الحمضية وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم. لتقييم آثار حمضية pH خارج الخلية في سرطان الخلايا في المختبر، قمنا بإنشاء نظم الثقافة حمضية بسيطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
شروط وورم المكروية، مثل نقص أو المجاعة المغذيات، تلعب أدواراً حاسمة في تطور السرطان والأورام الخبيثة. ومع ذلك، دور الأس الهيدروجيني خارج الخلية الحمضية في عدوانية الورم وآليتها الأساسية لا على نطاق واسع درست مقارنة بظروف المجاعة التاكسج أو المغذيات. وبالإضافة إلى ذلك، لم تبلغ تماما أسلوب ثقافة محددة تحديداً جيدا لتقليد خارج الخلية الحمضية وورم المكروية.
نقدم هنا طريقة بسيطة في المختبر ثقافة للحفاظ على درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية باستخدام تخفيض بيكربونات وزيادة لاكتات أو تركيزات HCl على المديين المتوسط والثقافة. الهيدروجيني المتوسط تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل وتدريجيا بنسبة 72 ح أثر الثقافة PANC-1 و AsPC-1 خلايا سرطان البنكرياس. ثلاثة شروط متميزة الوسائط الحمضية في هذه الدراسة العالية upregulated الجينات المراعية للحموضة مثل MSMO1، INSIG1، و IDI1 مقارنة بنقص أو المجاعة المغذيات. يمكن استخدام أوبريجوليشن لهذه الجينات كعلامة على درجة الحموضة الحمضية. هذه التقنيات البسيطة مفيدة توضيح الآليات الكامنة للورم الخبيث تحت الحمضية وورم المكروية. ولذلك، يمكن اكتشاف الاستجابات الخلوية الأس الهيدروجيني الحمضية ليس فقط في الخلايا السرطانية ولكن أيضا في الخلايا الأولية مثل الخلايا الأنبوبي الكلوي، بالنسبة حمضية الاضطرابات الأخرى بما في ذلك، ketoacidosis السكري، من نظامنا الثقافة الأس الهيدروجيني الحمضية خارج الخلية الحماض اللبن والحماض الأنبوبي الكلوي الحماض التنفسي.
المقدمة
وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم وسرطان الخلية الأيض1،،من23. الخلايا السرطانية غالباً ما يتعرضون لظروف مثل نقص والحرمان المغذيات، ودرجة الحموضة خارج الخلية الحمضية (pHe). ومع ذلك، دور الفنيل ألانين في تطور الورم لم يتضح على نطاق واسع كما هو الحال في المجاعة نقص أو المغذيات. يمكن أن تصبح pHe في أنسجة الورم الحمضية، تصل إلى حوالي الأس الهيدروجيني 6.84،5. ينبع الهيدروجيني الحمضية من إفراز جليكوليتيك الهوائية واللاهوائية للبروتونات (H+) ولاكتات بالسرطان تكاثر الخلايا5،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الحمضية الثقافة المتوسطة
-
إعداد التحكم (درجة الحموضة 7.4) والمتوسطة الثقافة المنخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8)
- حل ز 4.75 مسحوق دميم دون لام الجلوتامين في 500 مل الماء.
- إعداد الحل3 ناكو م 0.33 في زجاجة ضغط ضيق.
تنبيه: من المهم استخدام زجاجة ضيق ضغط منذ ناكو3 تنبعث CO2 الغاز عند تسخينها وتتحلل حرارياً. - اﻷوتوكﻻف المتوسطة والحل. تسمح هذه المخازن المؤقتة لتبريد إلى 25 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من 200 ملم ل الجلوتامين، 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين، و 50 مل مصل البقري الجنين إلى 500 مل دميم دون بيكربونات.
