Se describe un método para cuantificar la agregación de proteínas mal plegadas. Nuestros detalles del protocolo lentivirales inducida por generación de línea celular estable, proyección de imagen confocal automatizado y análisis de imágenes de agregados proteicos. Como una aplicación ilustrativa, se estudió el efecto de pequeñas moléculas en la promoción de la agregación de SOD1 en una forma dependiente de dosis y tiempo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal que puede ser causada por mutaciones heredadas en el gene codificación cobre-zinc superóxido dismutasa 1 (SOD1). La inestabilidad estructural del SOD1 y la detección de inclusiones de SOD1-positivo en pacientes de ALS familiar apoyan un posible papel causal de SOD1 mal plegadas o agregados en patología de ALS. En este estudio, describimos el desarrollo de un análisis celular diseñado para cuantificar la dinámica de agregación de SOD1 en células vivas por alto contenido métodos de detección. Uso de vectores lentivirales, generamos líneas estables de la célula expresando salvaje-tipo y del mutante SOD1 A4V etiquetadas con proteína fluorescente amarilla y encontró que ambas proteínas se expresaron en el citosol sin ningún signo de agregación. Curiosamente, sólo SOD1 A4V había expresado estable HEK-293, pero no en líneas celulares U2OS o SH-SY5Y, agregados al tratamiento del inhibidor de proteasoma. Nos muestran que es posible cuantificar la agregación basada en análisis de dosis respuesta de diferentes inhibidores de la proteasoma y seguimiento de la cinética de la formación de agregados por microscopia Time-lapse. Nuestro enfoque presenta la posibilidad de cuantificar el efecto de mutaciones de la ALS en el papel de SOD1 en la formación de agregados, así como la detección de pequeñas moléculas que impiden la agregación de SOD1 A4V.
Introducción
Agregación de proteínas es un proceso biológico por el cual mal grupo de proteínas para arriba y puede actuar como agentes causales de enfermedades neurodegenerativas (amiloidosis). Caracterización de la agregación de la proteína es esencial para entender el papel de los agregados en la disfunción celular, así como en facilitar el descubrimiento de nuevos factores que influyen en la aparición de la patología. La visualización de proteínas etiquetadas de fluorescencia en células vivas es un método eficaz que puede ayudar en el desarrollo de análisis aplicables al alto contenido de proyección (HCS)1,2,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. producción de lentivirus
Nota: la producción y manipulación de vectores lentivirales se llevó a cabo según las pautas de los institutos nacionales de salud (NIH) para investigación con recombinante DNA. La codificación de plásmido el tipo salvaje y mutante SOD1 de A4V etiquetados YFP mejorada (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP) se describen en Kim et al. 11 ambos productos de fusión genética fueron amplificados mediante el par de la cartilla PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ y 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ y se insertan en la CMV de U3 pTRIP-delta plásmido
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Línea de celular estable de generación mediante lentivirus: La estrategia general para el control de agregados de proteína SOD1 se ilustra en la figura 1. En un primer paso, hemos generado un vector de expresión lentivirales para la entrega de estable gene SOD1 en líneas celulares (paso 1). Dos vectores lentivirales codificación etiquetado YFP SOD1 WT y SOD1 A4V (SOD1WT-YFP y SOD1A4V-YFP, respectivamente) con embalaje y sobre plásmidos fueron.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hay dos enfoques principales para la generación de líneas celulares estables. La primera toma varias semanas y requiere transitoria selección de transfección y resistencia de los vectores de DNA de plásmido integrada genomic. El segundo lleva pocas horas mediante el uso de lentivirus, haciendo este protocolo favorable a la expresión efectiva de la proteína diana en múltiples líneas celulares con un esfuerzo limitado. El viaje-CMV vector19 era un vector constante a utilizar, con eficacia de transdu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca financiada por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) y el programa de apoyo nacional investigación Fundación de Corea (NRF) científico individual (NRF/NRF-2013M3A9B5076486-2015R1D1A1A09057239).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicina (C 28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Opereta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Software de imagen Harmony | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Software de análisis de imágenes | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell de manipulación de líquidos | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referencias
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
- Honarnejad, K., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
