Summary
نقدم تقنية للإدارة المترجمة من المخدرات من خلال الطريق عبر تيمبانيك إلى القوقعة. إيصال الأدوية من خلال هذا المسار لن يتعارض مع الفعالية المضادة للسرطان من عقاقير العلاج الكيميائي مثل سيسبلاتين.
Abstract
الإدارة النظامية من العوامل الواقية لعلاج المخدرات التي يسببها مؤقت يحد من إمكانية أن هذه العوامل الوقائية يمكن أن تتداخل مع كفاءة العلاج الكيميائي للأدوية الأساسية. وهذا ينطبق بشكل خاص سيسبلاتين المخدرات، هي تخفيف تصرفاتها السرطان بالمواد المضادة للأكسدة التي توفر حماية كافية ضد فقدان السمع. الوكلاء أوتوبروتيكتيفي الحاليين أو المحتملين الآخرين يمكن أن تشكل مشكلة مماثلة، إذا كانت تدار النظامية. تطبيق مختلف المستحضرات البيولوجية أو وكلاء واقية مباشرة إلى القوقعة سيسمح لمستويات عالية من هؤلاء الوكلاء محلياً مع محدودية الآثار الجانبية الجهازية. في هذا التقرير، ونظهر ترانس tympanic طريقة التسليم من مختلف المخدرات أو المواد البيولوجية الكاشفة للقوقعة، التي ينبغي تعزيز بحوث العلوم الأساسية في القوقعة وتوفر طريقة بسيطة لتوجيه استخدام وكلاء أوتوبروتيكتيفي في العيادات. هذا التقرير تفاصيل طريقة لإيصال المخدرات عبر tympanic ويقدم أمثلة عن كيفية هذه التقنية قد استخدمت بنجاح في الحيوانات التجريبية لعلاج مؤقت سيسبلاتين.
Introduction
النظام السمعي المحيطي حساس بشكل رائع على المخدرات مثل سيسبلاتين وامينوغليكوزيد المضادات الحيوية. سيسبلاتين عامل العلاج الكيميائي مستخدمة على نطاق واسع لمعالجة مجموعة متنوعة من الأورام الصلبة، مثل المبيض والخصيتين والرأس وسرطان العنق. مؤقت من ذوي الخبرة باستعمال هذه المخدرات هو الجرعة-الحد وشائع جداً، التي تؤثر على 75-100% مرضى العلاج1. أدوية أخرى، مثل كاربوبلاتين و oxaliplatin، قد برزت بوصفها بدائل سيسبلاتين2،3،،من45، ولكن فائدتها محدودة لبعض أنواع السرطان.
وقد أظهرت الدراسات المبكرة الدور الحاسم للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في التوسط مؤقت تنتجها سيسبلاتين والامينوجليكوزيدات. وأظهرت الدراسات اللاحقة أن isoform NOX3 من أوكسيديز نادف هو المصدر الرئيسي لروس في القوقعة، وتنشيط بواسطة سيسبلاتين6،7. توليد حلول توفيقية روس مضادات الأكسدة التخزين المؤقت قدرة الخلايا، مما يؤدي إلى زيادة وبيروكسيد الأغشية الخلوية8. وعلاوة على ذلك، سيسبلاتين يزيد من إنتاج الهيدروكسيل التي تولد ألدهيد شديدة السمية 4-هيدروكسينونينال (4-هني)، بادئ الخلية وفاة9،10. وبناء على هذه النتائج، قد درست عدة مضادات الأكسدة لعلاج مؤقت سيسبلاتين. وتشمل هذه ن-أسيتيل سيستين (NAC)، ثيوكبريتات الصوديوم (STS)، أميفوستيني، ودال--الميثيونين. ومع ذلك، مصدر قلق كبير للعلاج بمضادات الأكسدة أن هذه المواد المضادة للأكسدة يمكن أن تقلل من فعالية العلاج الكيميائي سيسبلاتين عندما تدار النظامية11 من خلال تفاعل سيسبلاتين مع جماعات ثيول في الجزيئات المضادة للأكسدة.
