، ثم إغلاق الصمام بعد ~ 30 س.
    3. قم بتوصيل الخط واحد من المداخل الثلاثة على جانب واحد من الشريحة دون تعويض اللون أي فقاعات الهواء. سد مداخل اثنين آخرين. قم بتوصيل الخط من استنزاف لمدخل واحد على الجانب الثاني من الشريحة.
      ملاحظة: الأنابيب المستخدمة للمدخلات واستنزاف الخطوط في هذا الإعداد له قطر داخلي من 1.6 ملم.
    4. مكان الشريحة على المجهر تحت هدف جوي X 20. شطف القناة، تبديل الصمام فتح الخط، وانقر فوق " الضغط على "، والبدء في الضغط العالي ([مبر] ~ 50 أو ~ 40 داين/سم 2) لدفع السائل إلى استنزاف.
      1. عندما يخرج السائل من استنزاف، تقليل الضغط الخارجي إلى الصفر (أي. خطورة تدفق فقط، ~ 15 داين/سم 2)، ويستمر الشطف لتبديل س. ~ 30 الصمام إلى الموقف المعاكس لوقف التدفق.
    5. الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء إضاءة على مجهر مقلوب الأسفار تحت 40 × الهدف النفط فترات s 3. مع الصمام في موقف مغلقة، قم بالضغط في الضغط المطلوب، وعادة ما بين 15 و 40 داين/سم 2 (0-50 [مبر]).
    6. بعد الحصول على 5 إطارات، تقديم الحافز بتبديل الصمام على " فتح " الموقف. إيقاف التدفق بعد s 2-5 بتبديل الصمام إلى الاتجاه المعاكس-
      ملاحظة: لبعض أضعف أجهزة استشعار العوامل البيولوجية (مثل فتن وسينا ورالجدس) قد يكون ضروريا للخلايا الصورة باستخدام مجهر [كنفوكل] مجهزة 40 × الهدف النفط.
  2. اختبار تأثيرات مثبطات الدوائي في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحاد باستخدام جهاز تدفق
    1. لوحة خلايا في الشريحة مع قناة كما هو موضح في الخطوة 4.1.1. إعداد خطين: تمرير سطر واحد عن طريق صمام اليمنى الجبهة كما هو الحال في الخطوة 4.1.2، والثاني عن طريق الظهر غادر صمام. المشبك على الخط الأيسر ووضع الصمام " مغلقة " موقف (يسار). تعبئة خط واحد مع DB التي تحتوي على الأداة المناسبة، والثانية مع الحل الذي يحتوي على مثبط دوائية للفائدة (مثلاً 5 ميكرومتر لاترونكولين A)-
      ملاحظة: من الضروري أن المشبك فعلياً على الخط الأيسر نظراً " مغلقة " الموضع الأيسر فتح الصمام لهذا الخط.
    2. التعبئة وشطف خط الحق بتشغيل الضغط على 50 [مبر] وتبديل الصمام " فتح " موقف (يمين). التبديل الصمام إلى اليسار بعد ~ 30 س. التعبئة وشطف خط اليسار عن طريق إزالة المشبك للاتصال س. ~ 30 كل الخطوط إلى اثنين من مداخل على جانب واحد من الشريحة مع قناة وسد مدخل المتبقية والاتصال استنزاف إلى مدخل واحد على الجانب الثاني.
    3. تغسل الشريحة مع المخزن المؤقت في الخط الصحيح وأداء التحفيز في المخزن المؤقت لنفسه كما هو موضح في الخطوات 4.1.3 و 4.1.4 أعلاه.
      ملاحظة: على الرغم من أن الخط الصحيح الذي اختير كأول واحد في هذا الإعداد، يمكن عكس الترتيب.
