Summary
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.
Abstract
מטרות מרובות, זמן קצר, ומתודולוגיות משאבים-סבירים עבור הגילוי של מספר חומצות גרעין יחיד, קלה לתפעול הבדיקה נדרשים בדחיפות אבחון מחלת, ניטור מיקרוביאלי, זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO), ו בדיקת מז פ. בעבר תארנו פלטפורמת שנקרא שלווה (Capillary Aמבוססי rray Lבתיווך oop איזותרמי הגברה לצורך זיהוי חזותי של ultiplex מ'של חומצות גרעין). במסמך זה, אנו מתארים משופרת ייצור ותהליכים ביצועים עבור הפלטפורמה. כאן, אנו מיישמים קלטת קטנה, מוכן לשימוש נאספו על ידי מערך נימי לזיהוי חזותי מולטיפלקס של חומצות גרעין. המערך נימי הוא התייחס מראש לתוך תבנית הידרופוביות, הידרופילית לפני תיקון בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה) פריימר קבוצות נימים. לאחר הרכבה של מתאם טעינה, תערובת התגובה המנורה טעון, מבודד לתוך כל נים, עקב כוח נימי מאת pipetting צעד אחד. התגובות המנורה מתבצעים במקביל הנימים. התוצאות נקראים חזותית על ידי תאורה עם פנס UV ידניים. באמצעות פלטפורמה זו, נדגים ניטור של 8 לעתים קרובות להופיע ורכיבים של גנים בדגימות GMO ירידה לפרטים גבוהה ורגישות. לסיכום, פלטפורמת המתוארים במסמך זה נועד להקל על הזיהוי של מספר חומצות גרעין. אנו מאמינים שיהיה החלים נרחב בתחומים בהם דרושה ניתוח חומצת גרעין תפוקה גבוהה.
Introduction
מערכות בעלות נמוכה, מהירה, קלה לשימוש עבור גילוי בו זמנית של מספר חומצות גרעין נחוצים בדחיפות במגוון רחב של תחומים, כגון אבחון קליני1,2,3, זיהוי GMO4, 5,6, חיידקים ניטור7,8,9, בדיקת מז פ10,11, במיוחד בשלב של טיפול בדיקות (POCTs), שבו משאבים הם בדרך כלל מוגבלת12,13,14.
תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), כולל שיטות נגזרות שלו בזמן אמת PCR ו- PCR מולטיפלקס, היא הטכניקה שימושית נרחב ביותר לגילוי בתחומים אלה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל לזהות רק מטרה אחת מבחן אחד15 והן דורשות חשמל וציוד מקצועי ומתוחכם.
טכנולוגיה מבטיחה אחרת לגילוי חומצות גרעין הוא בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), אשר תוארה לראשונה בשנת 200016. המנורה היא יעילות גבוהה שיטת זיהוי ה-DNA. באופן תיאורטי, זה להגביר את מעותק 1 ל 109 עותקים של amplicons בתוך שעה אחת, כל תרגיל בטמפרטורה קבועה, (דהיינו, בין 60-65 מעלות צלזיוס). הגברה מוצלח לייצר כמות גדולה של רב-תכליתי לוואי לא מסיסים, לגרום לשינוי במצב עכירות17, אשר יכול להיות שנצפו ישירות בעין בלתי מזוינת. שינוי צבע יכול גם להיות שנצפו על ידי התוספת של יונים מתכתיים או צבעי פלורסנט כגון Calcein18, חומצת גרעין לצבוע19הידרוקסיל naphthol כחול20. בגלל היתרונות של רגישות גבוהה ונוחות של המבצע, המנורה מוחל נרחב בזיהוי חומצת גרעין.