نظراً لهذه المشاكل بالعلاج بمضادات الأكسدة، والهدف من هذه الدراسة دراسة الطريق عبر تيمبانيك من إيصال المواد المضادة للأكسدة وغيرها من المخدرات إلى القوقعة للحد من فقدان السمع. الطريق عبر تيمبانيك المخدرات والتدخل القصير (سي) الجيش الملكي النيبالي، المبينة أدناه، يظهر واعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويستار ذكور الفئران تم التعامل معها وفقا "المعاهد الوطنية للصحة" الحيوانية استخدام المبادئ التوجيهية وبروتوكول وافق جنوب إلينوي جامعة مدرسة الطب مختبر الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة. استجابة جذع الدماغ السمعية (ABR) أجرى على الفئران بينما تحت التخدير قبل الدواء و 72 ح بعد للتحقق من أثر تسليم المخدرات عبر تيمبانيك.
1-السمع الدماغ استجابة (ABR)
ملاحظة: وجمعت ABR القياسات باستخدام معدات اختبار السمع والبرمجيات. ABR يمثل إمكانات مقولة أو موجات التردد العالي التي تم إنشاؤها بواسطة الأعصاب القحفية الثامنة (الموجه الأولى والثانية) وغيرها من الهياكل جذع الدماغ السمعية أعلى بما في ذلك نواة cochlear أنتيروفينترال (الموجه الثالثة)، ليمنيسكوس الأفقي (الموجه الرابع)، وأدنى والاكيميه (الموجه ت). هذه الموجات تختلف تبعاً لزمن الوصول. وأجريت قياسات ABR كما هو موضح سابقا12.
- تخدير الفئران بمزيج من 90 ملغ/كغ الكيتامين و 17 مغ/كغ xylazine عبر داخل الحقن. تأكيد عمق التخدير عن طريق رشة تو العاكسة. تطبيق تزييت العيون (أو قطرات الزيت المعدني) لكلتا العينين لمنع العيون من التجفيف وتجنب تقرح أثناء التخدير.
- وضع الفئران في موقف المعرضة على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) داخل كشك الصوتية التي تسيطر عليها. معدات اختبار السمع يقع خارج وبجوار كشك.
- إدراج الأقطاب الفولاذ المقاوم للصدأ وبناء على ذلك: القطب الأرضي في المؤخرة الجناح، القطب إيجابية بين هذين الأذنين مباشرة فوق الجمجمة، واقطاب سلبية فيما يلي بينا لكل إذن.
- تطبيق المؤثرات الصوتية باستخدام "محولات" التردد العالي كانفجار لهجة 5 مللي ثانية في 8 و 16 و 32 كيلو هرتز. تحديد كثافة التحفيز كمستوى ضغط الصوت ديسيبل (ديسيبل SPL). وهذا يبدأ في 10 ديسيبل SPL ويصل إلى 90 ديسيبل SPL مع حجم خطوة 10-dB. معايرة كثافة الصوت إلى طاقة إنتاجية قصوى قدرها 90-ديسيبل SPL استخدام دقة دفعة سليمة مقياس مستوى.
ملاحظة: نتيجة الاختبار يعطي مؤشرا لسلامة جهاز السمع المحيطية والقوقعة وهياكل سمعي السالفة الذكر. يتم إنشاؤها في الطول الموجي داخل 15 مللي ثانية لإدخال حافز والكمون موجات يعتمد على وقت التوصيل، والذي يخضع بدوره إلى ثلاثة عوامل حاسمة: حجم الدماغ والكثافة وتواتر الصوت. وسجلت السمعية إمكانات مقولة استخدام البرمجيات التي توفرها الشركة المصنعة. - النظر في حدة الأدنى التي يمكن أن تثير اثنين مختلفة من الطول الموجي (ثانيا وثالثاً) من 0.5 µV السعة كعتبة مكانة بارزة.
ملاحظة: عتبة التحول يمثل الفرق في عتبة تقاس بعد العلاج مقارنة مع العتبة التي تم الحصول عليها قبل العلاج.
2-ترانس-تيمبانيك حقن
- لإدارة المخدرات ترانس تيمبانيكالي، وضع الفئران في وضع استلقاء الجانبي الأيسر.
- إدراج مناظير الإذن المتاح 2.5 ملم في قناة الإذن.
- باستخدام نطاق العمليات الجراحية، ضع مناظير حيث يكون غشاء الطبل مرئياً.
- استخدام 29 X ½، 0.5 مل حقنه الأنسولين، وضع 50 ميليلتر من الادينوسين الأيزوبروبيل فينيل [ص]-N-(R-PIA) الحل (1 ميكرومتر)، 8-سيكلوبينتيل-1، 3-ديبروبيلكسانثيني (دبكبكس) الحل (3 ميكرومتر)، أو حل siRNA (0.9 ميكروغرام) لحقن (5 وحدات).