    4. عقب التحفيز، وتبديل صمام لفتح الخط الصحيح عند ضغط الصفر (أي خطورة تدفق فقط، ~ 15 داين/سم 2). إزالة المشبك من الخط الأيسر وتبديل الصمام إلى اليسار لفتح هذا الخط. المشبك السطر الأول-
    5. بعد تشغيل 3-5 مل من المخزن المؤقت مع المانع من خلال، تبديل الصمام الحق في وقف التدفق، واحتضان الخلايا مع مثبط لطول الفترة الزمنية المطلوبة (مثلاً 15 دقيقة). تشغيل التدفق بتبديل صمام كل دقيقة ~ 10 ~ 15 ثانية لمنع الحرمان من الأكسجين. كرر التحفيز مع السطر الثاني-
  3. طريقة بديلة لتقييم الاستجابة للتحفيز الميكانيكية الحاد باستخدام ميكروبيبيتي
    1. إعداد ميكروبيبيتي مليئة DB طبقاً لبروتوكول قياسي 23. إبقاء الضغط التعويض في هذه المبادرة 1,500.
      2. جمع
    2. وتمييع الخلايا النباتية كما هو موضح في الخطوة 2، 1. مكان 25 ميليلتر قطرات ~7.5 x 10 5 خلايا/مل في دائرة 1-حسنا، تسمح للالتزام لمدة 10 دقيقة على الأقل، وتغطي مع 3 مل DB.
    3. وضع الدائرة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا نفط X 40. تحديد موقع الخلايا. بلطف أقل في ميكروبيبيتي في منتصف مجال الرؤية حتى أنها تمس أولاً الجزء السفلي من الدائرة.
      ملاحظة: حيث تم تعيين الضغط التعويض في هذه المبادرة 1,500، الخلايا بشكل مستمر ستتعرض لتدفق DB بصورة بطيئة للغاية من ميكروبيبيتي-
    4. بدء الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء إضاءة فترات s 3. تطبيق ' النظيفة ' الدالة على إطلاق سراح بلعه السائل من ميكروبيبيتي. مواصلة التصوير أناn وجود تدفق بسبب ضغط تعويض وحدها.
  4. طريقة بديلة لتقييم الاستجابة للتحفيز الميكانيكية الحاد باستخدام إضافة العازلة السائبة
    1. جمع وتمييع الخلايا النباتية كما هو موضح في الخطوة 2، 1. ضع 20 ميليلتر قطرات من الخلايا في ~ 1 × 10 6 خلايا/مل في DB في وسط بئر من دائرة 8-جيدا. السماح للخلايا الانضمام لمالا يقل عن 10 دقيقة
    2. بدء الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء محددة الإضاءة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا X 40 فترات s 3. التركيز على منطقة قريبة من حافة الهبوط.
      3. سرعة إضافة
    3. ميليلتر 430 من DB إلى جانب واحد من البئر. مواصلة تصوير.
    4. لتحليل التفاعل بين المنبهات الميكانيكية والكيميائية، إضافة s 12 أو 45 بعد التحفيز الميكانيكي، بلطف 50 ميليلتر من حمض الفوليك (التركيز النهائي 20 نانومتر) أو مركبة (DB) دون تحريض استجابة ميكانيكية. مواصلة تصوير.
  5. القياس الكمي لاستجابة
    1. فتح صورة TIFF 32-بت في "صورة برامج التحليل" (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) 27.
    2. تحت ' تحليل ' التبويب، اذهب إلى " "تعيين قياسات" ". تحقق من المربع ' "قيمة الرمادي يعني" '. تأكد من أن لا يتم التحقق من المربعات الأخرى. انقر فوق " موافق ".
    3. تحت ' عملية '، انقر فوق " "طرح الخلفية" ". الاحتفاظ بنصف قطر الكرة المتداول في 50 بكسل، وعدم التحقق من أي من الخيارات المدرجة في القائمة. التكبير والتصغير استخدام خلية واحدة ' المكبرة ' أداة.
