Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

Denne protokollen detaljer bygging og drift av real-time 3D enkelt partikkel sporing mikroskop kan sporing nanoskala fluorescerende sonder på diffusive høye og lave Foton teller priser.

Abstract

Sanntid tredimensjonale enkelt partikkel sporing (RT-3D-SPT) har potensial til å belyse rask, 3D prosesser i cellular systemer. Selv om ulike RT-3D-SPT metoder har blitt lagt frem de siste årene, fortsatt sporing høyhastighets 3D spre partikler til lav Foton teller priser en utfordring. Videre er RT-3D-SPT oppsett generelt komplisert og vanskelig å gjennomføre, begrense deres omfattende programmet biologiske problemer. Denne protokollen presenterer en RT-3D-SPT system kalt 3D dynamisk Foton lokalisering sporing (3D-DyPLoT), som kan spore partikler med høy diffusive hastighet (opptil 20 µm2/s) på lav Foton teller priser (ned 10 kHz). 3D-DyPLoT benytter en 2D elektro-optisk deflektor (2D-EOD) og en tunable akustisk gradering (TAG) linse å kjøre en enkelt fokusert laser spot dynamisk i 3D. Kombinert med en optimalisert posisjon estimering algoritme, kan 3D-DyPLoT låse på enkelt partikler med høy hastighet og høy lokalisering presisjon. Enkelt eksitasjon og enkelt oppdagelsen bane layout er 3D-DyPLoT robust og lett å konfigurere. Denne protokollen diskuterer hvordan bygge 3D-DyPLoT steg for steg. Først er optisk oppsettet beskrevet. Deretter er systemet kalibrert og optimalisert av raster skanning en 190 nm fluorescerende perle med piezoelectric nanopositioner. Til slutt, for å demonstrere real-time 3D-sporing evne, 110 nm fluorescerende perler spores i vann.

Introduction

Fremveksten av avanserte imaging teknikker har åpnet et vindu for å se mer detaljert struktur av mobilnettet fenomener, helt ned til molekylært nivå. Metoder som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)1,2,3, foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM)4,5,6,7 , strukturert belysning mikroskopi (SIM)8,9,10,11og stimulert utslipp uttømming mikroskopi (STED)12,13, 14 har gått langt utover Diffraksjon grensen til levere enestående detaljer i struktur og funksjon av levende celler. Men krever full forståelse av hvordan disse systemene fungerer dynamisk informasjon samt strukturinformasjon. Super-oppløsning metodene ovenfor innebære en avveining mellom romlig oppløsning og midlertidig løsning, begrense timelige presisjonen som dynamisk prosesser kan bli undersøkt. En metode som gir både høy romlig presisjon og midlertidig løsning er RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Her vi trekke et skille mellom tradisjonelle 3D-SPT30 og RT-3D-SPT. tradisjonell 3D-SPT bare krever en gang rekke tredimensjonale bildedata (som kan erverves enten med AC confocal mikroskop eller et mikroskop-epifluorescence gitt den riktige konfigurasjonen). I tradisjonelle 3D-SPT bestemmes koordinatene av partikkel etter innsamling av finne partikkelen i hver bildestakk og å sette sammen stedene i påfølgende volumer til å opprette en bane. For disse metodene bestemmes ultimate timelige oppløsningen av volumetriske tenkelig hastigheten. For AC confocal mikroskoper er dette lett på omfanget av sekunder å titalls sekunder. For epifluorescence metoder, hvor den optiske banen endres slik at aksial stedsinformasjonen kan hentes, begrenses timelige oppløsningen kameraet eksponering eller avlesning da. Metodene epifluorescent er begrenset i området som aksial opplysninger kan samles, men framskritt i Fourier flyet fase masker design og adaptive optikk utvider disse områdene 10 µm eller mer31,32 , 33 , 34.