- استخدام مناظير توجيه الإبرة في المنطقة السفلي الأمامي من غشاء الطبل.
- كزة ثقب الغشاء مع الإبرة وإدارة الأدوية المذكورة في 1.2.3. السماح للفئران للراحة في هذا المنصب لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يكون 50 ميليلتر حجم كاف لاحتواء خلف غشاء الطبل. ينبغي أن تكون لا الموائع في قناة الإذن بعد الإدارة. - وضع الفئران في حق استلقاء الأفقي الموقف وكرر الخطوات من الإصدار 1.2.1 من خلال 1.2.5 للإدارة في الإذن الأخرى.
- للفئران يتلقون سيسبلاتين إينترابيريتونيلي، وضع الفئران في موقف ضعيف على وسادة تدفئة في 37 درجة مئوية.
- استخدام 21 X 3/4 الفراشة إبرة (طول الأنابيب 12 ")، بوضع سيسبلاتين (11 ملغم/كغم، والحل 1 ملغ/مل في الفوسفات العقيمة المخزن المؤقت المالحة [برنامج تلفزيوني]).
- باستخدام مضخة الحقن، إدارة سيسبلاتين (1 ملغ/مل) عن طريق الحقن داخل أكثر من 30 دقيقة.
ملاحظة: للفئران 250-ز، سيكون الحجم 2.75 مل بمعدل حوالي 0.1 مل في الدقيقة.
- مواصلة رصد عمق التخدير في جميع أنحاء هذه الإجراءات. بمجرد اكتمال الإدارة سيسبلاتين، مكان الفئران مرة أخرى في القفص في موقف المعرضة، التأكد من أنه لا يوجد شيء لإعاقة في التنفس.
- مراقبة الفئران حتى شُفي تماما.
3-تشريح القوقعة وديكالسيفيكيشن
- بعد العبر النهائية (بعد 72 ساعة)، تخدير الفئران بمزيج من 90 ملغ/كغ الكيتامين و 17 مغ/كغ xylazine عبر داخل الحقنة. تأكيد التخدير مع منعكس قرصه أخمص القدمين. Euthanize الفئران عن طريق قطع الرأس.
- تشريح من العظم الصدغي كما هو موضح سابقا13.
- ضع القوقعة في بارافورمالدهيد 4% في 1 × الحل برنامج تلفزيوني في قنينة زجاج 7 مل التﻷلؤ (تغطي تماما القوقعة). الثلاجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إزالة بارافورمالدهيد وتغسل مع برنامج تلفزيوني x 1 في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة برنامج تلفزيوني وملء الأنبوب تماما مع حل 120 ملم يدتا (7.3 درجة الحموضة). مكان على المدورة في درجة حرارة الغرفة والسماح ديكالسيفيكيشن لمدة 2 إلى 3 أسابيع، تغيير الحل يدتا يوميا.
4-كريوسيكتيونينج
- عند انتهاء ديكالسيفيكيشن، تزج تماما القوقعة في الحلول التالية (7 مل في كل) ح 24 4 ° c: السكروز 10%، السكروز 20%، 1:1 خليط من السكروز 20%، وقطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) تضمين المركب.
- ضع أكتوبر الطازجة مجمع لملء وتغطي كامل القوقعة في 15 مم × 15 مم × 5 مم المتاح التضمين العفن. توجيه القوقعة على جانبه بحيث يكون موازيا للجزء السفلي من القالب التضمين، كما وصفها ويتلون وآخرون. 14
- فورا وضع القالب على الثلج الجاف لترسيخ OCT وتخزينها في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تزج شرائح المجهر في 0.01 ٪ بولي-L يسين في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة إزالة الشرائح، لا شطف، وتسمح الجافة بين عشية وضحاها. استخدام هذه الشرائح كريوسيكشنز.
- إزالة القوقعة في أكتوبر من الثلاجة-80 درجة مئوية ووضعه على الثلج الجاف. استخدام شفرة حادة مبضع (L x w: 80 مم × 8 مم، سمك 0.25 مم، قطع زاوية 34 °)، الفرع كتل OCT الساعة 10 ميكرون استخدام كريوستات عند-30 درجة مئوية. ضع قسمين كل شريحة.