    4. استخدام ' المستطيل ' أداة، رسم مربع (~2.5 x 2.5 ميكرون 2) في سيتوسول، مع التأكد من عدم استدراجه عبر النواة أو غشاء البلازما. الصحافة " Ctrl " + " م " مفاتيح أو الذهاب إلى ' تحليل ' علامة التبويب وانقر فوق " التدبير " لتحديد قيمة المربع رمادي يعني. مقدما للإطارات اللاحقة وتدبير مرة أخرى، مع التأكد من المربع يبقى في سيتوسول-
      ملاحظة: نظراً للخلايا ديسكويديوم دال- التحرك سريعاً للغاية المربع يمكن نقلها من إطار واحد إلى التالي لإبقائه في سيتوسول.
    5. بعد كل من الإطارات قد تم تحليلها، نسخ القيم في جدول بيانات. لحساب التباين خلية إلى خلية في مستويات التعبير من مختلف أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، تطبيع القيم عن قيمة الرمادي يعني لاحظ في الوقت 0. حساب معكوس القيم التي تعكس تراكم الإشارة على القشرة.

5. المستمر التحفيز الميكانيكي ويعيش التصوير من الخلايا المفردة في المجهر

  1. إعداد الخلايا بالضبط كما هو موضح أعلاه لتحليل التحفيز الميكانيكي الحادة في خطوات 4.1.1-4.1.3. فتح التوصيل تغطي الخزان مع المخزن المؤقت حيث يمكن تصدرت وحدة التخزين إذا كان يتم تحليل الاستجابة لأكثر من بضع دقائق في كل مرة.
    ملاحظة: نظراً لأن الخزان لا يزال مفتوحاً طوال فترة التجربة، هذا الفحص تتم في غياب الضغوط الخارجية ويعتمد على تدفق الجاذبية وحدها. لزيادة معدل تدفق بالجاذبية، يمكن وضع استنزاف على طاولة تحت المجهر.
  2. بدء التصوير الخلايا مع طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء محددة الإضاءة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا X 40 على فترات s 3 لتحليل الردود بيوسينسور. بدلاً من ذلك، صورة مع تباين مرحلة استخدام هدفا X 20 على 10 فترات s للتحليل الشامل الخلية الهجرة-
  3. بدوره على التدفق بعد عدة إطارات في الإعداد صفر-الضغط (أي التدفق بسبب الجاذبية وحدها أو ~ 15 داين/سم 2) عن طريق تبديل الصمام لموقف فتح. عندما يقع مستوى السائل إلى 5-10 مل في الخزان، أعلى بأكثر من المخزن المؤقت. تأكد من إضافة السوائل بعناية حتى لا الحصول على المحاصرين فقاعات الهواء في الخطوط-
    ملاحظة: من المهم إضافة السائل من نفس درجة الحرارة لتفادي صدمة ردها في الخلايا-
  4. قياس سرعة الخلية واستمرار استخدام برمجيات تحليل الهجرة (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استجابة الزمانية للمنظمين إنزيمية للتحفيز الميكانيكي الحادة

لتقييم استجابة الخلايا ديسكويديوم د للتحفيز الميكانيكي، تتعرض خلايا تجميع المختصة ملتصقة لنبضه قصيرة من تدفق القص. تجميع المختصة د ديسكويديوم الخلايا تفرز المخيم، التي يمكن أن تكون لمست بالخلايا المجاورة. للتغلب على مساهمة مما يشير إلى خلية خلية، تعامل الخلايا مع الكافيين، الذي يحول دون adenylyl cyclase في ديسكويديوم دال ، وهكذا يمنع إفراز المخيم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأساليب الموصوفة هنا توفر طريقة مناسبة لتقدير كل من السكان وسلوك خلايا فردية في الاستجابة تدفق للقص. الأهم من ذلك، بينما تحليل الدراسات السابقة التعريب الرائدة ومتخلفة عن علامات الحافة أثناء الترحيل، يسمح النهج الحالي التحقيق في الآثار المباشرة بتطبيق تدفق القص حادة. باستخدام هذا الأسلوب أثبتنا أنه، في الواقع، الاستجابة الأولية للخلايا لإمالة تدفق لا تتطلب الهجرة الخلية. بدلاً من ذلك، يسبق الاستجابة السريعة وعابر لتحفيز تدفق القص الأولية هجرة اتجاهي ينظر مع التعرض المطول القص التدفق، وبالمثل للاستجابة العالمية الأولى ين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35 GM118177 للحزب الوطني الديمقراطي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كواشف < / قوي >
سكر العنبفيشرD16-1استخدم لتحضير وسائط HL-5 وألواح SM (الخطوات 1.1 ، 1.2)
ببتون البروتيوزفيشرDF0120-17-6استخدم لتحضير وسائط HL-5 (الخطوة 1.1)
مستخلص الخميرةفيشر50-550-445استخدم لتحضير وسائط HL-5 وألواح SM (الخطوات 1.1 ، 1.2)