כיום, קיימות אסטרטגיות בעיקר שני מבחני המנורה מולטיפלקס. אחת היא לבצע מבחני המנורה מרובים על-ידי המנורה מרובים פריימר מגדיר את שפופרת אחת21,22,23. עם זאת, הריבוי ואת היעילות הגברה מוגבלת על ידי הפרעה פנימית ועל תחרות בין קבוצות שונות פריימר. יתר על כן, זה יכול להיות קשה לזהות מוצרים שונים המנורה אותה התגובה. אסטרטגיה נוספת מבוססת על בידוד פיזי. ערכות פריימר שונים היו מבודדים לתוך תאים בודדים מיניאטורי, וכל מספר תגובות המנורה ואז יבוצעו בו זמנית24,25. גישות אלה, אשר בדרך כלל מבוססים על שבבי microfluidic, מספקים פתרון אפשרי לתגובות המנורה תפוקה גבוהה. אולם, לייצור השבבים ואת הציפוי קדם מולטיפלקס של ערכות פריימר הוא מסובך, אשר עשויים להגדיל את עלויות ולהקטין הפארמצבטית.
לאחרונה, מחקרים אחדים תיארו המנורה ביצוע, בתגובות נימים לעקוף את הזיוף מסובך של שבבי microfluidic, השיגו בעלות נמוכה זיהוי26,27. עם זאת, לגבי ניתוח תפוקה גבוהה, נימים אלה דומים מיניאטורי גירסאות של רצועת המבחנות כי הדגימות ואת התגובה ריאגנטים (כולל ערכות שונות פריימר) חייב להיות בנפרד מוכן להישלח שונים תגובת יחידות בתוך נימים. כדי להשיג במקביל וניתוח מולטיפלקס, ציוד נוסף, לדוגמה משאבת מזרק רב-ערוצי, נדרש לטעינה מקבילים של דוגמאות או נוגדנים.
כדי להתגבר על המגבלות הקשורות השיטות לגילוי מולטיפלקס של חומצות גרעין, פיתחנו פלטפורמה ולמחקר המשלב טכנולוגיה המנורה חזותית עם מערך נימי. פלטפורמה זו היא מטרות מרובות, קומפקטית בגודל, עלות נמוכה, וקל לתפעול28. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של כיצד לפברק את מערך נימי ולבצע את התגובות המנורה במערך. הפרוטוקול המתואר כאן יש כבר סטנדרטית באמצעות זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO) כמודל. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש גם בזיהוי תפוקה גבוהה של מטרות חומצות גרעין אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי העובש פלדת אל-חלד הנושאת את הצורה עבור המיקרו-הערוצים הרצוי ואת את מתאם טעינה שכבר נעשו (קובצי תלת-ממד מסופקים משלימה קבצים 1, 2. ). פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי צמח DNA בידוד כבר בוצעה.
1-ייצור של הקלטת מוכנה לשימוש מבוסס על מערך נימי
- לנקות את התבנית מפלדת.
- שטיפת כייר מפלדת מאת דטרגנט, אתנול ומים יונים כדי להסיר את מזהמים פוטנציאליים. יבש את התבנית על-ידי חנקן.
- לנקות את נימי הדם
- ללבוש משקפי מגן, כפפות מגן אחיד, כימית במעבדה.
- המקום נימים לתוך גביע. לנקות את נימי הדם עם 30 מ ל אצטון עבור 5 דקות כדי להסיר חומר אורגני, ולאחר מכן לשטוף את נימי הדם במים יונים.
התראה: להתמודד עם אצטון בשכונה fume. - שופכים 10 מ"ל של 2 O H 2 לתוך כשהספל ולאחר מכן להוסיף 30 מ של H 2 כדי 4 לתוך 2 O H 2 עם איטי רועד למניעת התחממות יתר. ודא כי הפתרון (פיראניה פתרון) תופש לחלוטין את נימי הדם במשך לפחות 30 דקות
התראה: להיזהר בעת טיפול פיראניה פתרון (H 2 אז 4 /H 2 O 2 = 3: 1, וי/v) . אם הפתרון פיראניה ישפך, לשטוף את הפתרון במהירות עם כמות גדולה של מים, לנגב את המשטח עם מגבות נייר.