- بردت الشرائح في 4 درجات مئوية عند الانتهاء.
5-إيمونوهيستوتشيميستري
- وضع الشرائح في شريحة الميكروسكوب زجاجية تلطيخ طبق على رف شريحة. ملء الطبق مع 350 مل من 1 x PBS وتغسل ثلاث مرات الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الشرائح من الطبق والجاف قبالة المنطقة المحيطة بالانسجة باستخدام مسح جافة، يجري التأكد من عدم الجاف قبالة الأنسجة.
- استخدام قلم حظر سائل، رسم دائرة حول المقطع الأنسجة.
- كتلة الأنسجة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بإضافة 150 ميليلتر من عرقلة الحل التي تحتوي على المصل العادي 10% (حمار) والمنظفات النطاق 1% 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني 1 x.
- انقر فوق إيقاف حل حظر الزائدة واحتضان الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة هوميديفيد مع 150 ميليلتر من المصل العادي 10% (حمار) والمنظفات النطاق 0.1% وجسم الأولية (انظر الملاحظة أدناه) في برنامج تلفزيوني 1 x.
ملاحظة: واستخدمت للأجسام المضادة التالية، تخفيف هذه: الرقم 2 و 3، STAT1 ف Ser727 رافعة. الرقم 4و STAT1 ف Ser727، 1: 100 و TRPV1 1: 100. - وضع الشرائح في الشريحة المجهر الزجاج تلطيخ طبق على رف شريحة. ملء الطبق مع 350 مل من 1 x PBS وتغسل ثلاث مرات الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في محلول يحتوي على المنظفات النطاق 0.01 ٪ والمصل العادي 10% (حمار) في س 1 برنامج تلفزيوني عن ح 2 إلى 3 في درجة حرارة الغرفة في دائرة هوميديفيد في الظلام.
ملاحظة: واستخدمت للأجسام المضادة الثانوية التالية، تخفيف هذه: الرقم 2 و 3، مقاومة الحمار أرنب المضادة "مفتش". ل الرقم 4، والرودامين (تريتك) حمار أرنب المضادة مفتش 1: 500 والماعز حمار المضادة مفتش 1: 500. - وضع الشرائح في الشريحة المجهر الزجاج تلطيخ طبق على رف شريحة. ملء الطبق مع 350 مل من 1 x PBS وتغسل ثلاث مرات الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- اضغط السائل الفائض خارج الشريحة، والجاف للشريحة مع مسح جافة حول الأنسجة. تحميل الشرائح بإضافة قطره واحدة من عامل تصاعد مع DAPI مباشرة على الأنسجة. ببطء مكان ساترة على القمة، وضمان أن يتم تشكيل لا فقاعات تحتها، والسماح للشرائح لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية.
- صورة الشرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. استخدام أشعة الليزر للتصوير على النحو التالي: ليزر الأشعة فوق البنفسجية DAPI و 488 نانومتر الليزر للحمار أرنب المضادة "مفتش" 543 نانومتر الليزر والرودامين تريتك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قياس الاستجابات ABR في الفئران في الأيام الثلاثة التالية سيسبلاتين الإدارة أظهرت ارتفاع كبير في العتبات. تم رفع هذه العتبات إلى حد كبير في الفئران التي تديرها مع ترانس-تيمبانيك [ص]-N-فينيليسوبروبيلادينوسيني (R-بيا)، الادينوسين1 مستقبلات مؤثر15، قبل سيسبلاتين. خصوصية عمل R-بيا في الادينوسين وتجلى مستقبلات1 ملاحظة مفادها أنه كان عداء من 8-سيكلوبينتيل-1، 3-ديبروبيلكسانثيني (دبكبكس)، خصم مستقبلات محددة1 A16. بوتينتياتيد هذه المخدرات التي يسببها سيسبلاتين ABR عتبة تحولات (الشكل 1أ). مماثلة على أثره إنتاج فقدان السمع، سيسبلاتين كما زادت الخسارة/الضرر لخلايا الشعر الخارجي (تقييم عن طريق فحص المجهر الإلكتروني [SEM]) (الشكل 1ب). وتم الحصول على الصور ووزارة شؤون المرأة كما هو موضح سابقا17. هذا التأثير انخفضت انخفاضا كبيرا بالإدارة عبر تيمبانيك البحث والتطوير-بيا (الشكل 1ج). وعلاوة على ذلك، نعرض ترانس-تيمبانيك أن R-يقلل بيا إيمونوريكتيفيتي STAT1 ف القاعدية والتي يسببها سيسبلاتين في القوقعة، مما يعكس الخاصية المضادة للالتهابات لهذا الدواء (الشكل 2).