Na2HPO4· 7H2< / sub>OFisherS373-500استخدم لإعداد وسائط HL-5 ، و 10X Phosphate Buffer (الخطوات 1.1 ، 1.3)
KH2< / sub>PO4< / sub>FisherP386-500استخدم لإعداد وسائط HL-5 وألواح SM و 10X Phosphate Buffer (الخطوات 1.1-1.3)
الستربتومايسين (كبريتات ثنائي هيدروستربتومايسين)فيشر ICN10040525استخدم لتحضير وسائط HL-5 (الخطوة 1.1)
الببتون (باكتو)فيشرDF0118-17-0استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2)
K2< / sub>HPO4< / sub>FisherP288-100استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2)
AgarFisherBP1423-500استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2)
MgSO4< / sub>FisherM65-500استخدم لتحضير DB Buffer (الخطوة 1.4)
CaCl2< / sub> FisherC79-500استخدم لتحضير DB Buffer (الخطوة 1.4)
الكافيينفيشرO1728-500استخدم لتحضير الكافيين (الخطوة 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 أقدام ، 5 أقدام أحادي الفوسفات الدوري ، ملح الصوديوم)فيشر11-680-1100 مجماستخدم لتحضير cAMP (الخطوة 1.6)
حمض الفوليكSigmaF7876استخدم لتحضير الفوليك حمض (الخطوة 1.7)
قاعدة تريسفيشرBP152-500استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8)
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)فيشرBP166-500استخدم لتحضير مخزن مؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8)
الجلسرينفيشرG33-500استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8)
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad1610610استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8)
بروموفينول الأزرقBio-Rad1610404استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8)
NaFFisherS299-100استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8)
Na3< / sub>VO4< / sub>Fisher50-994-911استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8)
بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدراتفيشرS390-500يستخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8)
كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA (Roche)11873580001 Sigmaيستخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8)
Latrunculin AEnzo Life SciencesBML-T119-0100استخدم لتحضير Latrunculin A (الخطوة 1.9)
4-15٪ Tris-HCl بولي أكريلاميد هلامBio-Rad3450029استخدام للنشاف المناعي (الخطوة 3.3)
غشاء فلوريد البولي فينيلدينBio-Rad1620177يستخدم في النشاف المناعي (الخطوة 3.3)
Phospho-PKC (مقلاة) (zeta Thr410) (190D10) إشارات خلايا الأجسام المضادة للأرانب2060الجسم المضاد الأساسي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3)
Phospho-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) (Thr202 / Tyr204) ( D13.14.4E) إشارات خلية الأجسام المضادة XP4370الجسم المضاد الأساسي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (من الحمار) GEHealthcareNA934-100ULالجسم المضاد الثانوي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3)
ركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة (ركيزة Clarity Western ECL)Bio-Rad1705060الاستخدام للنشاف المناعي (الخطوة 3.3)
المخزن المؤقت للتجريد (Restore Plus Western blot stripping buffer)PiercePI46430استخدم للنشاف المناعي (الخطوة 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278يستخدم للنشاف المناعي (الخطوة 3.3)
K. سلالة الجينات الهوائية (غير مسببة للأمراض)مركز Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name< / strong>Company< / strong><قوي>رقم الكتالوجتعليقات
Materials and Equipment
Orbital shaker (نموذج G-33 ، أو بديل مماثل)نيو برونزويك العلميلنمو K. aerogenes< / em> (الخطوة 2.1.1) ، وللقاعدية وتحفيز خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 3). نصف قطر الدوران لهذا شاكر 9.5 ملم.