הערה: ניקוי יסודי של נימים היא אחת מנקודות המפתח כדי להבטיח ההצלחה של התגובה המנורה. יש צורך לנער את הצילינדר חומצה במהלך העבודה כדי להסיר את הבועות נימים, גם ניתן להאריך את הזמן נקי כאשר הדבר יידרש. - לשטוף את הפתרון פיראניה עם כמות גדולה של מים. רחץ נימים עם אתנול וביו -יונים מים במשך 5 דקות. יבש הנימים בתנור ייבוש.
- למזוג polydimethylsiloxane (PDMS)
- משקל החוצה ריאגנטים הבסיס, ריפוי PDMS עם יחס של 1:1 בשפופרת 50 מ ל. בדרך כלל, לערבב 5 גר' elastomer הבסיס ל 5 גרם של אלסטומר אשפרה הסוכן.
- ומערבבים את התערובת היטב במשך כ- 5 דקות עם מוט זכוכית. מקום ברכבת התחתית עם PDMS בתוך צנצנת ואקום במשך 30 דקות בשביל לבטל את ההמתה.
- שופכים את PDMS לאט לתוך הגליל התבנית נירוסטה. לאפשר את PDMS לרפא עבור 3 שעות בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס
הערה: להיות זהירים כדי למנוע בועות אוויר בעת יציקת PDMS. לאחר PDMS השוטף, לאפשר לו לעמוד במשך 5 דקות טבעית הסרה של בועות מחוץ PDMS.
- להסיר את התבנית מן PDMS
- לאחר לרפא את PDMS, להסיר את התבנית על-ידי הוצאת את התבנית עם צילינדר. להסיר PDMS הגליל על ידי גזירה את השוליים של עובש עם אזמל.
- שטיפת PDMS שלוש פעמים עם אתנול ומים יונים. PDMS היבשה תמיכה עם חנקן-
- מתייחסים המשטח התחתון של התמיכה PDMS להיות הידרופובי. להשרות PDMS תמיכה בסופר-הידרופובי מעיל יבש ס' 1 זה 10 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את נימי בתומך PDMS
- הכנס הנימים נקי 4 מ מ לתוך החורים של התמיכה PDMS ולהשאיר 0.5 מ מ של הנימים מחוץ המשטח העליון של התמיכה PDMS. ודא הקצוות של נימים הם באותה רמה.
- לטיפול המשטח החיצוני של הנימים, המשטח העליון של התמיכה PDMS להיות הידרופובי.
- 15 להוסיף µL מעיל סופר-הידרופובי על גבי המשטח העליון של PDMS תמיכה. שים לב כי הציפוי מייד מתפשטת על כל המשטח העליון (כולל השטח העליון של התמיכה PDMS משטחים החיצוני של החלק החשוף של הנימים) בכוח נימי.
- אוויר יבש את מערך נימי ששונה סופר-הידרופובי.
- לתקן פריימר לתוך מערך נימי
- להכין פתרון פריימר. משקל החוצה 0.65 g משקם (נוסחה מולקולרית: (6 H ג 11 4) n) להמיס במים 50 מ ל יונים על-ידי התאמת רמת ה-pH ל 4.5-5.5 עם חומצה אצטית להשגת ריכוז משקם של 1.3%. הכנת תחל שילוב רכיבים לפי טבלה 1. ראה טבלה 1 משלים עבור תחל
- µL 1.6 להוסיף תערובת של קבוצה אחת של תחל למלא אחד המתאים נים של המערך נימי לפי צו מעוצב מראש.
הערה: הנימים ריק שני הנותרים נקבעו כפקדי שלילי. - לעגן את המערך בטוב שקוף של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח רגיל ויבש המערך ב 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 ח'
| המנורה פריימר שילוב רכיבים (ריכוז הראשונית) | נפח (μL) |
| ddH 2 O | 17.0 |
| משקם (1.3%) | 1.0 |
| תחל ב- FIP/ביפ (20 μM) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB פריימר (20 μM) | < td > 1.0/1.0|
| F3/B3 פריימר (20 μM) | 0.5/0.5 |
| הנפח הכולל | 25.0 |
טבלה 1: הרכיבים של המנורה פריימר מתקן ריאגנטים. הרכיבים של המנורה פריימר מתקן ערבוב מפורטים בעמודה השמאלית של הטבלה, הנפח של כל רכיב מופיע בעמודה השמאלית.