يمكن أيضا استخدام الطريق عبر تيمبانيك لإدارة البيولوجيات مثل سيرناس، مما يؤدي إلى آثار مفيدة. ترانس-تيمبانيك إدارة siRNA STAT1 الفئران فعالية خفض مستويات STAT1 و STAT1 ف وسدت تفعيل هذا العامل النسخ سيسبلاتين (الشكل 3).
دراسات إضافية تبين أن إدارة ترانس tympanic siRNA آخر مرناً NOX3 قلل من القدرة المخدرات مثل كبخاخات لزيادة بعض الوسطاء المتلقين للمعلومات، مثل فانيلويد المحتملة مستقبلات عابر 1 قناة (TRPV1) و p-STAT1 ( 4 الشكل). هذه الوسطاء متورطة في فقدان السمع الناجم عن كبخاخات18.
الشكل 1: إدارة ترانس تيمبانيك R-بيا خفض فقدان السمع الناجم عن سيسبلاتين والحماية ضد فقدان خلايا الشعر الخارجي. ألف عتبات ABR قيست في الفئران قبل و 72 ساعة بعد معاملتها مع سيسبلاتين (11 مغ/كغ، والقائمة) عقب ترانس-تيمبانيك إدارة البحث والتطوير-بيا أو دبكبكس + R-بيا. سيسبلاتين التي يسببها ارتفاع العتبة ABR تبين أن يخفف من مؤثر1ع A, R-بيا. الإدارة المشتركة لخصم1ع أ، دبكبكس، عكس تأثير R-PIA على عتبة ABR وكبيرة مرتفعة تحولات العبر التي تنتجها سيسبلاتين في جميع الترددات اختبارها. يشير السهم إلى الصفر ABR عتبة التحول. باء- معاملة سيسبلاتين أظهرت ضررا كبيرا لخلايا الشعر الخارجي (والنشرمحفوظه) (السهم الأبيض) كما يتضح من فحص المجهر الإلكتروني (SEM). R-بيا محمية أوهكس ضد الأضرار التي يسببها سيسبلاتين، بينما دبكبكس يخفف تأثير وقائي البحث والتطوير-بيا. جيم الرسم البياني شريط يظهر التحليل الكمي للصور SEM سيظهر في ب. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط. العلامات النجمية (*) و (*) تشير إلى اختلاف مهم إحصائيا من مجموعات علاجية مركبة أو سيسبلاتين، على التوالي، بينما (*) تشير إلى اختلاف مهم إحصائيا من R-بيا + الفئران المعالجة سيسبلاتين (p < 0.05، n = 5). وهذا الرقم تم تكييفها من كاور et al. 19 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إدارة ترانس-تيمبانيك1ع مؤثر، R-بيا، خفضت إيمونوريكتيفيتي STAT1 ف سيسبلاتين--زيادة في القوقعة. كانت تدار من الفئران جرعة سيسبلاتين (11 مغ/كغ)، التي زادت STAT1 ف Ser727 إيمونوريكتيفيتي، المقررة في ح 72 وظيفة إدارة المخدرات داخل. ومع ذلك، ح 1 المعالجة المسبقة مع ترانس tympanic R-PIA فالوﻻيات هذه الزيادة في إيمونوريكتيفيتي STAT1 ف. عكس العلاج المشارك من خصم1ع أ، دبكبكس، جنبا إلى جنب مع مؤثر تثبيط إيمونوريكتيفيتي STAT1 ف. تلطيخ الأزرق يمثل نواة DAPI الملون، بينما تلطيخ الأخضر يمثل إيمونولابيلينج STAT1 ف. والنشرمحفوظه والعاصمة تمثل خلية الشعر الخارجي والخلية دايتر، على التوالي. وتشير الأسهم البيضاء إلى ثلاثة صفوف من أوهكس. حجم شريط سيظهر في اللوحة اليسرى السفلي من 10 ميكرون. وهذا الرقم تم تكييفها من كاور et al. 19 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الإدارة STAT1 ترانس tympanic siRNA مستويات الناجمة عن "حظر سيسبلاتين" ف-STAT1. وأظهرت cochlear أقسام معزولة من الفئران التي تديرها مع سيسبلاتين (11 مغ/كغ، والقائمة) ح 72727 Ser زيادة ف-STAT1 إيمونوريكتيفيتي في أوهكس. ما قبل المعالجة مع ترانس tympanic STAT1 siRNA (0.9 ملغ) يخفف سيسبلاتين التي يسببها زيادة ف-STAT1 إيمونوريكتيفيتي، بينما