طبق بتري 10 سمفيشرFB0875712استخدم لتحضير ألواح SM (الخطوة 1.2)
مقياس الدمFisher02-671-51Bاستخدم لحساب خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 2.1.2) طبق
35 مم (طبق ثقافة الأنسجة من Corning Falcon Easy-Grip)Fisher08-772Aاستخدم لطبق D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي متبوعا بتحلل الخلية (الخطوة 3.1.1)
كوب البوليسترين (5 مل)VWR13915-985يستخدم لتحفيز تعليق الخلية D. discoideum< / em> مع جاذب كيميائي (الخطوة 3.2.2)
وحدة السوائل مع مضخة (نظام مضخة ibidi)Ibidi10902يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5)
انزلاق بقناة (& mu ؛ -Slide III 3in1 ibiTreat: # 1.5 غطاء بوليمر ، معالجة ثقافة الأنسجة ، معقمة)المرجع80316استخدم للوحة D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم تسليمه بواسطة جهاز سائل (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5)
خزانات 50 مل (حامل خزان أبيدي لوحدة الموائع)نفس المرجعنفسه 10978استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5)
خطوط الوحدة السائلة (مجموعة التروية YELLOW-and-GREEN)المرجع10964استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 ، 4.2 و 5). ملاحظة: يمكن أيضا قطع الخطين من الأنبوب 1.6 مم (رقم الكتالوج 10842).
خط للتصريف (أنبوب معرف 1.6 مم)Ibidi10842استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5).
مجهر مقلوب Zeiss Observer.Z1 مزود بهدف زيت 40X / 1.3 وهدف جوي 20X / 0.3 (أو بديل مماثل)Zeissيستخدم لتصوير خلايا D. discoideum< / em> مع تباين الطور أو إضاءة مضان (الخطوتين 4 و 5)
مجهر ثنائي البؤر القرص الدوار UltraView المجهز ب 40 مرة;/1.25– 0.75 هدف الزيت (أو بديل مماثل)Perkin-ElmerDM 16000بديل يستخدم لتصوير خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 4.1.4) حاقن
FemtoJet Microinjector (Eppendorf ؛ موديل 5247 ، أو بديل مماثل) مع Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D و 5192000027يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3). ملاحظة: رقم الكتالوج مخصص لأحدث إصدار من الجهاز (4i).
ماصة دقيقة (Femtotip ؛ 1 & mu ؛ م القطر الخارجي ، 0.5 مو ؛ م القطر الداخلي)Eppendorf930000035يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3)
أطراف اللودر الدقيق (نصائح اللودر الدقيق Eppendorf Femtotips لحاقن Femtojet)Eppendorf5242956.003استخدم لملء الماصة الدقيقة (femtotip) بمخزن مؤقت (الخطوة 4.3.1) غرفة
1 بئر (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)فيشر12-565-472استخدم لألواح D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم توصيله بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3.2)
غرفة ذات 8 آبار (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)فيشر12-565-338استخدم للوحة D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم تسليمه عن طريق إضافة المخزن المؤقت السائب (الخطوة 4.4.1)
<قوي>الاسم< / قوي><قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Software
Image Analysis Software (فيجي)المعاهد الوطنية للصحةhttps://fiji.sc/استخدم لتحديد الاستجابة للتحفيز الميكانيكي (الخطوة 4.5)
برنامج تحليل الهجرة (أداة التتبع PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/يستخدم لتحديد سرعة الخلية وثباتها (الخطوة 5.4)
استخدام نفسه نفسه

المراجع

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تدفق القصنقل الإشارةالهيكل الخلوي للأكتينالمستشعرات الحيوية الفلوريةالهزاز المداريغرفة الموائع الدقيقةلطخة ويسترنهجرة الخلايا
تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.