Derimot stole RT-3D-SPT ikke på å anskaffe en 3D bildestakk og finne partikler i ettertid. I stedet, sanntid stedsinformasjon er hentet via enkeltpunkt detektorer og tilbakemeldinger brukes effektivt "låse" partikkel i fokal mengden av linsen ved hjelp av et høyhastighets piezoelectric stadium. Dette tillater kontinuerlig måling av partikkels posisjon begrenset bare av hvor mange fotoner kan samles. Denne metoden kan videre spectral avhør av partikkel når den beveger seg over lange avstander. RT-3D-SPT faktisk fungerer som en kraft-fri optisk felle nanoskala objekter, der partikkelen er kontinuerlig analysert og målt i sanntid uten behov for stor laser krefter eller optisk styrker. Gitt at RT-3D-SPT gir et middel for kontinuerlig avhør raskt diffusive objekter (opptil 20 µm2/s)25,29 i tre dimensjoner for lav Foton teller priser20,29, 35, bør det gi et vindu inn fort eller forbigående biologiske prosesser som intracellulær Last transport, ligand-reseptor bindende og ekstracellulære dynamikken i én virions. Imidlertid til dette punktet er anvendelse av RT-3D-SPT begrenset til håndfull grupper som arbeider for å fremme denne teknologien.

En barriere er kompleksiteten av optisk oppsettet kreves av RT-3D-SPT metoder, som varierer. For de fleste metoder gis det optisk tilbakekobling av en piezoelectric scene. Som partikkel gjør små bevegelser i X, Y eller Z, readouts fra eneste detektorer konverteres til feilfunksjoner og matet på høy hastighet til en piezoelectric nanopositioner, som i sin tur går prøve å motvirke den partikkelen bevegelse, effektivt låse den på plass i forhold til linsen. Å måle små posisjonelle bevegelser i X, Y og Z, flere detektorer (4 eller 5 avhengig av implementeringen)15,18,21 eller flere eksitasjon flekker (2-4, lavere som kan brukes hvis en låsbare forsterker brukes til å hente X og Y posisjon ved hjelp av en roterende laser spot)25,28 brukes. Overlapping av disse flere gjenkjenning og utslipp flekker gjøre systemer vanskelig å justere og vedlikeholde.

Her presenterer vi en høyhastighets mål-låst 3D-SPT metode med en forenklet optisk design kalt 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT bruker en 2D-EOD og en TAG linsen36,37,38 dynamisk flytte en fokusert laser spot gjennom objektive fokal volumet til en høy rente (50 kHz XY, 70 kHz Z). Laser fokus plasseringen og Foton ankomsttid kan partikkels 3D posisjon innhentes raskt selv på lav Foton teller priser. 2D-EOD kjører laser fokus i en ridders tour mønster39 square størrelse på 1 x 1 µm i X-Y flyet og TAG linsen flytter laser fokus i aksial retning med en rekke 2-4 µm. 3D partikkel plassering oppnås med en optimalisert posisjon estimering algoritmen29,40 i 3D. Kontroll av den 3D dynamisk bevegelse laser spot, Foton teller fra skred photodiode (APD), sanntid partikkel posisjon beregning, piezoelectric scenen tilbakemeldinger og datainnspilling utføres på en feltet programmerbare gate array (FPGA).I denne protokollen, vi beskriver hvordan å bygge en 3D-DyPLoT mikroskop trinnvis, inkludert optisk justering, kalibrering med faste partikler, og endelig gratis partikkel sporing. Som en demonstrasjon, ble 110 nm fluorescerende perler kontinuerlig sporet i vann for minutter om gangen.

Metoden beskrevet heri er et ideelt valg for alle programmer der det er ønskelig å kontinuerlig overvåke en raske fluorescerende sonde tåler lite lys, inkludert virus, nanopartikler og blemmer som endosomes. I motsetning til tidligere metoder er det bare en enkelt eksitasjon og enkelt oppdagelsen pathway, gjør justering og vedlikehold enkelt. Videre gjør området stort oppdagelsen denne mikroskop for å enkelt hente raskt spre partikler, mens muligheten til å spore på lav signal nivåer (ned 10 kHz) gjør denne metoden perfekt for dårlige programmer29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. oppsett oppsett og justering