سارعت العلاج أظهر أي تأثير. تلطيخ الأزرق يمثل نواة DAPI الملون، بينما تلطيخ الأخضر يمثل إيمونولابيلينج STAT1 ف. وتشير الأسهم البيضاء إلى ثلاثة صفوف من أوهكس. شريط مقياس سيظهر في اللوحة اليسرى السفلي التدابير 10 ميكرون. وهذا الرقم تم تكييفها من كاور et al. 20 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : حقن NOX3 ترانس tympanic siRNA TRPV1 يقلل ومستويات STAT1 ف في "القوقعة الفئران". تم تخديره من الفئران siRNA سارعت تدار (التدافع) أو كانت ملطخة سيرناس NOX3 بالحقن ترانس تيمبانيك، الذي أعقب يومين بعد الحقن ترانس-تيمبانيك من كبخاخات كوكليا معزولة 24 h. من هذه الحيوانات ل STAT1 ف سر727 وإيمونوريكتيفيتي TRPV1. كبخاخات زادت TRPV1 (الأخضر) وسر STAT1 ف727 (أحمر) إيمونوريكتيفيتي في 24 ساعة في فاسكولاريس ستريا (SVA) وخلايا الشعر الخارجي (والنشرمحفوظه) ودوامه خلايا العقدة (سان جرمان). ومع ذلك، لم تظهر الحيوانات pretreated مع NOX3 siRNA أي تحريض مرئية STAT1 ف Ser727 و TRPV1 إيمونولابيلينج. مقياس القضبان (اللوحة اليسرى السفلي) تمثل 50 و 10 ميكرون ل insets. وهذا الرقم تم تكييفها من موخيرجيا et al. 18 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مسار الإدارة عبر tympanic يسمح لإيصال مترجمة من المخدرات وغيرها من العوامل إلى القوقعة التي يمكن أن تنتج خلاف كبير من الآثار الجانبية الجهازية إذا تدار النظامية. يسمح هذا الأسلوب لإدارة المخدرات الوصول السريع للمخدرات إلى موقع العمل في جرعات أعلى بكثير مما سوف تتحقق من خلال التوجيه المنهجي. وأظهرت النتائج المعروضة هنا، ونشرت سابقا أن الإدارة عبر تيمبانيك من [ص]-ن-فينيل الأيزوبروبيل الادينوسين (R-PIA) محمية القوقعة من خلية الشعر الخارجي سيسبلاتين التي يسببها فقدان (الشكل 1)19 والتعريفي لالتهاب كما يتبين من تناقص التنشيط STAT1 عامل النسخ (مقارنة بتلك التي تعامل مع سيسبلاتين أو R-بيا + دبكبكس + سيسبلاتين) (الشكل 2)19. هذه الفوائد يمكن أن يسهم في الحماية من فقدان السمع التي تتيحها هذه المخدرات. استناداً إلى التجربة السابقة، فإننا نؤكد يلزم إدارة المخدرات واحد فقط. قد يشير هذا إلى أن المخدرات يتم الاحتفاظ في الإذن الوسطى، ويمكن ببطء مراعاة القوقعة توفر حماية على مدى الثلاثة أيام يتم تقييم هذه الحيوانات لمؤقت. هذا الأسلوب يستخدم حاليا توصيل العقاقير الأخرى إلى الإذن الداخلية لتحديد فعاليتها أوتو-الريفيين.
بالإضافة إلى المخدرات، يمكن أن توفر الإدارة عبر تيمبانيك من سيرناس الفعال ضربة قاضية للكشف الانتقائي تخفيض مستويات البروتين، وتوفير الحماية من أوتو،من1820. مرة أخرى، سوف توفر هذه سيرناس السمية أقل إذا التي يتم تسليمها بالقرب من القوقعة. وكانت مدة ضربة قاضية مدة تصل إلى ثلاثة أيام (الحد الأقصى لفترة التقييم). الأهم من ذلك، إضافة سيرناس كتل التعريفي البروتين المقابل بالمخدرات السامة، مثل سيسبلاتين. مدة ضربة قاضية المدهش إلى حد ما نظراً لوفرة نوكليسيس في السوائل خارج الخلية، والخلايا والصعوبة المحتملة في الحصول على هذه الجزيئات داخل الخلايا cochlear. بيد مظاهرة من كل ضربة قاضية للبروتينات وحماية أوتو يعني ضمناً أن هذه سيرناس تصل إلى القوقعة بتركيزات فعالة.