- להרכיב את הקלטת כדלקמן. לשים מתאם טעינה על החלק העליון של מערך מעוגן. ודא כי המנה של מתאם מכסה רק את החלקים החשופים של כל עשר נימים (ראה איור 1).
איור 1: קלטת ייצור והרכבה. עובש () נירוסטה ו- PDMS של תומכים. העובש מורכב מ-3 חלקים: גליל, דאם לוח עמוד צלחת. (b) שתתמודדו PDMS תמיכה ייצור והרכבה של קלטת נימי. התהליך כולו מכיל 5 שלבים: 1. PDMS לרדת גשם זלעפות, 2. עובש הסרת, 3. הוספת נים, ציפוי פני השטח, 4. פריימר מתקן ו- 5. קלטת עיגון. 1. שופכים את PDMS לתוך גליל התבנית; 2. לדחוף החוצה הלוח סכר כדי להסיר את התבנית PDMS תמיכה; 3. המעיל השטח למטה של PDMS לתמוך ולאחר מכן להכניס את נימי הדם PDMS תומך, ולבסוף מעיל המשטח העליון של תמיכה PDMS וחשפה את נימים. הקו הכחול עבה מציין את המעיל הידרופובי סופר; 4. לטעון פריימר להגדיר לתוך בודדים נימים. 5. לעגן את מערך נימי בצלחת 96-ובכן אחד ולהתקין מדגם טעינת מתאם אליו. הפרטים תוארו בשלבים פרוטוקול 1.1-1.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
2. ביצועים של המנורה התגובה במערך נימי
- להכין תערובת התגובה
- להכין את תערובת התגובה המנורה לפי T 2 מסוגל.
- הוסף ריאגנטים תערובת לפי הסדר שבחרת, כמו שולחן 2 ו מערבולת תערובת התגובה 5 s לאחר הוספת calcein. בעדינות פנימהוורט הצינור 20 פעמים לאחר פולימראז בסט נוסף.
| מרכיבים למכשירי תאורה (ראשי תיבות-ריכוז) | נפח (μL) |
| ddH 2 O | 11.6 |
| MgSO 4 (100 מ"מ) | 2.0 |
| dNTPs (25 מ מ) | 1.4 < /t d > |
| Betaine (5 מ') | 4.0 |
| מאגר (10 x) | 2.5 |
| Calcein (1.25 מ מ) | 0.5 |
| MnCl 2 (25 מ מ) | 0.5 |
| בסט < /em > פולימראז (U 8/μL) | 1.5 |
| צמח DNA (10 ng/μL) | 1.0 |
| הנפח הכולל | 25.0 |
טבלה 2: מערכת התגובה של המנורה-המערך נימי. הרכיבים של מערכת התגובה של רכיבי המנורה מערך נימי מפורטים בעמודה השמאלית, ואת הנפח של כל רכיב מופיע בעמודה השמאלית.
- לטעון את ריאגנטים. ואטמו את הקלטת
- פיפטה 20 µL המנורה תערובת התגובה עם תקן 100 µL עצה. הכנס את הטיפ לים של מתאם טעינה לנעול אותה. להחדיר בעדינות את תערובת התגובה לתוך המנה של מתאם; תערובת התגובה במהירות ממלאים את הכלים ולאחר מכן טעינה הנימים באופן אוטומטי באמצעות נימי כוח.
- להסיר את המתאם עם קצה נעול, לאטום היטב על ידי סרט איטום שקוף התואמים ל- PCR-
הערה: רק הנימים לגעת תערובת התגובה בצלחת הידרופילית יכול להיות מלא. לכן ודא החלק העליון של כל הנימים הם באותו הגובה (ראה איור 2).