- للتحكم (درجة الحموضة 7.4) المتوسطة، إضافة 2.4 مل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد تركيز بيكربونات المناسبة، أعد دميم في النطاق من 0-8 مم NaHCO3 (تركيز النهائي في الأجلين المتوسط والثقافة)، ونجح في إعداد وسائط الثقافة مع الأس الهيدروجيني يتراوح من 6.4-7.4 (الشكل 1). ونحن على استعداد دميم مع 8 مم ناكو3 (الرقم الهيدروجيني 7.4) كعنصر التحكم المتوسطة، ومم 2 ناكو3 (الرقم الهيدروجيني 6.8) كوسيط مع الأس الهيدروجيني الحمضية ووفقا لتقرير سابق تفيد بأن درجة الحموضة خارج الخلية يصل الرقم الهيدروجيني 6.8 للأورام .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، يمكننا وصف نظام ثقافة الأس الهيدروجيني حمضية بسيطة وعملية التقييم. أن الجمع بين الطرق الثلاث تحمض المتوسط، أي، بيكربونات انخفاض التركيز وإضافة لاكتات، وإضافة HCl، أتاح لنا للتحقيق الدقيق في إليه الاستجابة للأس الهيدروجيني ومقارنة الاستجابة الخلوية للورم الأخرى ميكرونفيرونمينتال شروط مثل المجاعة نقص أو المغذيات.
مفتاح لهذا الأسلوب لتحديد التركيزات المناسبة بيكربونات ولاكتات HCl على المديين المتوسط والثقافة. قياس درجة الحموضة متوسطة مع مختلف بيكربونات تركيزات عند تنفيذ هذا الأسلوب .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
صاحب البلاغ Ayano كوندو موظف كيووا هاكو كيرين المحدودة
شكر وتقدير
ونشكر أعضاء شعبة العلوم الجينوم ومختبر لنظم علم الأحياء والطب، ركاست، جامعة طوكيو. لا سيما ونحن نشكر الدكتور H. أبوراتاني، كوداما ت. د.، (لسبم، ركاست، وجامعة طوكيو)، الدكتور ك. توميزوكا ويوشيدا ت. د. د. أ
كونيساتو (هاكو كيووا كيرين Co., Ltd.) لإجراء مناقشات مفيدة والدعم. هذا العمل جزئيا وأيده معونات للشباب عالم (A) (26710005، ل)، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (ح 01567، ل 26116711 و 16)، ومعونات للتحدي
البحوث الاستكشافية (16 14605 ك، ل) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان ومؤسسة العلوم وتاكيدا (ل)، ومؤسسة كوباياشي لأبحاث السرطان (ل) والمشروع لبحوث السرطان و تطور العلاجية (ف--إنشاء) والبحث العملي لمكافحة السرطان....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| النسر المعدل من دولبيكو" نيسوي" 2 | Nissui | 05919 | |
| مصل الأبقار الجنيني | ثيرمو فيشر | 10438 | |
| NaHCO3 | واكو | 191-01305 | |
| محلول L-glutamine | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| محلول مختلط بنسلين - ستربتومايسين (مستقر) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5 جم / لتر Tripsin / 0.53 مليمول / لتر محلول EDTA ، مع الفينول الأحمر | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5٪ - Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| محلول حمض اللاكتيك | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| حمض الهيدروكلوريك | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV نظام توليف الخيط | الأول Thermo Fisher | 18091 | |
| باور SYBR جرين PCR ماستر ميكس | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4368702 | |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB بنك الخلية | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis مع Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 نظام PCR في الوقت | الحقيقي Thermo Fisher | CRL-1682 |
المراجع
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-12....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
الحفاظ على الأس الهيدروجيني خارج الخلويحموضة البيئة الدقيقة للأورامالتعبير الجيني المستجيب للأس الهيدروجينيالحموضة الناجمة عن اللاكتاتالحموضة بوساطة حمض الهيدروكلوريكطريقة خفض البيكربوناتزراعة خلايا سرطان البنكرياسبروتوكول استخلاص الحمض النووي الريبوزيتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