وعلى الرغم من الفوائد المذكورة أعلاه، يتوقع بعض القيود لهذا الأسلوب. وتشمل هذه الحاجة إلى أنيسثيتيزينج الحيوانات التجريبية قبل بدء هذا الإجراء. المخدرات يجب أن تدار في تركيزات أعلى في الإذن الوسطى حيث من المتوقع إلا نسبة ضئيلة (~ 1-10%) تصل perilymph. وبالإضافة إلى ذلك، توزيع العقاقير التطبيقية أو المستحضرات البيولوجية أكثر تركيزاً على قاعدة حيث لوحظت آثار أكبر.
بينما تقتصر على الفئران إيصالها عبر tympanic العوامل المعروضة هنا، يمكن استخدام طريقة مشابهة لإيصال الأدوية اتقائيا في المرضى الذين يتوقعون العلاج الكيميائي بالعقاقير مثل سيسبلاتين. ومن المتوقع أن يعتمد هذا الأسلوب لإيصال الأدوية سريعاً للبشر لفحص عدد كبير من المركبات التي أظهرت فعاليتها في علاج فقدان السمع الناجم عن المخدرات في الحيوانات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن عدم تضارب المصالح.
Acknowledgments
العمل الموصوف في هذه المقالة أيده NCI RO1 CA166907، نيدكد RO1-DC 002396 و RO3 DC011621.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketathesia (100 mg/ml) 10 ml | Henry Schein | 56344 | Controlled substance |
| AnaSed Injection/Xylazine (20 mg/ml) 20 ml | Henry Schein | 33197 | |
| 2.5 mm disposable ear specula | Welch Allyn | 52432 | |
| Surgical Scope | Zeiss | ||
| 29 G X 1/2 insulin syringe | Fisher Scientific | 14-841-32 | Can be purchased through other vendors |
| cis-Diammineplatinum(II) dichloride | Sigma Aldrich | P4394 | TOXIC - wear proper PPE |
| Harvard 50-7103 Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | Series 863 | |
| Excel International 21 G X 3/4 butterfly needle | Fisher | 14-840-34 | Can be purchased through other vendors |
| BSP Single Speed Syringe Pump | Brain Tree Sci, Inc | BSP-99 | |
| Pulse Sound Measurement System | Bruel & Kjaer | Pulse 13 software | |
| High-Frequency Module | Bruel & Kjaer | 3560C | |
| 1/8″ Pressure-field Microphone —-Type 4138 | Bruel & Kjaer | bp2030 | |
| High Frequency Transducer | Intelligent Hearing System | M014600 | |
| Opti-Amp Power Transmitter | Intelligent Hearing System | M013010P | |
| SmartEP ABR System | Intelligent Hearing System | M011110 | |
| Disposable Subdermal EEG Electrodes | CareFusion | 019-409700 | |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | Fisher Scientific | 28908 | TOXIC - wear proper PPE |
| 7 mL Borosilicate Glass Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-26 | Can be purchased through other vendors |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | Can be purchased through other vendors |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Can be purchased through other vendors |
| Tissue Plus OCT Compound | Fisher Scientific | 4585 | |
| CryoMolds (15 mm x 15 mm x 5mm) | Fisher Scientific | 22-363-553 | Can be purchased through other vendors |
| Microscope Slides (25mm x 75mm) | MidSci | 1354W | Can be purchased through other vendors |
| Coverslips (22 x 22 x 1) | Fisher Scientific | 12-542-B | Can be purchased through other vendors |
| Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | EMD Millipore | A-005-C | Can be purchased through other vendors |
| HM525 NX Cryostat | Thermo Fischer Scientific | 956640 | |
| MX35 Premier Disposable Low-Profile Microtome Blades | Thermo Fischer Scientific | 3052835 | |
| Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | Can be purchased through other vendors |
| TritonX-100 | Acros | 21568 | Can be purchased through other vendors |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Can be purchased through other vendors |
| Phospho-Stat1 (Ser727) antibody | Cell Signaling | 9177 | |
| VR1 Antibody (C-15) | Santa Cruz | sc-12503 | |
| DyLight 488 Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-485-152 | Discontinued |
| DyLight 488 Donkey anti Goat | Jackson Immuno Research | 705-485-003 | Discontinued |
| Rhodamine (TRTIC) Donkey anti Rabbit | Jackson Immuno Research | 711-025-152 | Discontinued |
| ProLong® Diamond Antifade Mountant w/ DAPI | Thermo Fisher | P36971 | |
| (−)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine | Sigma Aldrich | P4532 | |
| 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine | Sigma Aldrich | C101 | |
| siRNA pSTAT1 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| siRNA NOX3 | Qiagen | Custome Made | Kaur et al. 201120 |
| Scrambled Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Kaur et al. 201120 |
References
- McKeage, M. J. Comparative adverse effect profiles of platinum drugs. Drug Saf. 13 (4), 228-244 (1995).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. Oncol Rep. 10 (6), 1663-1682 (2003).