  1. Installasjon og kollimasjon av sporing magnetisering laser
    1. Påføre laser optisk tabellen ved hjelp av en hjemme-bygget mount. Fjellet er en enkel aluminiumsplate med monteringshuller laser hodet og optisk tabellen. Laser bør være godt festet til et metall montere for stabilitet og varmespredning. Til dette bruker du en 488 nm solid state laser for belysning (figur 1), men bølgelengden kan velges for å passe en bestemt fluorophore eller eksperiment. En kritisk faktor er at laser bølgelengden passer 2D-EOD arbeidsgruppen sortiment, som bestemmes av bølge tallerkenen mellom to avvisere (figur 1: W2). 488 nm laser kan effektivt opphisse grønn eller gul fluorescerende protein (GFP/YFP), som er vanlige lysrør koder i levende celle eksperimenter.
    2. Justere laser strålen høyden og retningen med en dielektrisk speil (figur 1: M). Kontroller laserstrålen er parallell til tabellen optisk og tilpasse den til en egnet høyde.
      Merk: Høyden skal være valgt basert på mikroskopet plattformen. Denne høyden bør opprettholdes for alle etterfølgende speil brukt i denne protokollen, men det ikke vil uttrykkelig uttalt.
    3. Collimate strålen med et par linser (figur 1: L1 og L2). Brennvidder av linser bør velges nøye unngå laser stedet blir avkuttet ved åpningen av 2D-EOD. Klipping er tydelig ved en endring i laser strålen form etter passerer gjennom 2D-EOD. Kvaliteten på kollimasjon her er veldig viktig fordi avvik vil bli forsterket av påfølgende linser og noen forskjeller vil svekkes ytelsen til 2D-EOD nedbøyning. Ideelt sett collimate strålen ved å fokusere strålen til et punkt på minst 20 meter unna.
  2. Plassere et pinhole (figur 1: PH) av passende størrelse på fokus for første kollimasjon linse (figur 1: L1).
    1. Velg en passende størrelse pinhole. Pinhole størrelsen kan velges basert på følgende beregning:
      Equation 1
      Hvor λ er bølgelengdeområdet av laser, f er brennvidden på første linse, og D er input strålen diameter.
    2. Montere hullet på en 3D oversettelse scene slik at den kan plasseres nøyaktig på fokus for første kollimasjon linse.
    3. Juster plasseringen av hullet. Plasser en laser power meter etter hullet og Juster pinhole posisjon i XYZ å maksimere makt meter avlesning. Hvis en Diffraksjon ring er observert, blokkere det med en iris plassert foran 2D-EOD.
  3. Installasjon av Glan-Thompson polarisator
    1. Sette Glan-Thompson polarisatoren (figur 1: GP) etter andre kollimasjon objektivet (figur 1: L2) å rengjøre polarisering av laserstrålen. Rotere polarisatoren for å finne maksimal overføringshastighet med strømmåleren.
  4. Installasjon av EODs
    1. Bruk 2 EODs (figur 1: EOD1 & EOD2) å avlede laseren i X- og Y-retning. Maksimere laser overføringen ved å justere yaw, tonehøyde og høyden på hver EOD.
    2. Justere de to EODs med hensyn til hverandre ved å bruke justeringen markøren fra produsenten på siden av hvert deflektor.
    3. Bruke et testmønster kontrollør av 2D-EOD undersøke resultatet av EOD. Dette kan enten være knight's tur (figur 2) via FPGA beskrevet nedenfor eller en enkel sinuskurve levert av en funksjonsgenerator. Best ytelse, skal nedbøyning av hver deflektoren være parallelt enten X- eller Y-retning av piezo-nanopositioner. Denne retningen er diktert av kantete retning avvisere om overføring aksen. Hvis du vil rotere nedbøyning retning uten å flytte 2D-EOD, sett en due prisme etter 2D-EOD justere på nedbøyning aksene piezo nanopositioner akser.
  5. Installasjon av halv-bølge plate
    1. Plasser en halv-bølge plate (figur 1: W1) mellom Glan-Thompson polarisatoren (figur 1: GP) og 2D-EOD justere innkommende laser stråle polarisering med nedbøyning aksene av 2D-EOD. Plasser en lang fokus linse (300 mm) etter 2D-EOD og Plasser et sCMOS kamera laser fokus. Slå deretter på 2D-EOD generere knight's tur beskrevet nedenfor (figur 2). Rotere halv-bølge platen til en jevnt kvadrat laser distribusjon er observert på kameraet.
  6. Installasjon av en bjelke expending linsen par og relé linsen par
    1. Plassere et par linser (figur 1: L3 og L4) etter 2D-EOD å utvide strålen å fylle den tilbake blenderåpningen på objektivet mål (figur 1: OL) og et par linser (figur 1: L5 og L6) til stafett fokalplanet til mikroskopet målsettingen. Husk å la nok plass mellom disse linsene som TAG linsen vil bli installert mellom dem i et senere trinn.
  7. Installere dichroic filter, 10/90 strålen splitter, fokus linse, APD, linsen og fluorescens utslipp filter for å fullføre gjenkjenning veien.
    1. Installere dichroic filter (figur 1: DC) å reflektere laser mot linsen. Justere laseren gå rett gjennom sentrum av linsen bruker to iriser på toppen og bunnen av en lang linse.
    2. Installere en 10/90 strålen splitter (figur 1: BS) av som 10% av lyset reflekteres for bildebehandling av en sCMOS kamera (beskrevet nedenfor) og 90% av passerer gjennom APD for sporing.
    3. Juster APD. Fokusere laseren på en dekkglassvæske av linsen. Bruke refleksjon fra dekkglassvæske til å justere alt nedstrøms elementer ved å sette en dekkglassvæske på objektive fokus og kontrollere intensiteten av APD avlesning. Etter strålen splitter, installere APD fokus linse (figur 1: L7) etterfulgt av APD på en 3D oversettelse scene. Plasser linsen slik at laser refleksjon fra målet går gjennom midten av linsen.
APD plasseringen kan optimaliseres ved å justere 3D posisjon for å maksimere intensiteten laser refleksjon på dekkglassvæske. APD stillingen er i optimal posisjon når et trekk av detektor posisjon i alle retninger reduseres intensiteten.
  • Installere en longpass fluorescens utslipp filter (figur 1: F) før strålen splitter fjerne reflekterte og spredte lys.
  • Installasjon av TAG linsen
    1. Plass TAG linsen mellom de linser (mellom figur 1: L4 og L5) som nevnt før og vist i figur 1. Justere yaw, pitch, høyden og lateral posisjon slik at strålen passerer vinkelrett gjennom sentrum av TAG linsen.