איור 2: דיאגרמה לדוגמה-הטעינה באמצעות את מתאם טעינה. התמונה מראה את תהליך הטעינה העסקת פתרון כחול כדוגמה. הכנס את הטיפ לתוך הים, להזריק את הדגימה לתוך המתאם לאט ולאחר מכן הסר את המתאם עם טיפ נעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- Incubate מערך נימי באינקובטור ב 63 ° C עבור ה 1
3. תוצאות הבדיקה וניתוח נתונים
- לרכוש תמונות של פליטת קרינה פלואורסצנטית.
- לתקן את פילטר UV על המשטח העליון של פנס UV LED ידניים קטנים לסינון האור.
- לרגש את calcein dissociated לפלוט קרינה פלואורסצנטית עם הפנס UV. לכידת תמונות מהחלק העליון של המערך נימי באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם של.
- כאשר לוקחים תמונה, לוודא כי המצלמה היא הגדלה על האזור של הנימים ככל האפשר לקבל איכות גבוהה, נקה תמונות.
- לנתח את התוצאות
- לפתוח את תוכנת ניתוח התמונה על ידי תמונות ולאחר מכן בחר " התמונה > עובש > בגווני אפור > כן " ו- " התמונה > עובש > 16 סיביות > כן ". בחר " קובץ > שמור בשם > עיצוב > TIFF " כדי להמיר את התמונה לתבנית TIFF 16-bit.
- לחלץ הערך של עוצמת קרינה פלואורסצנטית
- פתח את תוכנת ניתוח microarray. גררו את התמונה בפורמט TIFF 16 סיביות לתוך ממשק התוכנה ולאחר מכן בחר את אורך הגל של " 532 ננומטר " וצבע של " ירוק " כדי להציג את התמונה.
- צור בלוק חדש כדי לאתר את המכשיר פלורסצנטיות מן הנימים. בחר " כלי > בלוקים חדשים " ולהזין את מספר העמודות והשורות כמו " 1; 1 " ו- " 2; 5 " ב ' רחובות ', ' תכונות ' הממשקים בנפרד.
- מיד לחץ על ובחר " תכונות " מודל ולאחר מכן התאם את המיקום ואת קוטר כדי להתאים את האזור זריחה של נימים. בחר " ניתוח " לשליפת הערך של עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
- בחר " קובץ > לשמור הגדרות כמו " כדי להציל את המסמכים בלוקים בחר " קובץ > להציל את תוצאות כמו " כדי להציל קרינה פלואורסצנטית עוצמת התוצאות. לחשב את SNR להגדיר אם המנורה מבוצעת בהצלחה בנימים.
הערה: אותות של הנימים התקבלו על ידי הקלטה שערכי אפור של כתמים, אות רעש יחסי (SNRs) הוגדרו יחסי כלומר הערכים של הקידמה אותות של המטרות לערכים רשע הממוצע של הקידמה אותות של שני השליליים פקדים. החיתוך כדי לקבוע אותות חיוביים הוגדר בתור SNR > 2-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשיטה זו, חשוב למניעת זיהום צולב בין נימים שונים במהלך הטעינה הדגימה. לענין זה, הוצג משקם, אשר יכול לשמר את תחל בנימים בודדים. כדי לבדוק אם זה עבד או לא, מראש תיקנו את פריימר (הפניה אנדוגני ג'ין תירס) ADH1 להגדיר את הקלטת נימי עם התבנית של "T" ו- "U", כמופיע ב איור 3a. כצפוי, רק פריימר נימים הכיל מגדיר הצגה חיובית אותות (איור 3b).
איור 3: דוגמאות של תוצאה נימי. () הפריסה של המערך נימי. המקומות הירוקים מציינים כי ADH-1 פריימר ערכות קבועים מראש ב נימים. (b) פלורסנט צילומים של שני המערכים נימי לאחר המנורה. הצבע הירוק הציג הגברה המנורה חיובי. הבדיקה בוצעה ב כפילויות. הגברה מוצלח רק שהוצגו בנימים פריימר-קבוע וללא זיהום בין נימים ריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
להעריך עוד יותר את היכולת לנטר GMO, בחרנו שבע נפוצים הטרנסגניים אלמנטים אשר מכסים ~ 75% מהאירועים GMO ממוסחר (קרי, P-CaMV35S, בר, פאט epsps, P-FMV35S, cp4, T-nos ו- nptII) (איור 4, פריסת) אשר תואמים מספר נימים 1-7, ואחד הגנים הפניה אנדוגני של תירס (ADH1). להראות יחודיות של שיטה זו, GM שלושה אירועים (MON863, MON89034 ו- 59122) היו שנבחרו וחלים עליהם שלווה. כדי לנתח את התוצאות, קרינה פלואורסצנטית תמונות היו נלקח על ידי המצלמה וניתח כמתואר בצעדים פרוטוקול. התוצאות הצפויות התקבלו עבור כל הבדיקות (איור 4). לדוגמה, עבור MON863 GM תירס, אותות חיוביים התקבלו על נימים 1, 6, 7 ו- 8, אשר תואמות את יעדי P-CaMV35S, T-nos nptII, הגן הפניה אנדוגני ADH1, בהתאמה.
איור 4: יחודיות עבור ניטור עברו להשתמש בהם. זיהוי שונים דגימות די אן איי, קרי, MON863, MON89034, 59122, שילוב של כל שלושת הנ ל GM אירועים (GMO mix), Non-GM תירס ומים טהורים (אין תבנית שליטה, NTC). 1 - 8: נימים מראש קבוע עם המנורה ערכות פריימר של P-CaMV35S, בר, cp4 epsps, P-FMV35S, פאט, T-nos, nptII, ו- ADH-1, בנפרד. 9 - 10, שני פקדים לא-פריימר. הבדיקה בוצעה ב כפילויות ומצאנו כי כל התוצאות היו בקנה אחד עם הציפיות. ראה משלים בטבלה 2 עבור ניתוח נתונים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי לבדוק את הביצועים של השיטה שלנו ביישום של העולם האמיתי, נבחרו שני מדגמים תירס מעשי לניתוח על ידי רגוע. אז התוצאות הושוו עם זה של ה-PCR והתוצאות בזמן אמת היו עקביים (איור 5, משלים בטבלה 2)
איור 5: תוצאות בדיקות שני מדגמים תירס. 1 - 8: נימים קבועה מראש עם המנורה תחל סדרת P-CaMV35S, בר, cp4 epsps, P-FMV35S, פאט, T-nos, nptII, ו- ADH-1, בנפרד. 9 - 10, שני פקדים לא-פריימר. הבדיקה בוצעה ב שכפל התוצאות הושוו עם זה של ה-PCR בזמן אמת ואת התוצאות היו עקביות. לקבלת תוצאות ההשוואה, ראה משלימים בלוח 3 . ראה משלים בטבלה 2 עבור ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים טבלה 1: רשימה של המנורה פריימר רצפים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלים בטבלה 2: ניתוח נתונים של המנורה מערך הניסויים. התאים בצבע ירוק מקודד בטבלה מצביעים על תוצאה חיובית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלים טבלה 3: ה-PCR בזמן אמת תוצאות טופס הדיווח. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פלטפורמת רגוע המודגמות כאן, אשר משלבת את הטכנולוגיה המנורה עם מערך נימי, מאפשרת זיהוי מטרות מרובות הקשורות GMO גן יחיד, מאוד יעיל וקל לתפעול מבחן בו זמנית.
כדי לבצע בהצלחה את התגובות המנורה מולטיפלקס בקלטת, שלוש נקודות קריטיות צריך להיות לב. ראשית, להשגת באותו גובה בחלק העליון של הנימים, התבנית הידרופיליות, הידרופוביות של המערך נימי הם קריטיים עבור טעינת בו-זמנית ריאגנטים לתוך כל הנימים. הנימים ליישר על-ידי צלחת לאחר הוספת הראשונית בתומך PDMS כדי להבטיח כל אחד מהם יכול לגעת תערובת התגובה טעון אל קערת מתאם טעינה. כאשר מטפלים המערך נימי עם מעיל סופר-הידרופובי, אל תאפשר את המעיל. שלך כדי לספוג לתוך השטח הפנימי של הנימים. פנקו את המשטח החיצוני של הנימים בטעינת רק המעיל על המשטח העליון של החלק העליון ש-PDMS תומכים, המאפשר את ציפוי להפיץ המשטחים החיצוניים של החלקים העליונים של הנימים. אם מדי פעם קורה כי לא כל הנימים מלאים של ריאגנטים, זה עשוי להיות זהיר לטעון ריאגנט ישירות לתוך נימי ספציפי.
שנית, להיזהר עם הכנת ריאגנטים המנורה. כל התהליך צריך בעדינות ובמהירות להתבצע על קרח, בשל הטמפרטורה נמוכה יחסית התגובה של המנורה ואת השבריריות של פולימראז בסט . רצוי ללחוץ ברכבת התחתית התגובה עם התערובת המנורה בעדינות במקום vortexing הצינור באלימות לאחר הוספת Bst פולימראז. טיפול לא מתאים עלול לגרום לכשל של התגובה. בניסוי זה, ADH1 (גנים התייחסות אנדוגני תירס) שוכן של הפקד חיובית, נימים שני ללא תחל מוגדרים כפקדי ריק. כך, אם המנורה תערובת מטופלת כראוי, הפקד חיובי יראה ירוק, הפקד ריק יישאר ללא שינוי לאחר הבדיקה מבוצעת.
שלישית, בשל יעילות גבוהה התגובה המנורה, זיהום חיובית או דחויים שווא עלול לקרות אם יש כמות עקבות של ה-DNA אמפליקון בסביבה. לכן, תמיד לזכור כי תהליכי התפעול קדם תגובה ותגובה פוסט-צריך להיות מופרדים לחלוטין בתחומים שונים ו צריך להיות אטום, יימחקו לאחר ניתוח בחוזקה המוצרים המנורה. יתר על כן, פקד ריק צריך להיות מוגדר עבור המציין הופעה נאותה של המנורה.
ממהותם, שלווה היא שיטה לזיהוי אוניברסלי חומצת גרעין מטרות מרובות עם יכולת הרחבה וגמישות טובות. תגובות המנורה הופיעה נימים יכול להיות מוחלף בקלות על ידי סוגים אחרים של שיטות הגברה איזותרמי, כגון גלגול מעגל הגברה (RCA)29, ו recombinase פולימראז הגברה (RPA)30. ניתן להחיל אותה גם בשדות זיהוי אחרים, כגון הפתוגן זיהוי27 ו מחלת אבחון31.
את הטופס הנוכחי של שיטה זו, למרות פריימר סטים קבועים מראש עם משקם, התהליך של הכנת התערובת המנורה עדיין נחוץ כאשר המבחן מבוצע, אשר מוריד את הפשטות של השיטה. כדי לטפל בבעיה זו, ניסינו טעינת מוקדמת של כל ריאגנטים של המנורה, נימי, ואז pipette את הדגימה לתוך בקלטת. הגבלה נוספת על השיטה שלנו, ייתכן חוסר מיצוי חומצת גרעין, אך אנו מפתחים כעת מכונה מבוססי-mobile, המשלבים את החילוץ של חומצות גרעין, תמונה אוטומטי לוקח ניתוח נתונים כדי להשיג אמיתי "לדוגמה בעת והוצאה תוצאות "השיטה.
לסיכום, פיתחנו פלטפורמה רגוע על ידי שילוב של המנורה מולטיפלקס עם מערך נימי. כשיטה זיהוי כללי חומצת גרעין, רוגע, ייתכן שיהיה פוטנציאל במגוון רחב של יישומים אחרים של ניתוח חומצת גרעין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה היה מומן בחלקו על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים (31370813, 3147670, 31670831, 31600672,), הטרנסגניים צמח מיוחד הקרן (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), תוכנית עבור כשרונות חדשים של מצוינות המאה ב האוניברסיטה הלאומית למחקר מפתח, פרוייקט פיתוח של סין (2016YFA0500601) ו סין-דוקטורט למדע (2016 ז 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