- Fouladi, M., et al. Phase II study of oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors: a pediatric brain tumor consortium study. Cancer. 107 (9), 2291-2297 (2006).
- Pasetto, L. M., D'Andrea, M. R., Rossi, E., Monfardini, S. Oxaliplatin-related neurotoxicity: how and why. Crit Rev Oncol Hematol. 59 (2), 159-168 (2006).
- Ardizzoni, A., et al. Cisplatin- versus carboplatin-based chemotherapy in first-line treatment of advanced non-small-cell lung cancer: an individual patient data meta-analysis. J Natl Cancer Inst. 99 (11), 847-857 (2007).
- Banfi, B., Malgrange, B., Knisz, J., Steger, K., Dubois-Dauphin, M., Krause, K. H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem. 279 (44), 46065-46072 (2004).
- Mukherjea, D., Whitworth, C. A., Nandish, S., Dunaway, G. A., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Expression of the kidney injury molecule 1 in the rat cochlea and induction by cisplatin. Neuroscience. 139 (2), 733-740 (2006).
- Rybak, L. P., Husain, K., Morris, C., Whitworth, C., Somani, S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol. 21 (4), 513-520 (2000).
- Lee, J. E., et al. Role of reactive radicals in degeneration of the auditory system of mice following cisplatin treatment. Acta Otolaryngol. 124 (10), 1131-1135 (2004).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Lawenda, B. D., Kelly, K. M., Ladas, E. J., Sagar, S. M., Vickers, A., Blumberg, J. B. Should supplemental antioxidant administration be avoided during chemotherapy and radiation therapy. J Natl Cancer Inst. 100 (11), 773-783 (2008).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse auditory brainstem response testing. Bio Protoc. 6 (6), 1768 (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (107), e53561 (2016).
- Whitlon, D. S., Szakaly, R., Greiner, M. A. Cryoembedding and sectioning of cochleas for immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Brain Res Protoc. 6 (3), 159-166 (2001).
- Londos, C., Cooper, D. M., Wolff, J.
- Lohse, M. J., Klotz, K. N., Lindenborn-Fotinos, J., Reddington, M., Schwabe, U., Olsson, R. A. 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX)--a selective high affinity antagonist radioligand for A1 adenosine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 336 (2), 204-210 (1987).
- Rybak, L. P., Whitworth, C., Scott, V., Weberg, A. D., Bhardwaj, B. Rat as a potential model for hearing loss in biotinidase deficiency. Ann Otol Rhinol Laryngol. 100 (4), Pt 1 294-300 (1991).
- Mukherjea, D., et al. NOX3 NADPH oxidase couples transient receptor potential vanilloid 1 to signal transducer and activator of transcription 1-mediated inflammation and hearing loss. Antioxid Redox Signal. 14 (6), 999-1010 (2011).
- Kaur, T., et al. Adenosine A1 receptor protects against cisplatin ototoxicity by suppressing the NOX3/STAT1 inflammatory pathway in the cochlea. J Neurosci. 36 (14), 3962-3977 (2016).
- Kaur, T., Mukherjea, D., Sheehan, K., Jajoo, S., Rybak, L. P., Ramkumar, V. Short interfering RNA against STAT1 attenuates cisplatin-induced ototoxicity in the rat by suppressing inflammation. Cell Death Dis. 2 (180), (2011).