    • 2. prøven forberedelse.

    1. Fast partikkel forberedelse
      1. Fortynne 190 nm fluorescerende perler å ~ 5 × 108 perler/mL i PBS. Legge til 400 µL perler løsning på en dekkglassvæske og montere på prøven innehaver av piezoelectric scenen (volumet av perler avhenger eksempel innehaveren, diameteren på prøven holder kammeret brukes her er 18 mm). For perler brukt her, forårsaker PBS partikler innskudd i dekkglassvæske.
    2. Gratis bevegelige partikkel forberedelse
      1. Fortynne 110 nm fluorescerende perler å ~ 5 × 108 perler/mL med DI vann. Legge til 400 µL perler løsning på en dekkglassvæske og montere på prøven innehaver av piezoelectric scenen.

    3. optimalisere sporing parametere

    1. Raster skanne faste partikler
      1. Sette en fast partikkel prøve på mikroskopet.
      2. Slå på laser, micropositioner kontroller, piezo nanopositioner kontroller, TAG linsen kontrolleren og EOD-kontrolleren. Merk at rekkefølgen ikke er viktig. Kjør piezo-nanopositioner i lukket sløyfe.
      3. Raster skanne eksemplet i XYZ ved hjelp av en egendefinert skanning program (Figur S3, programvare tilgjengelig på forespørsel fra forfatterne), som driver 2D-EOD i en ridders tour (figur 2), samler teller fra APD, kjører piezo nanopositioner, og utfører posisjon beregning (Figur S2). Trinn er 40 nm og skanning området er 2 µm.
        1. For å montere dekkglassvæske på fokus på målet, fjerne fluorescens utslipp filteret og bruke refleksjon av laser fra dekkglassvæske for å maksimere signal intensiteten som en funksjon av Z-posisjonen til micropositioner. Etter å plassere prøven på fokalplanet, plassere tilbake fluorescens utslipp filteret.
        2. Åpne skanneprogrammet. Angi skanning området og steg størrelse ved å skrive inn tall i 'starte', 'Fullfør' og 'trinn'. Først sette et stort skanning område og steg størrelse å finne en partikkel (f.eks, 10 x 10 µm område med 200 nm steg størrelse). Etter finne partikkelen, krympe skanning området og redusere steg størrelse (f.eks, 2 x 2 µm område med 100 nm steg størrelse). Klikk "Søk" for å utføre en 3D raster søk for å finne fluorescerende fokus.
    2. Innstillinger for objektiv (se også Figur 3)
      1. Klikk på TAG linsen kontroll programvare. Klikk "koble til", "strøm på" sekvensielt.
      2. For å endre output fasen utløser signaler, er det nødvendig å endre utløser utdatamodus. Først endre modus fra 'RGB' til 'Multiplane' og deretter endre den tilbake. Nå fasen kan være endret (figur 3b).
      3. Angi utgang fasen å være 0, 90 ° og 270 °. Mens alle tre faser som dekker fase plassen kan brukes, disse tre er funnet for å fungere godt empirisk (Figur 3 c).
      4. Velg frekvensinnstillingen 68,500 Hz.
      5. For å finne den optimale hyppigheten er det ofte nødvendig å endre søk frekvensområdet. Klikk "Avansert", "stille". Endre det ' maks. Freq(Hz) "kolonnen 0 fra 70 000 Hz til 71,500 Hz. Dette kan justeres til uansett frekvensområdet er riktig. Klikk "Lagre kalibrering", "Exit kalibrering" (figur 3d).
      6. For å gjøre den nye kalibreringen effektiv, bytte resonans til en annen frekvens (for eksempel 189,150 Hz), og deretter byttet tilbake til 68,500 Hz frekvensinnstillingen (figur 3e).
      7. Endre amplituden gradvis til 35%. Klikk på "Lås resonans". Når frekvensen er låst, klikker du "Låse opp resonans" (figur 3e). TAG objektivet er klar til å bruke nå.
      8. Kalibrere, endre parameterne som brukes i estimering for å gjøre anslått plassering lik virkelige plasseringen, som vist i figur 4e, f. Input skanning området x, y og z og klikk "Søk" knappen skanne eksemplet i XYZ å flytte den partikkel gjennom bevegelige laser stedet. Plasseringen av partikkel bør når de skannes gjennom laser fokus enig med anslagsvis partikkel plassering bestemmes av posisjon estimering loop (Figur S1). Forholdet mellom beregnede posisjon og ekte posisjon (Figur 4 d) kan hentes fra den anslåtte plasseringen bilder (figur 4f). Hvis plasseringene ikke er enig, kan du justere verdiene for laser posisjon (ck) brukes i posisjon estimering loop (Figur S1).
      9. Justere TAG linsen
        1. Når koden linsen kontrolleren er av, skannede rasterization partikkel bilder (beskrevet nedenfor) tatt før du installerer TAG linsen og etter installere TAG linsen skal se identiske. Deretter utføre fluorescerende partikkel Z stabel skanning ved å flytte målet med z-nanopositioner til å justere plassering og vinkel TAG linse (Figur 4). Finjustere plasseringen av TAG linsen inntil det er ingen drift i partikkel bilder i XY fly langs Z-retningen, som oppnås når det er ingen endring i XY posisjon av partikkel som en funksjon av Z posisjonen (Figur 4 d). I sporingssystemet er klar til bruk etter justering av TAG linsen.
    3. Installasjon av sCMOS kamera for partikkel overvåking
      1. Installere sCMOS kamera å visualisere partikler mens de spores. Installere sCMOS bare etter at alle komponentene i sporingssystemet er installert og optimalisert.
    Laste inn en fast fluorescerende partikkel prøve på mikroskopet og kjøre sporing programmet å låse en partikkel objektive fokal volumet. Deretter installerer 100 mm brennvidde objektivet (figur 1: L8) og sCMOS. Juster sCMOS posisjon slik at bildet av partikkelen er fokusert til minste og lyseste punktet.

    4. 3D sanntidssporing av fritt spre nanopartikler

    1. Sett 110 nm gratis flytte partikkel eksempler på mikroskopet.
    2. Slå på laser, mikro-positioner kontrolleren, piezo nanopositioner kontroller, TAG linsen kontrolleren og EOD-kontrolleren. Kjøre piezo-nanopositioner i åpent. Sette TAG linsen programvare etter trinn 3.2.
    3. Åpne og kjøre sporing (tilgjengelig på forespørsel fra forfatterne). Angi plasseringen estimering parametere til standardverdiene optimalisert, som ble funnet i avsnitt 3.
    4. For å montere dekkglassvæske på fokus på målet, fjerne fluorescens utslipp filteret og bruke refleksjon av laser fra dekkglassvæske for å maksimere signal intensiteten som en funksjon av Z-posisjonen til micropositioner. Etter å finne dekkglassvæske, øke fokus posisjon 15 µm å fokusere laseren i dekkglassvæske og i løsningen. Sett tilbake fluorescens utslipp filteret.
    5. Angi integrert kontroll konstanter. Integrert kontroll konstanter kan defineres starter på en lav verdi og sakte øke til svingninger kan bli sett i partikkels posisjon readouts. Når svingninger er observert, kan du angi integrert kontroll konstanter til 80% av verdien forårsaker svingninger. Verdiene blir rundt 0.012 for XY "integrert gevinst" og 0.004 for Z "integrert gevinst".
    6. Angi sporing grensene i 'Spor Threshold' og "Spor Minimum" og start sporing eksperimentet ved å klikke "Søk" og 'Auto spor'. Terskelen for avslutning sporing er angitt litt høyere enn bakgrunnsnivået og terskelen for utløser sporing er omtrent to ganger høyere enn bakgrunnen. Her terskelen for utløser sporing er 3 kHz og terskelen for slutter banen er 1,5 kHz.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Fast partikkel skanning (Figur 4) og fritt spre 110 nm fluorescerende partikkel sporing (figur 5) ble utført etter protokollen ovenfor. Partikkel skanningen ble utført ved å flytte piezoelectric nanopositioner og bin fotoner mens samtidig beregne partikkels estimerte posisjon på hvert punkt i søket. Skanning bildet viser en firkant med intensitet (figur 4a) og anslått stillingene viser en lineær sammenheng med partikkels virkelige posisjon over et 1 × 1 × 2 µm område i x, y- og z-retningen (figur 4b-f).

    For å demonstrere sanntidssporing, ble 110 nm fluorescerende partikler sporet i vann av 3D-DyPLoT (figur 5a, b). Betyr kvadratisk forskyvning (MSD) analyse viser en typisk lineær atferd karakteristisk for Brownsk bevegelse (figur 5 c). MSD analyse av 30 baner viste en gjennomsnittlig etter diameter på 110 nm, i god avtale med produsenter spesifikasjonen for størrelsen av den fluorescerende nanopartikler spores (figur 5 d). I tillegg film 1 viser sanntids piezoelectric nanopositioner readouts og synkronisert sCMOS bilder på en 2 min lang bane av et fritt spre 110 nm fluorescerende partikkel.

    I tillegg til å kunne spore med høy hastighet, kan langsom bevegelse partikler være lokalisert med høy presisjon. Figur 6a - d viser bruk av 3D-DyPLoT systemet til faste partikler med de samme parameterne for tilbakemelding som brukes for høyhastighets sporing, viser en presisjon 17,6, 26,4 og 53,4 nm i X, Y og Z, henholdsvis med Foton teller antall 105. Figur 6e - h viser presisjonen tilbakemelding kontroll redusert med en faktor på 10, effektivt bytte hastighet for presisjon og viser en presisjon 6.5, 8.3 og 10.5 nm i X, Y og Z, henholdsvis.

    Figure 1
    Figur 1. Skjematisk av 3D sporingssystem. 2D-EOD (EOD1 & EOD2) og TAG objektivet (TAG) avlede laser langs XY og Z retningene, henholdsvis. APD (APD) brukes til å samle fluorescens fotoner, som sendes til FPGA (FPGA). FPGA brukes for posisjon beregning algoritme, Foton teller, kontroll av 2D-EOD samt kontroll og presentasjon av piezoelectric nanopositioner (NSxy og Focus). Andre komponenter som er merket i figur: speil (M). objektiver (L #); pinhole (PH); Glan-Thompson polarisator (GP); halv-bølge plate (W1); dichroic filter (DC); linsen (OL, 100 X NA = 1,49); fluorescens utslipp filter (F); stråle splitter (BS); XY micropositioner scenen (MSxy); Z micropositioner trinn (MSz). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2. Koordinater for knight's tur i 3D-DyPLoT. 1 og aksen 2 skal justeres langs X- eller Y-aksen ved riktig justering av 2D-EOD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3. TAG linsen programvareinnstillinger. Se delen 4.2 linsen innstillinger for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4. Partikkel skanning og posisjon estimering. (a) skanning bilde av 190 nm fluorescerende perler med 2D-EOD kjøring laser i en 1 × 1 µm square knight's tur mønster. Fluorescens intensitet er merket med farge. Enhet: kHz. (b) estimering av xk, den partikkel plassering i forhold til midten av 2D-EOD skanne i mikrometer. Fargen i b, cog d angir anslått plassering. Enhet: µm. (c) estimering av yk i mikrometer. (d) estimering av zk, den partikkel plassering i forhold til aksial midten av TAG linsen skanne i mikrometer. (e) beregnet partikkel stilling yk som en funksjon av scenen posisjon gjennomsnitt over hele rutenettet fra (c). Merk at anslått partikkel plassering fra posisjon estimering algoritmen (yk) enig med ekte posisjon. (f) beregnet partikkel plassering zk som en funksjon av scenen posisjon gjennomsnitt over hele rutenettet fra (d). Anslått plassering viser en lineær sammenheng med partikkel virkelige posisjon over 1 × 1 × 2 µm område i X-, Y- og Z-retningen. Merk at anslått partikkel plassering fra posisjon estimering algoritmen (zk) enig med ekte posisjon. Anslått plassering viser en lineær sammenheng med partikkel virkelige posisjon over et 1 × 1 × 2 µm område i X, Y og Z-retningen. Hvit skalaen barer i (en-c) representerer 500 nm og baren svart skala i (d) representerer 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5.Sporing 110 nm fluorescerende partikler i vannet med 3D-DyPLOT. (en) 3D banen til et fritt spre 110 nm fluorescerende hydrogenion i vann. (b) fluorescerende intensiteten som en funksjon av tid for banen i (en). (c) MSD av banen i (en). Den blå linjen er den målte MSD mens den stiplede røde linjen er beste tilpasset linje fra lineær regresjon. (d) MSD analyse av 30 baner, viser en gjennomsnittlig etter diameter på 110 nm, i god avtale med størrelsen av fluorescerende nanopartikler spores. Diameteren på partiklene ble beregnet med Stokes-Einstein forholdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 6
    Figur 6. Presisjon av fast partikkel sporing. (en) A fast partikkel er sporet av 3D-DyPLoT til forskjellige antall priser. Presisjonen er (b) 17,6 nm i X, (c) 26,4 nm i Y, og (d) 53,4 nm i Z på en utslipp 100 kHz. (e) når sondering tregere prosesser, tilbakemeldinger kontrollen konstant (Kjeg) kan reduseres med en faktor på 10 å øke presisjon. Under denne redusert tilbakemelding kontroll er presisjon (f) 6.5 nm i X, (g) 8.3 nm i Y, og (h) 10.5 nm i Z på en utslipp 100 kHz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Finne S1. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Finne S2. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Finne S3. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Tilleggsinformasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Selv om mange varianter av 3D enkelt partikkel oppfølgingsmetoder har dukket opp de siste årene, er robust sanntidssporing av høyhastighets 3D diffusjon til lav Foton teller priser enkelt fortsatt en utfordring, som begrenser sin søknad til viktige biologiske problemer. 3D-DyPLoT metoden beskrevet i denne protokollen løser disse utfordringene på en flere måter. Først er eksitasjon og oppdagelsen veier forenklet sterkt sammenlignet med andre implementeringer gjør justering enkel og robust. Dernest gir er bevegelige laser spot og posisjon estimering algoritmen nøyaktig posisjon estimater for feedback loop, gjør tilbakemelding mer stabil. For det tredje, de effektivt stor rekkevidde (1 x 1 x 4 µm) av dynamisk bevegelse laser spot tillater sporing av rask bevegelse partikler. For å se hvorfor dette store oppdagelsen området er kritisk, er det viktig å vurdere iboende responstid for piezoelectric nanopositioner. Høyhastighets piezoelectric scener har resonanser på 1 kHz, begrense responstiden være på 1 ms. i 1 ms, en 100 nm hydrogenion med en diffusjon koeffisient på 4 µm2/s, vil diffus på gjennomsnittlig 90 nm fra midten av Diffraksjon-li egrenset detection volum. Dette er bare gjennomsnittlig forskyvning og virkelig tilfeldige bevegelse vil ha trinn mye større enn dette, fører til partikkelen forlate fokal volumet og slutter nåværende bane. Situasjonen er enda verre for mindre partikler, der stadig større termisk diffusive skritt føre til tap av sporing. Effektivt stor oppdagelse området tillater sporingssystem overvinne iboende piezoelectric scenen lag og store diffusive hopp i partikkel posisjon, øker den generelle robustheten av sporingsmekanismen. Til slutt, store skanneområdet at systemet kan lett plukke opp nye partikler, slik at påfølgende baner anskaffes raskt og store datasett kompilert.

    Brukeren bør huske på at det er noen viktige trinn. Først justeringen av både 2D-EOD og TAG linsen er kritiske. Begge må være godt justert for å få optimal presisjon. Andre parameterne som brukes i posisjon estimering i fast partikkel skanning trinn må også kalibreres (se Figur 4). Anslått partikkel stillingen skal samsvare med partikkel posisjonen svarer til midten av laser skanneområde. Endelig bør tilbakemelding integrert konstanter (Kjeg) være innstilt forsiktig, starter med en liten verdi og deretter gradvis inntil svingninger er observert, så oppbakking av til ca 80% av verdien.

    Det er et par advarsler om 3D-DyPLoT å huske avhengig av ønsket program. Mens optimalisert posisjon estimering er utformet for bruk med Brownsk bevegelse, er det også godt egnet mot retningsbestemt bevegelse. Algoritmen kan direkte brukes til alle typer bevegelse siden det er bare posisjon usikkerheten som antas for å være Gaussian, ikke ekte partikkel plasseringen. I tilfeller der det forventes vedvarende lineær bevegelse, en term kan legges til prediksjon begrepet posisjon estimering algoritmen (se formel 3 Tilleggsinformasjon).

    Valg av parametere for 2D-EOD og TAG bør nøye vurderes når du konfigurerer 3D-DyPLoT. Spesielt viktig er det bin tidsforbruket for knight's tur skannet av 2D-EOD. I en ideell situasjon, vil knight's tur synkroniseres til perioden av TAG linsen å sikre effektiv prøvetaking. Men er det viktig å vurdere responstid for 2D-EOD gå endringer i spenning. For enheten brukes her, er det en 2-3 µs svartid etter spenningen er brukt før det ønskede stedet er nådd. På 20 µs bin tid er dette ca 10-15% av samlingen tiden. Reduserer slik at den samsvarer med koden linsen perioden ~ 14 µs øker brøkdel av den bin tid, som oppholdstiden av 2D-EOD. Dette fører til feil verdier av laser plasseringen og feil posisjon estimater.

    En annen faktor for eksperimentator å huske på er midlertidig løsning. Mens dataene vises her samles på en 100 kHz datahastighet, er ultimate timelige oppløsningen definert til slutt som data brukes for posisjon måling. Hvis avlesning av nanopositioner brukes som partikkel posisjon (figur 6), avhengig timelige oppløsningen av verdien av integrert kontroll konstant. For eksempel for integrert kontrollen vises i figur 6a-d, scenen svar er på 1 MS. mens for figur 6e-h, det er på 10 ms. hvis raskere midlertidig løsning, så fotonet-av-fotonet resultatet av posisjon estimering algoritmen vil relatere med Foton teller rate. For eksempel en 10 kHz utslipp hastighet gir 100 µs midlertidig løsning og en 100 kHz utslipp hastighet gir en 10 µs midlertidig løsning. I tillegg siden presisjon følger en Equation 2 forholdet41, romlige og tidsmessige presisjon er koplet. Resultatet bestemmer lysstyrken på sonden både romlige og tidsmessige presisjon.

    I denne protokollen beskrev vi oppsett, oppsett og justering av et høyhastighets real-time 3D enkelt partikkel oppfølgingsmetode som benytter en 2D-EOD og TAG linsen dynamisk flytte en fokusert laser spot å oppnå rask partikkel plassering estimering. Vi beskrev deretter prøve forberedelse og parameteren optimalisering metoder. 3D-DyPLoT tilbyr en robust og relativt enkel metode til lock-on beveger seg raskt og ydmyk emitting diffusive partikler. Enkel optisk utformingen gjør at den kan enkelt legges til alle eksisterende mikroskopstativet side-porten slik at den kan kombineres med bildebehandling moduler. Med denne protokollen håper vi at RT-3D-SPT kan være mer implementert av flere etterforskere ta raske, tre-dimensjonale biologiske prosesser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health prisen nummer R35GM124868 og Duke University.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Tags

    Bioteknologi problemet 131 enkelt partikkel sporing optisk mikroskopi fluorescens imaging-systemer optisk feller optikk 3D spore sanntid partikkel sporing
    En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter