Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Published: November 19, 2017 doi: 10.3791/56660
Automatic Translation
1, 2
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

Summary

الحمضية وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم. لتقييم آثار حمضية pH خارج الخلية في سرطان الخلايا في المختبر، قمنا بإنشاء نظم الثقافة حمضية بسيطة.

Abstract

شروط وورم المكروية، مثل نقص أو المجاعة المغذيات، تلعب أدواراً حاسمة في تطور السرطان والأورام الخبيثة. ومع ذلك، دور الأس الهيدروجيني خارج الخلية الحمضية في عدوانية الورم وآليتها الأساسية لا على نطاق واسع درست مقارنة بظروف المجاعة التاكسج أو المغذيات. وبالإضافة إلى ذلك، لم تبلغ تماما أسلوب ثقافة محددة تحديداً جيدا لتقليد خارج الخلية الحمضية وورم المكروية.

نقدم هنا طريقة بسيطة في المختبر ثقافة للحفاظ على درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية باستخدام تخفيض بيكربونات وزيادة لاكتات أو تركيزات HCl على المديين المتوسط والثقافة. الهيدروجيني المتوسط تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل وتدريجيا بنسبة 72 ح أثر الثقافة PANC-1 و AsPC-1 خلايا سرطان البنكرياس. ثلاثة شروط متميزة الوسائط الحمضية في هذه الدراسة العالية upregulated الجينات المراعية للحموضة مثل MSMO1، INSIG1، و IDI1 مقارنة بنقص أو المجاعة المغذيات. يمكن استخدام أوبريجوليشن لهذه الجينات كعلامة على درجة الحموضة الحمضية. هذه التقنيات البسيطة مفيدة توضيح الآليات الكامنة للورم الخبيث تحت الحمضية وورم المكروية. ولذلك، يمكن اكتشاف الاستجابات الخلوية الأس الهيدروجيني الحمضية ليس فقط في الخلايا السرطانية ولكن أيضا في الخلايا الأولية مثل الخلايا الأنبوبي الكلوي، بالنسبة حمضية الاضطرابات الأخرى بما في ذلك، ketoacidosis السكري، من نظامنا الثقافة الأس الهيدروجيني الحمضية خارج الخلية الحماض اللبن والحماض الأنبوبي الكلوي الحماض التنفسي.

Introduction

وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم وسرطان الخلية الأيض1،،من23. الخلايا السرطانية غالباً ما يتعرضون لظروف مثل نقص والحرمان المغذيات، ودرجة الحموضة خارج الخلية الحمضية (pHe). ومع ذلك، دور الفنيل ألانين في تطور الورم لم يتضح على نطاق واسع كما هو الحال في المجاعة نقص أو المغذيات. يمكن أن تصبح pHe في أنسجة الورم الحمضية، تصل إلى حوالي الأس الهيدروجيني 6.84،5. ينبع الهيدروجيني الحمضية من إفراز جليكوليتيك الهوائية واللاهوائية للبروتونات (H+) ولاكتات بالسرطان تكاثر الخلايا5،6.

وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن هستون الحمضية الناجمة عن الفنيل ألانين ديسيتيليشن، وأكسدة الأحماض الدهنية، والرقابة من lysosomes الحمضية للتكيف للبيئة الحمضية الشديدة7،،من89،10. ومع ذلك، يؤثر الآليات عن طريق التي تحمض خارج الخلية سلوك السرطان وهوية مفتاح المنظمين في الأس الهيدروجيني الحمضية وورم المكروية لم تحدد تماما. وعلاوة على ذلك، وصفت عدة تقارير مختلف وسائل الإعلام الأس الهيدروجيني الحمضية باستخدام تركيزات غير واضحة بيكربونات والمخزن المؤقت تريس، والأنابيب، وحبيس أو لاكتات و HCl، ولكن هناك تقارير قليلة تثبت استقرار المعدل المتوسط ولا شاملة مقارنة بين عدة وسائط الثقافة الحمضية متميزة7،،8،9،10

لتوضيح أن المنظمين الرئيسيين والتغيرات الأيضية في الخلايا السرطانية في سياق تحمض خارج الخلية، إنشاء نموذج ثقافة بسيطة في المختبر للحفاظ على الفنيل ألانين حمضية، وبحث دور الفنيل ألانين في خلايا السرطان11. باستخدام هذا الأسلوب، حافظنا على وسيط الثقافة حمضية مع pHe 6.8 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2، استخدام بيكربونات خفض تركيزات في الأجلين المتوسط والثقافة. الأس الهيدروجيني 7.4 استخدمت كالمعتاد والتحكم في المتوسط. تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل درجة الحموضة المتوسطة وانخفضت تدريجيا من ح 72 خلال ثقافة خلايا سرطان البنكرياس PANC-1 و AsPC-1. نظراً لتسارع تحلل تعزيز إفراز البروتونات ليس فقط ولكن أيضا لاكتات7،،من89، أنشأنا أيضا ثقافة أسلوب محاكاة الحماض لاكتات المستحثة بإضافة لاكتات بدلاً من خفض تركيز بيكربونات. بالإضافة إلى ذلك، pHe الحمضية الناجمة عن HCl على المديين المتوسط ويسمح لنا باستبعاد إمكانية أن الاستجابات الخلوية للأس الهيدروجيني الحمضية الثقافة المتوسطة ليست نتيجة لانخفاض تركيز بيكربونات. وعلاوة على ذلك، باستخدام وسائل الإعلام المختلفة مع الرقم الهيدروجيني من 6.4 إلى 7.4 مع تركيز بيكربونات مختلفة، يمكننا تقييم مدى الآثار الفنيل ألانين في الاستجابات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الحمضية الثقافة المتوسطة

  1. إعداد التحكم (درجة الحموضة 7.4) والمتوسطة الثقافة المنخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8)
    1. حل ز 4.75 مسحوق دميم دون لام الجلوتامين في 500 مل الماء.
    2. إعداد الحل3 ناكو م 0.33 في زجاجة ضغط ضيق.
      تنبيه: من المهم استخدام زجاجة ضيق ضغط منذ ناكو3 تنبعث CO2 الغاز عند تسخينها وتتحلل حرارياً.
    3. اﻷوتوكﻻف المتوسطة والحل. تسمح هذه المخازن المؤقتة لتبريد إلى 25 درجة مئوية.
    4. إضافة 5 مل من 200 ملم ل الجلوتامين، 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين، و 50 مل مصل البقري الجنين إلى 500 مل دميم دون بيكربونات.
    5. للتحكم (درجة الحموضة 7.4) المتوسطة، إضافة 2.4 مل م 0.33 ناكو3 حل كل 100 مل دميم دون بيكربونات. للمتوسطة والمنخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8)، إضافة 0.6 مل م 0.33 NaHCO3 حل كل 100 مل دميم دون بيكربونات.
    6. فحص درجة الحموضة المتوسطة بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
      ملاحظة: مقدار NaHCO3 الحل يحتاج إلى تعديلها اعتماداً على درجة الحموضة متوسطة الحجم، التي يمكن أن تختلف تبعاً لمحتوى2 CO حاضنة والضغط الجوي. ومن الناحية المثالية، للمرة الأولى، فمن الأفضل لقياس درجة الحموضة متوسطة مع تركيزات بيكربونات المختلفة لتحديد المبلغ المناسب لحل3 ناكو إضافة إلى دميم.
      1. جمع الثقافة المتوسطة فورا بعد إزالة الطبق الثقافة من حاضنة2 CO وقياس درجة الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. الحفاظ على درجة حرارة متوسطة في 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي إذا لزم الأمر. قياس درجة الحموضة متوسطة ثلاث مرات بشكل مستقل.
        ملاحظة: يجب أن يتم تخزين ناكو3 الحل عند 4 درجة مئوية وكل وسائل الإعلام ينبغي أن يكون طازج. يتم سرد المنتجات المتاحة تجارياً التي يمكن استخدامها في هذه الدراسة في الجدول للمواد.
  2. إعداد متوسطة الثقافة الحمضية الناجمة عن لاكتات أو بفعل HCl
    1. إضافة ميليلتر 74 من حل لاكتات أو 125 ميليلتر من 1 M HCl إلى 100 مل من التحكم المتوسطة (أعد الخطوة 1.1.5).
    2. فحص درجة الحموضة المتوسطة بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
      ملاحظة: مقدار لاكتات أو حل HCl يحتاج أيضا إلى تعديلها وفقا لدرجة الحموضة متوسطة الحجم، التي يمكن أن تختلف تبعاً لمحتوى2 CO في حاضنة والضغط الجوي. ومن الناحية المثالية، فمن الأفضل لقياس pH متوسطة مع لاكتات المسلسل أو تركيزات HCl لتحديد المبلغ المناسب للتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة من المتوسط.

2-حصاد وعلاج الخلايا

  1. البدء في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 1 أسبوع على الأقل قبل إجراء التجارب.
    ملاحظة: يتم سرد خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول للمواد.
  2. مرور الخلايا عندما تصل إلى كونفلوينسي 70-90%. لا تسمح للخلايا لتصبح متكدسة. تغيير في المتوسط كل 2-3 أيام أثناء زراعة اليومية.
  3. غسل الخلايا بإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني، وإضافة فصل الإنزيم مثل 1 مل التربسين.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم تقريب الخلايا وبدء فصل.
  5. إضافة 5 مل من الثقافة المتوسطة إلى خلايا منفصلة وإلغاء تنشيط الإنزيم. نقل تعليق خلية الأنبوبة 15 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 300 x زاي Aspirate المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا مع الثقافة المتوسطة.
  6. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق.
  7. بذور 5.0 × 105 خلايا/بئر طبق 10 سم في 10 مل متوسطة. احتضان الخلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
  8. نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 5 مل برنامج تلفزيوني، وإضافة 10 مل المتوسطة الثقافة الحمضية أعدت في الباب 1. احتضان الخلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.

3. عزل الحمض النووي الريبي

  1. نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 5 مل برنامج تلفزيوني. تعطيل الخلايا بإضافة كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجداول من المواد).
  2. كشط الطبق بإيجاز، ثم إزالة الكاشف استخراج الحمض النووي الريبي مع ماصة وإيداع رنا الاستخراج الكاشف/الخلية في أنبوب 1.5 مل. تترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة 250 ميليلتر كلوروفورم ويهز الأنبوب بقوة لترك حوالي 15 س. في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في إيه إيت، 000 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. بعناية إزالة المرحلة المائية باستخدام ماصة. تترك وراءها بعض المرحلة مائي. ضع في أنبوب 1.5 مل آخر.
  5. إضافة 550 ميليلتر الايزوبروبانول إلى مرحلة مائي وتخلط برفق. تترك في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي بالسرعة القصوى (إيه تو زيرو، 000 x ز) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. صب قبالة الكحول وإضافة 1 مل 75 ٪ إيثانول في ديبك المياه المعالجة. المزيج بلطف. الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 5 دقائق.
  7. "الماصة؛" قبالة الإيثانول واسمحوا أيردري الكريات.
  8. إضافة حوالي 15-25 ميليلتر (اعتماداً على حصيلة) من ديبك المياه المعالجة لبيليه الجيش الملكي النيبالي. مزيج دقيق.
  9. قياس تركيز الحمض النووي الريبي معزولة عن طريق قياس التوجيه التشغيلي في 260 نيوتن متر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.

4-كدنا التوليف

  1. الجمع بين المكونات التالية في أنبوب تفاعل PCR: يصل إلى 5 ميكروغرام مجموع الجيش الملكي النيبالي، 1 ميليلتر اليغو ديناراً (50 ميكرومتر) أو "عشوائي التمهيدي مزيج" (60 ميكرومتر)، 1 دنتب ملم 10 ميليلتر، والمياه خالية من نوكلاس إلى إجمالي حجم 14 ميليلتر.
  2. خلط وإيجاز الطرد المركزي المكونات باستخدام الطرد مركزي benchtop صغيرة (~ 5 s). تؤذي العينة من الحمض النووي الريبي/التمهيدي لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. تدور بإيجاز (~ 5 s) من benchtop صغيرة باستخدام الطرد المركزي ووضع العينة على الفور على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  3. أضف المكونات التالية: ميليلتر 4 5 x "عكس النسخ" الاحتياطي، 1 ميليلتر المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر)، 1 ميليلتر "رناسي المانع" (40 ش/ميليلتر).
    ملاحظة: يتم عرض أمثلة لمجموعات المتاحة تجارياً في الجدول للمواد
  4. كاب الأنبوب، مزيج، وثم الطرد المركزي بإيجاز محتويات الطرد مركزي benchtop صغيرة استخدام (~ 5 s). احتضان الخليط رد فعل مجتمعة في 50-55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. إلغاء تنشيط رد الفعل التي تفرخ في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

5-قياس التعبير الجيني المراعية لحمض باستخدام PCR الوقت الحقيقي

  1. الجمع بين المكونات التالية في لوحة رد فعل جيدا 384: 1 ميليلتر قالب كدنا، 0.75 ميليلتر 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine، 0.3 ميليلتر 50 ميكرون إلى الأمام التمهيدي، عكس ميليلتر 0.3 50 ميكرومتر التمهيدي، 1 ميليلتر [تق] [بولمرس]، 2.5 ميليلتر 10 x [تق] [بولمرس] المخزن المؤقت، 2.5 دنتب مم 20 ميليلتر، المياه 16.65 ميليلتر.
    ملاحظة: يبين الجدول للموادمثال لمجموعات المتاحة تجارياً. ويرد في الجدول 1قائمة بأجهزة الإشعال. يمكن استخدام لوحة رد 96-جيدا أيضا في هذه الخطوة. يمكن أيضا استخدام المجسات الأخرى (مثلاً، مسبار Taqman).
  2. قم بإعداد التجربة والبرنامج بكر التالية على "نظام PCR الوقت الحقيقي": 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، دورة 1؛ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورة 1؛ 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، دورات 40؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورة 1؛ 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورة 1؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 1 دورة.
  3. ضع اللوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج.
    ملاحظة: أن Upregulation الجينات استجابة الأس الهيدروجيني MSMO1و INSIG1و IDI1 يمكن أن يقاس بمستويات البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد تركيز بيكربونات المناسبة، أعد دميم في النطاق من 0-8 مم NaHCO3 (تركيز النهائي في الأجلين المتوسط والثقافة)، ونجح في إعداد وسائط الثقافة مع الأس الهيدروجيني يتراوح من 6.4-7.4 (الشكل 1). ونحن على استعداد دميم مع 8 مم ناكو3 (الرقم الهيدروجيني 7.4) كعنصر التحكم المتوسطة، ومم 2 ناكو3 (الرقم الهيدروجيني 6.8) كوسيط مع الأس الهيدروجيني الحمضية ووفقا لتقرير سابق تفيد بأن درجة الحموضة خارج الخلية يصل الرقم الهيدروجيني 6.8 للأورام الصلبة4،5. الرقم الهيدروجيني للوسط الحمضي تستمر لمدة 24 ساعة، وانخفضت تدريجيا إلى حوالي pH 6.6 عن 72 ساعة خلال الثقافة PANC-1 والخلايا AsPC-1 (الشكل 2). المقبل، لتحديد مقدار لاكتات أو HCl المطلوبة لضبط السيطرة على الأس الهيدروجيني 6.8 المتوسط (درجة الحموضة 7.4)، نحن إضافة كميات مختلفة من لاكتات أو HCl إلى وسيلة مراقبة وقياس درجة حموضة المتوسط، ووجد أن الرقم الهيدروجيني للمتوسط التحكم مع كونسينتراتيو النهائي n 22.5 لاكتات ميكرومتر و 6.25 مم HCl بلغت قيمة 6.8 (الشكل 3).

ويمكن تقييم تأثير التحميض خارج الخلية باستخدام وسيلة مع انخفاض درجة الحموضة بسهولة استناداً إلى upregulation جينات المراعية للأس الهيدروجيني الحمضية مثل MSMO1و IDI1و INSIG1. وزادت هذه الجينات عاليا هيدروجيني منخفضة مقارنة بالتعبير عنها تحت نقص أو المجاعة المغذيات (الشكل 4). وباﻹضافة إلى ذلك، upregulation من هذه الجينات ليست محددة بمتوسط الرقم الهيدروجيني الحمضية الناجمة بيكربونات انخفاض مستويات، وكانوا أيضا upregulated من متوسط الذي كان سببه الأس الهيدروجيني الحمضية إضافة لاكتات و/أو HCl (الشكل 5). مقارنة الاستجابات الخلوية لوسائل الإعلام التي الهيدروجيني الحمضية مشتق من مستويات انخفاض بيكربونات أو إضافة لاكتات أو HCl تمكننا من تحديد ما إذا كانت الاستجابات الخلوية الخاصة بأنواع معينة من التحمض. أوبريجوليشن الحمضية pH المورثات المسؤولة مثل IDI1و MSMO1و INSIG1 هيدروجيني منخفض خارج الخلية كما يحدث في الخلايا الطبيعية (الشكل 6)، حيث لدينا طريقة يمكن تطبيقها على الخلايا السرطانية ليس فقط ولكن أيضا الخلايا الطبيعية. تحت ظروف ارتفاع درجة الحموضة، مستوى تعبير الجينات الأس الهيدروجيني المسؤولين لم يكن upregulated PANC-1 والخلايا AsPC-1 (الشكل 7)، التي يمكن أن تستخدم كمراقبة سلبية.

Figure 1
الشكل 1. العلاقة بين تركيز3 ناهكو والمتوسطة الأستاذ المحور الأفقي يبين تركيز ناكو3 والمحور الرأسي يظهر الرقم الهيدروجيني المتوسطة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. تغيير الأس الهيدروجيني متوسطة منخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8) الثقافة المتوسطة خلال 72 ح-الثقافة- الأس الهيدروجيني المتوسط تستمر لمدة 24 ساعة وانخفض تدريجيا ح 72 خلال ثقافة خلايا PANC-1 و AsPC-1. 5.0 × 105 خلايا المصنف إلى طبق 10 سم في 10 مل متوسطة، المحتضنة ح 24، وتغيرت إلى درجة الحموضة منخفضة الثقافة المتوسطة. وترد البيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة من تجارب مستقلة على الأقل ثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. الارتباط بين لاكتات أو تركيزات HCl ودرجة الحموضة في المتوسط- كانت مخزنة المتوسطة التحكم (درجة الحموضة 7.4) بتركيزات مختلفة من لاكتات أو HCl. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. Upregulation النسخي الجينات المراعية للأس الهيدروجيني الحمضية استجابة لانخفاض الأستاذ كان مستوى التعبير MSMO1، و IDI1، و INSIG1 أعلى في PANC-1 والخلايا AsPC-1 في سياق انخفاض الأس الهيدروجيني (pH) من تحت ظروف المجاعة المغذيات (NS) أو نقص (ح) بعد تعرض 24 h. البيانات ± يعني وزارة شؤون المرأة من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة. الطالب t-أجريت اختبارات للمقارنات المشار إليها. ف < 0.005. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. Upregulation النسخي الجينات المراعية للأس الهيدروجيني الحمضية ردا على الحماض اللبن والحماض HCl بوساطة- التعبير عن مرناس IDI1، و MSMO1، و INSIG1 في PANC-1 الخلايا والخلايا AsPC-1 يحدده تحليل سلسلة من ردود الفعل الكمية بوليميراز في الوقت الحقيقي تحت التحكم (Con؛ ودرجة الحموضة 7.4)، وانخفاض درجة الحموضة (الأس الهيدروجيني؛ الرقم الهيدروجيني 6.8، خفضت كمية ناكو3 )، الحماض اللبن (لاكتات؛ الرقم الهيدروجيني 6.8، زاد مقدار لاكتات)، وشروط الحماض وساطة قائمة توافق الأجهزة (HCl؛ الرقم الهيدروجيني 6.8، زادت كمية HCl) حاء 24 تعرض بيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. الطالب t-أجريت اختبارات للمقارنات المشار إليها. ف < 0.005. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. Upregulation النسخي الجينات المراعية للأس الهيدروجيني الحمضية في استجابة لانخفاض الرقم الهيدروجيني في الخلايا الطبيعية. كان مستوى التعبير MSMO1و IDI1و INSIG1 أوبريجولاتيد الليفية KMS-6، TIG، وترد MRC9 الخلايا وخلايا هوفيك بطانية بعد 24 h. البيانات ± يعني وزارة شؤون المرأة من تجارب مستقلة على الأقل ثلاثة. الطالب t-أجريت اختبارات للمقارنات المشار إليها. ف < 0.005. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7. مستوى تعبير الجينات الأس الهيدروجيني المسؤولين الحمضية بشرط ارتفاع الأس الهيدروجيني (درجة الحموضة 7.6 إلى 8.0) بالمقارنة بانخفاض درجة الحموضة (الأس الهيدروجيني 6.8). وترد خلايا AsPC-1 بعد 24 h. البيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة من ثلاثة على الأقل ولم يتغير مستوى تعبير الجينات الأس الهيدروجيني المسؤولة مثل IDI1و MSMO1و INSIG1 تحت ظروف ارتفاع الأس الهيدروجيني (درجة الحموضة 7.6 إلى 8.0) في PANC-1 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التمهيدي تسلسل التمهيدي إلى الأمام التمهيدي عكس تسلسل بيمير
أكتب --أجاجاجاتكاكتجكككتجكاكك 5 '-3' أكتب --ككتجكتجكتجاتككاكاتكتجكتج 5 '-3'
MSMO1 --أتكاتجاجتتكاجكتككات 5 '-3' MSMO1 --آجكاكجاتككاتجاااات 5 '-3'
INSIG1 --تجكاجكتكككاجتاتك 5 '-3' INSIG1 5-أكتجكججتجتاتجاج-3 '
IDI1 --تجاتاااككككتجتجتج 5 '-3' IDI1 --كاكاتككجكاتاكتجتج 5 '-3'

الجدول 1- قائمة بأجهزة الإشعال المستخدمة في التحليل الكمي PCR الوقت الحقيقي-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف نظام ثقافة الأس الهيدروجيني حمضية بسيطة وعملية التقييم. أن الجمع بين الطرق الثلاث تحمض المتوسط، أي، بيكربونات انخفاض التركيز وإضافة لاكتات، وإضافة HCl، أتاح لنا للتحقيق الدقيق في إليه الاستجابة للأس الهيدروجيني ومقارنة الاستجابة الخلوية للورم الأخرى ميكرونفيرونمينتال شروط مثل المجاعة نقص أو المغذيات.

مفتاح لهذا الأسلوب لتحديد التركيزات المناسبة بيكربونات ولاكتات HCl على المديين المتوسط والثقافة. قياس درجة الحموضة متوسطة مع مختلف بيكربونات تركيزات عند تنفيذ هذا الأسلوب للمرة الأولى من المهم تحديد المقدار المناسب من ناكو3 في المتوسط. وخلال هذه العملية، من الضروري قياس درجة الحموضة المتوسطة بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2، كحالة CO2 متوسطة درجة الحرارة والتوازن تؤثر بشكل كبير درجة الحموضة المتوسطة. وكثيراً ما ينصح التعقيم بيكربونات، بيكربونات بسهولة تصبح مسطحة. كثافة الخلية والخلية كونفلوينسي عوامل حاسمة لأن أعدادا كبيرة من الخلايا السرطانية المتزايدة بسهولة أسيديفي المتوسطة الثقافة حتى في عينات السيطرة. وباﻹضافة إلى ذلك، ردود على درجة الحموضة الحمضية خارج الخلية تعتمد على حالة الخلايا وقد تتلاشى كما هي باساجيد الخلايا، حيث استخدمت الخلايا التي تحتوي على أقل من 10 مقاطع للتجارب.

أظهرت استقرار الأس الهيدروجيني المتوسطة ح 24 كثيرا أسلوبنا ومقارنة عدة وسائل الإعلام الأس الهيدروجيني الحمضية. في هذا البروتوكول، استخدمت الأس الهيدروجيني متوسطة 6.8 كشرط انخفاض درجة الحموضة، لكن المسلسل الأس الهيدروجيني الحمضية بين pH 6.4 و 6.9، بالإضافة إلى وسائل الإعلام المسلسل الأس الهيدروجيني القاعدي بين درجة الحموضة 7.4 و 8.0، استخدمت للتحقيق في الاستجابة الخلوية ضد التحمض خارج الخلية.

نحن تركز أساسا على خلايا السرطان، ولكن يمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع أخرى من الخلايا داخل ورم المكروية، بما في ذلك الخلايا اللحمية والخلايا المناعية، وخلايا بطانية والأوعية الدموية. نحن وآخرون ذكرت أن على الأقل بعض آليات حساسة درجة الحموضة في الخلايا السرطانية شائعة في الخلايا الطبيعية7. من الممكن أيضا لتطبيق هذا الأسلوب لتحليل الخلايا الأولية الأخرى، فضلا عن الخلايا الجذعية الجنينية والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent. يمكن أن يكون القيد واحد من هذا النظام الثقافة صعوبة الحفاظ على الشرط الأس الهيدروجيني الحمضية في تجارب طويلة الأمد.

الحماض يرتبط بأنواع مختلفة من الأمراض. هذا الأسلوب يمكن أن تنطبق ليس فقط في أبحاث السرطان ولكن أيضا في دراسة الاضطرابات الحمضية مثل السكر ketoacidosis والحماض الأنبوبي الكلوي الحماض التنفسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

صاحب البلاغ Ayano كوندو موظف كيووا هاكو كيرين المحدودة

Acknowledgments

ونشكر أعضاء شعبة العلوم الجينوم ومختبر لنظم علم الأحياء والطب، ركاست، جامعة طوكيو. لا سيما ونحن نشكر الدكتور H. أبوراتاني، كوداما ت. د.، (لسبم، ركاست، وجامعة طوكيو)، الدكتور ك. توميزوكا ويوشيدا ت. د. د. أ
كونيساتو (هاكو كيووا كيرين Co., Ltd.) لإجراء مناقشات مفيدة والدعم. هذا العمل جزئيا وأيده معونات للشباب عالم (A) (26710005، ل)، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (ح 01567، ل 26116711 و 16)، ومعونات للتحدي
البحوث الاستكشافية (16 14605 ك، ل) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان ومؤسسة العلوم وتاكيدا (ل)، ومؤسسة كوباياشي لأبحاث السرطان (ل) والمشروع لبحوث السرطان و تطور العلاجية (ف--إنشاء) والبحث العملي لمكافحة السرطان مبتكرة من وكالة اليابان للبحوث الطبية والتنمية، AMED (ل).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 Nissui 05919
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10438
NaHCO3 Wako 191-01305
L-glutamine solution Thermo Fisher 25030-081
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) Nacalai 09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red Nacalai 32778-05
0.5%-Trypan Blue Stain Solution Nacalai 29853-34
Lactic acid solution Sigma-Aldrich 252476
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H9892
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN 74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18091
Power SYBR Green PCR Master Mix  Applied Biosystems 4368702 
Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
PANC-1 ATCC CRL-1469
AsPC-1 ATCC CRL-1682
KMS-6 JCRB Cell Bank JCRB0432
TIG JCRB Cell Bank
MRC9 ATCC CCL-212
HUVEC ATCC CRL-1730
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Fisher ND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher CRL-1682

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
  2. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  3. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  4. Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
  6. Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
  7. McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
  8. Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
  9. Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
  10. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
  11. Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 129، Extracellular انخفاض درجة الحموضة، وورم المكروية، لاكتات، نقص، المجاعة المغذيات، أسلوب الثقافة، والمتوسطة
إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kondo, A., Osawa, T. Establishment… More

Kondo, A., Osawa, T. Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System. J. Vis. Exp. (129), e56660, doi:10.3791/56660 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter