Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Published: January 3, 2018 doi: 10.3791/56711
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Duke University

Summary

Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.

Abstract

Real-time driedimensionaal één deeltje bijhouden (RT-3D-SPT) heeft het potentieel om licht te werpen op snelle, 3D processen in cellulaire systemen. Hoewel in de afgelopen jaren verschillende RT-3D-SPT methoden naar voren gebracht hebben, blijft hoge Trackingsnelheid 3D verspreiding van deeltjes tegen lage foton graaf tarieven een uitdaging. Bovendien, RT-3D-SPT opstellingen zijn over het algemeen complexe en moeilijk uit te voeren, door hun wijdverbreide toepassing voor biologische problemen te beperken. Dit protocol stelt een systeem van de RT-3D-SPT genoemd 3D dynamische Photon lokalisatie Tracking (3D-DyPLoT), die deeltjes met hoge diffusive snelheid (tot 20 µm2/s) kunnen volgen bij lage foton graaf tarieven (tot 10 kHz). 3D-DyPLoT maakt gebruik van een 2D electro-optic deflector (2D-EOD) en een lens afstembare akoestische verloop (TAG) naar station een honkslag gericht laser spot dynamisch in 3D. Gecombineerd met een geoptimaliseerde positie schatting algoritme, kunt 3D-DyPLoT op enkele deeltjes met hoge snelheid en hoge lokalisatie precisie vergrendelen. Als gevolg van de interne excitatie en één detectie pad-indeling is 3D-DyPLoT robuust en eenvoudig te installeren. Dit protocol wordt beschreven hoe u het bouwen van 3D-DyPLoT stap voor stap. Ten eerste, de optische lay-out wordt beschreven. Vervolgens is het systeem gekalibreerd en geoptimaliseerd door raster scannen een 190 nm fluorescerende kraal met de piëzo-elektrische nanopositioner. Tot slot, om aan te tonen real-time 3D tracking vermogen, 110 nm fluorescerende kralen worden bijgehouden in water.

Introduction

De opkomst van geavanceerde beeldvormende technieken heeft geopend een venster om te zien steeds meer gedetailleerde structuur van cellulaire fenomenen, helemaal tot op het moleculaire niveau. Methoden zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)1,2,3, foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM)4,5,6,7 , gestructureerd verlichting microscopie (SIM)8,9,10,11, en gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED)12,13, 14 ver voorbij de limiet van de diffractie te leveren van ongekende detail in de structuur en functie van levende cellen. Volledige inzicht van hoe deze systemen zich gedragen, vereist echter dynamische informatie evenals structurele informatie. De super resolutie methodes hierboven vermelde omvatten een trade-off tussen ruimtelijke resolutie en temporele resolutie, beperking van de temporele precisie waarmee dynamische processen kunnen worden bestudeerd. Een methode die biedt zowel hoge precisie van de ruimtelijke en temporele resolutie is RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Hier maken we een onderscheid tussen de traditionele 3D-SPT30 en RT-3D-SPT. traditioneel 3D-SPT gewoon vereist een tijdreeks van gegevens van de drie-dimensionale afbeelding (die kan worden verkregen via een confocal microscoop of een epifluorescence-Microscoop gegeven van de juiste configuratie). In traditionele 3D-SPT, worden de coördinaten van het deeltje bepaald na de gegevensverzameling door het lokaliseren van het deeltje in elke afbeeldingsstapel en concatenatie van de locaties in opeenvolgende volumes maken een traject. Voor deze methoden, wordt de ultieme temporele resolutie bepaald door de volumetrische imaging tarief. Voor confocal microscopen is dit gemakkelijk op de schaal van seconden tot tientallen seconden. Voor epifluorescence methoden, waarin de optische weglengte wordt gemanipuleerd zodat de axiale locatiegegevens kan worden geëxtraheerd, is de temporele resolutie beperkt door de camera belichting of uitlezing tijd. Deze epifluorescerende-methoden zijn beperkt in het bereik waarover axiale informatie kan worden verzameld, hoewel de recente vooruitgang in Fourier vliegtuig fase maskers ontwerp en adaptieve optiek breidt deze varieert tot 10 µm of meer31,32 , 33 , 34.

In tegenstelling, afhankelijk RT-3D-SPT niet is van het verwerven van een 3D-beeld-stack en het vinden van deeltjes na het feit. In plaats daarvan, real-time locatie-informatie wordt uitgepakt via aanspreekpunt detectoren en feedback wordt toegepast op effectief "vergrendelen" het deeltje in het focal volume van het objectief door het gebruik van een highspeed piëzo-elektrische fase. Hierdoor continue meting van de deeltjes van standpunt beperkt slechts door hoeveel fotonen kunnen worden verzameld. Deze methode kan bovendien spectrale ondervraging van het deeltje als het beweegt over lange afstanden. RT-3D-SPT feitelijk werken verwant aan een optische kracht-vrije val voor de nanoschaal objecten, waarin het deeltje is voortdurend gesondeerd en gemeten in real time zonder de behoefte aan grote laser bevoegdheden of optische dwingt. Gezien het feit dat RT-3D-SPT een middel voor continue ondervraging van snel diffusive objecten (maximaal 20 µm2/s)25,29 in drie dimensies op lage foton graaf tarieven20,29biedt, 35, dient het een venster in snelle of voorbijgaande biologische processen zoals intracellulaire vrachtvervoer, ligand-receptor binden en de extracellulaire dynamiek van één virionen. Op dit punt is de toepassing van de RT-3D-SPT echter beperkt tot het handjevol groepen werken om deze technologie verder te gaan.

Een barrière is de complexiteit van de optische indeling vereist door RT-3D-SPT methoden, die zijn gevarieerd. Voor de meeste methoden, wordt de optische feedback geleverd door een piëzo-elektrische fase. Als het deeltje maakt kleine bewegingen in X, Y, of Z, uitlezingen van aanspreekpunt detectoren zijn geconverteerd naar fout functies en gevoed met hoge snelheid naar een piëzo-elektrische nanopositioner, die in zijn beurt beweegt aan het tegengaan van de particle beweging, effectief monster vergrendelen in plaats ten opzichte van het objectief. Voor het meten van kleine positionele bewegingen in X, Y, en Z, ofwel meerdere detectoren (4 of 5 afhankelijk van de uitvoering)15,-18,21 of meerdere excitatie vlekken (2-4, de laagste van die kan worden toegepast als een Lock-in versterker wordt gebruikt voor het uitpakken van X en Y-positie met behulp van een roterende laser spot)25,28 worden toegepast. De overlapping van deze meerdere detectie en emissie vlekken bemoeilijken de systemen voor het uitlijnen en onderhouden.

Hierin presenteren wij een high-speed doel-locked 3D-SPT-methode met een vereenvoudigde optische ontwerp genaamd 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT maakt gebruik van een 2D-EOD en een TAG lens36,37,38 om dynamisch een plek gericht laser via het objectieve focal volume op een hoog tempo (50 kHz XY, 70 kHz Z). Het combineren van de laser focus positie en de aankomsttijd foton kunt van het deeltje 3D kunnen snel zelfs bij lage foton graaf tarieven worden verkregen. De 2D-EOD drijft de laser focus in een knight's tour patroon39 met een vierkante grootte van 1 x 1 µm in het X-Y vlak en de TAG-lens focus van de laser in axiale richting met een bereik van 2-4 µm. De positie van 3D deeltje wordt verkregen met een geoptimaliseerde positie schatting algoritme29,40 in 3D. De controle van de 3D dynamisch bewegende laser spot, foton geteld vanaf de lawine fotodiode (APD), real-time deeltje positie berekening, piëzo-elektrische stadium feedback en opname van de gegevens worden uitgevoerd op een veld programmable gate array (FPGA).In dit protocol, we beschrijven hoe het bouwen van een 3D-DyPLoT Microscoop stapsgewijze, met inbegrip van optische uitlijning, kalibratie met vaste deeltjes, en ten slotte gratis deeltje tracking. Als een demonstratie, werden 110 nm fluorescerende kralen voortdurend bijgehouden in water voor minuten per keer.

De hier beschreven methode is een ideale keuze voor elke toepassing waar het gewenst is een snel bewegende fluorescente sonde bij lage lichtniveaus, met inbegrip van virussen, nanodeeltjes en blaasjes zoals Endosomen continu te volgen. In tegenstelling tot de vorige methoden is er slechts een enkele excitatie en één detectie traject, uitlijning en onderhoud eenvoudig maken. Bovendien kunnen het grote detectie gebied dankzij deze Microscoop te halen gemakkelijk snel verspreiden van deeltjes, terwijl de mogelijkheid om bij te houden (tot 10 kHz) niveau laag signaal deze methode ideaal voor low-light toepassingen29 maakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. instellen van de lay-out en uitlijning

  1. Installatie en collimatie van de tracking excitatie laser
    1. Brengt de laser aan de optische tabel met behulp van een huis-gebouwde mount. Het onderstel is een eenvoudige aluminiumplaat met montage gaten voor het hoofd van de laser en de optische tabel. De laser moet stevig worden gekoppeld aan een metalen mount voor stabiliteit en warmteafvoer. Gebruik hiervoor een 488 nm solid state laser voor verlichting (Figuur 1), hoewel de golflengte kan worden geselecteerd om te passen bij een bepaalde fluorophore of experimenteren. Een kritieke factor is dat de golflengte van de laser past het werkbereik van de 2D-EOD, die wordt bepaald door de golf plaat tussen de twee leidschoepen voornamelijk (Figuur 1: W2). De 488 nm laser kan effectief de groene of gele fluorescente proteïne (GFP/YFP), die gemeenschappelijke fluorescerende tags in levende cellen experimenten prikkelen.
    2. De laser beam hoogte en richting met behulp van een paar diëlektrische spiegels aanpassen (Figuur 1: M). Zorg ervoor dat de laserstraal is parallel aan de optische tabel en passen het aan een geschikte hoogte.
      Opmerking: De hoogte moet worden gekozen op basis van het platform van de Microscoop. Deze hoogte moet worden gehandhaafd voor alle latere spiegels gebruikt in dit protocol, hoewel het niet expliciet zal worden vermeld.
    3. Collimate van de lichtbundel met een paar lenzen (Figuur 1: L1 en L2). De brandpuntsafstand van lenzen moet zorgvuldig gekozen worden om te voorkomen dat de plek van de laser wordt afgekapt door de opening van de 2D-EOD. Knippen is duidelijk door een verandering in de vorm van de laser beam na het passeren van de 2D-EOD. De kwaliteit van collimatie hier is zeer belangrijk omdat aberraties zal worden versterkt door latere lenzen en eventuele afwijkingen de prestaties van de 2D-EOD uitwijking verslechteren zal. In het ideale geval collimate de bundel door te focussen op de lichtbundel naar een punt ten minste 20 meter afstand.
  2. Plaats een gaatje (Figuur 1: PH) van passende omvang op de focus van de eerste collimatie lens (Figuur 1: L1).
    1. Kies een gepaste afmetingen pinhole. De grootte van het gaatje kan worden gekozen op basis van de volgende berekening:
      Equation 1
      Waar λ de golflengte van de laser, is f is de brandpuntsafstand van de eerste lens en D is de diameter van de input lichtbundel.
    2. Het gaatje in het werkgebied van een 3D-translatie zo monteren dat het precies op de focus van de eerste collimatie lens kan worden geplaatst.
    3. Pas de positie van de pinhole. Plaats een laser power meter na het gaatje en pas de positie van de pinhole in XYZ te maximaliseren van de uitlezing van de meter macht. Als een diffractie-ring wordt waargenomen, blokkeert u het met een iris voor de 2D-EOD geplaatst.
  3. Installatie van Glan-Thompson polarisator
    1. Zet de polarisator Glan-Thompson (Figuur 1: GP) na de tweede collimatie lens (Figuur 1: L2) de polarisatie van de laserstraal schoon te maken. Draaien van de polarisator om te zoeken naar maximale transmissie met de Energiemeter.
  4. Installatie van EODs
    1. Gebruik 2 EODs (Figuur 1: EOD1 & EOD2) om te doen afwijken van de laser in de X- en Y-richting. Maximaliseer de laser-overdracht door de yaw, de toonhoogte en de hoogte van elke EOD aanpassen.
    2. Hiermee lijnt u de twee EODs ten opzichte van elkaar met de markering van de uitlijning die door de fabrikant aan de kant van elke deflector.
    3. Een test patroon hebt toegepast op de controller van de 2D-EOD te inspecteren de output van de EOD. Dit kan via de FPGA hieronder beschreven of een eenvoudige sinusgolf geboden door een functiegenerator de knight's tour (Figuur 2). Voor de beste prestaties moet de uitwijking door elke deflector evenwijdig aan de X- of Y-richting van de piezo-nanopositioner. Deze richting wordt gedicteerd door de hoekige richting van de leidschoepen over de transmissie-as. Om te draaien de doorbuiging richting zonder te verplaatsen van de 2D-EOD, voegt u een duif prisma na de 2D-EOD aan het uitlijnen van de assen van de uitwijking aan de piezo nanopositioner assen.
  5. Installatie van half-golf plaat
    1. Plaats een half-golf-plaat (Figuur 1: W1) tussen de polarisator Glan-Thompson (Figuur 1: GP) en de 2D-EOD aan het uitlijnen van de binnenkomende laser beam polarisatie met de assen van de doorbuiging van de 2D-EOD. Plaats van een lang brandpunt lens (300 mm) na de 2D-EOD en plaats een sCMOS camera op de laser focus. Vervolgens zet de 2D-EOD voor het genereren van de knight's tour beschreven hieronder (Figuur 2). Draai de helft-golf plaat totdat een gelijkmatig vierkante laser distributie is waargenomen op de camera.
  6. Installatie van een lichtbundel gebruikten lens pair en relais lens paar
    1. Plaats een paar lenzen (Figuur 1: L3 en L4) na de 2D-EOD uit te breiden van de lichtbundel te vullen het terug diafragma van de lens doelstelling (Figuur 1: OL) en een ander paar van lenzen (Figuur 1: L5 en L6) om te relay het brandvlak aan de doelstelling van de Microscoop. Zitten zekere voor vertrek genoeg ruimte tussen deze twee paren van lenzen, zoals de TAG lens tussen hen in een later stadium zal worden geïnstalleerd.
  7. Installeer de dichroïde filter, de 10/90 balk splitter, gericht lens, APD, objectief en fluorescentie emissie filter Voltooi het detectie-traject.
    1. Het dichroïde filter installeren (Figuur 1: DC) aan de laser naar de objectief. Hiermee lijnt u de laser gaat dwars door het midden van de lens van de doelstelling met behulp van twee irissen op de boven- en onderkant van de buis van een lange lens.
    2. Installeer een 10/90 balk splitter (Figuur 1: BS) door die 10% van het licht voor imaging wordt weerspiegeld door een sCMOS camera (hieronder beschreven) en 90% van passeert aan de APD voor bijhouden.
    3. Hiermee lijnt u de APD. Richten de laser op een dekglaasje aan door het objectief. Gebruik de reflectie van het dekglaasje aan om alle downstream elementen uitlijnen door de invoering van een dekglaasje aan op de objectieve focus en controle van de intensiteit van de APD uitlezing. Na de balk splitter, installeren de APD lens gericht (Figuur 1: L7) gevolgd door de APD in het werkgebied van een 3D-translatie. Plaats de lens zodat de reflectie van de laser van de doelstelling door het midden van de lens gaat.
De APD positie kan worden geoptimaliseerd door het aanpassen van de 3D positie om te maximaliseren van de intensiteit van de reflectie van de laser op het dekglaasje aan. De APD-positie is op de optimale positie wanneer een verhuizing van de positie van de detector in elke gewenste richting de intensiteit vermindert.
  • Een longpass filter voor de emissie van de fluorescentie installeren (Figuur 1: F) vóór de balk splitter te verwijderen van het licht gereflecteerd en verspreid.
  • Installatie van de TAG-lens
    1. Plaatsen van de TAG lens tussen de twee paren van lenzen (tussen Figuur 1: L4 en L5) genoemde vóór als aangegeven in Figuur 1. Stel de yaw, de toonhoogte, de hoogte en de zijligging zo in dat de bundel loodrecht door de lens van het centrum van de TAG gaat.

    • 2. de monstervoorbereiding.

    1. Voorbereiding van vaste deeltjes
      1. Verdun 190 nm fluorescerende kralen naar ~ 5 × 108 kralen/mL in PBS. Voeg 400 µL kralen oplossing op een dekglaasje aan en mount op de monsterhouder van de piëzo-elektrische fase (het aantal kralen hangt af van de monsterhouder; de diameter van de monsterkamer houder gebruikt hier is 18 mm). Voor de kralen gebruikt hier, PBS zorgt ervoor dat de deeltjes te storten op het dekglaasje aan.
    2. Gratis bewegende deeltjes voorbereiding
      1. Verdun 110 nm fluorescerende kralen naar ~ 5 × 108 kralen/mL met DI water. Voeg 400 µL kralen oplossing op een dekglaasje aan en mount op de monsterhouder van de piëzo-elektrische fase.

    3. Optimaliseer bijhouden van Parameters

    1. Raster scan vaste deeltjes
      1. Een steekproef van vaste deeltjes zetten de Microscoop.
      2. Inschakelen van de laser, micropositioner controller, piëzo-controller voor nanopositioner, TAG lens controller en EOD-controller. Merk op dat de volgorde niet kritisch is. De piezo-nanopositioner in gesloten lus worden uitgevoerd.
      3. Raster scannen het monster in XYZ met behulp van een aangepaste software scanprogramma (Figuur S3, software beschikbaar op verzoek van de auteurs), die de 2D-EOD rijdt in een knight's tour (Figuur 2), verzamelt graven van de APD, rijdt de piezo nanopositioner, en positie berekening (Figuur S2). De stap-grootte is 40 nm en het scannen bereik is 2 µm.
        1. Om te plaatsen het dekglaasje aan op de focus van de doelstelling, de fluorescentie emissie filter verwijderen en gebruik de reflectie van de laser van het dekglaasje aan om te maximaliseren van de intensiteit van het signaal als een functie van de Z-positie van de micropositioner. Na het plaatsen van het monster op het brandvlak, filter plaatsen, terug de fluorescentie emissie.
        2. Open het scannerprogramma. Stel de scannen bereik en de stap-grootte door het getal in de 'start', 'finish' en 'stap' te typen. Stelt u eerst een groot scannen bereik en de stap-grootte te vinden van een deeltje (bijv, 10 x 10 µm bereik met 200 nm stap-grootte). Na het vinden van het deeltje, krimpen van het scannen bereik en stap verkleinen (bijv., 2 x 2 µm bereik met 100 nm stap-grootte). Klik op de knop 'scan' om het uitvoeren van een scan 3D raster om te zoeken naar de fluorescerende focus.
    2. TAG lens instellingen (Zie ook Figuur 3)
      1. Klik op de TAG software voor de controle van de lens. Klik achtereenvolgens op 'verbinden', 'inschakelen'.
      2. Als u de fase van de uitvoer van de trigger-signalen, is het nodig te wijzigen van de uitvoermodus voor de trigger. Wijzig eerst de modus van 'RGB' naar 'Multiplane' en wijzig het terug. Nu de fase kan worden veranderd (Figuur 3b).
      3. Instellen van de fase van de uitvoer als 0 °, 90 ° en 270 °. Terwijl alle drie fasen die betrekking hebben op de faseruimte kunnen worden gebruikt, deze drie zijn gevonden te werken goed empirisch (Figuur 3 c).
      4. Selecteer de 68.500 Hz frequentie-instelling.
      5. Om te zoeken naar de optimale frequentie is het vaak nodig om te veranderen van de frequentiebereik. Klik op 'Geavanceerd', 'instellen'. Wijziging van de ' Max. Freq(Hz)' van kolom 0 van 70.000 Hz tot 71,500 Hz. Dit kan worden aangepast aan wat frequentiebereik geschikt is. Klik op 'Bewaar kalibratie', 'Exit kalibratie' (figuur 3d).
      6. Om de nieuwe kalibratie effectieve, de resonantie overschakelen naar een andere frequentie (bijvoorbeeld, 189,150 Hz) en vervolgens overgeschakeld terug naar de 68.500 Hz frequentie-instelling (de 3e figuur).
      7. De amplitude geleidelijk veranderen naar 35%. Klik op 'Vergrendelen resonantie'. Nadat de frequentie is vergrendeld, klikt u op 'Ontgrendelen resonantie' (figuur 3e). De lens van de TAG is klaar nu te gebruiken.
      8. Kalibreren, wijzigt u de parameters die worden gebruikt in de schatting te maken van de geschatte positie gelijk is aan het echte standpunt, zoals weergegeven in figuur 4e, f. ingangsbereik het scannen van x, y, en z en klik op de 'scan' knop voor het scannen van het monster in XYZ te bewegen de deeltjes via de bewegende laser plek. De positie van het deeltje moet het wordt gescand door de laser focus eens met het standpunt van de geschatte deeltje bepaald door de positie schatting lus (Figuur S1). De relatie tussen de geschatte positie of echte (Figuur 4 d) kan worden geëxtraheerd uit geschatte positie beelden (figuur 4f). Als de standpunten niet instemt, wijzig de waarden van laser positie (ck) gebruikt in de positie schatting lus (Figuur S1).
      9. Uitlijnen van TAG objectief
        1. Als de TAG lens-controller uitgeschakeld is, gescande de raster afbeeldingen van het (hieronder beschreven) deeltje, genomen vóór het installeren van TAG lens en na installeren TAG lens er identiek ziet. Vervolgens uitvoeren fluorescerende deeltje Z stapel scannen door het bewegen van de doelstelling met de z-nanopositioner om af te stemmen op de positie en hoek van TAG lens (Figuur 4). Tune de positie van de TAG lens zolang er geen geen drift in de beelden van de deeltjes in de XY-oppervlakte langs de Z-richting, die wordt bereikt wanneer er geen verandering in de XY-positie van het deeltje als een functie van de positie op de Z (Figuur 4 d is). De trackingsysteem is klaar voor gebruik na uitlijning van de TAG-lens.
    3. Installatie van sCMOS camera voor toezicht op deeltje
      1. Installeer een sCMOS camera om te visualiseren deeltjes terwijl ze worden bijgehouden. Installeer de sCMOS pas nadat het alle onderdelen van de tracking-systeem zijn geïnstalleerd en geoptimaliseerd.
    Laad een vaste fluorescerende deeltje monster naar de Microscoop en tracking programma één deeltje in het objectieve focal volume vergrendelen uit te voeren. Vervolgens installeert u de 100 mm brandpuntsafstand lens (Figuur 1: L8) en sCMOS. De sCMOS positie aanpassen zodat het beeld van het deeltje is gericht op de kleinste en de slimste plek.

    4. real-time 3D volgen van het verspreiden van vrije nanodeeltjes

    1. Zet de 110 nm vrij bewegen deeltje monster op de Microscoop.
    2. Inschakelen van laser, micro-positioner controller, piëzo-controller voor nanopositioner, TAG lens controller en EOD-controller. De piezo-nanopositioner in open lus worden uitgevoerd. Instellen van de software TAG objectief volgens stap 3.2.
    3. Open en voer de tracking-software (beschikbaar op verzoek van de auteurs). Stel de positie schatting parameters geoptimaliseerde standaardwaarden, die werden gevonden in sectie 3.
    4. Om te plaatsen het dekglaasje aan op de focus van de doelstelling, de fluorescentie emissie filter verwijderen en gebruik de reflectie van de laser van het dekglaasje aan om te maximaliseren van de intensiteit van het signaal als een functie van de Z-positie van de micropositioner. Na het vinden van het dekglaasje aan, de focus positie 15 µm om zich te concentreren op de laser weg van het dekglaasje aan en in de oplossing te verhogen. Terug de fluorescentie emissie filter plaatsen.
    5. Stel de integrale controle-constanten zijn. De integrale controle-constanten zijn instelbaar beginnen op een lage waarde en langzaam verhogen totdat oscillaties kunnen worden gezien in het deeltje van positie uitlezingen. Zodra oscillaties worden waargenomen, stel de integrale controle-constanten zijn op 80% van de waarde die de trillingen veroorzaakt. Typische waarden zullen rond 0,012 voor de XY 'integraal gewin' en 0.004 voor de Z 'integraal winst'.
    6. De tracking van de drempelwaarden in 'Track drempel' en 'Track Minimum' en het bijhouden van experiment starten door te klikken op 'Zoeken' en 'Auto Track'. De drempel voor de afsluitende tracking ligt iets hoger dan het achtergrondniveau en de drempel voor het genereren van tracking is ongeveer twee keer hoger dan de achtergrond. Hier, de drempel voor het genereren van tracking is 3 kHz en de drempel voor het einde van het traject is 1,5 kHz.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Vaste deeltjes scannen (Figuur 4) en vrij verspreiden 110 nm fluorescerende deeltje bijhouden (Figuur 5) werden uitgevoerd volgens de bovenstaande protocol. Het scannen van de deeltjes werd uitgevoerd door het bewegen van de piëzo-elektrische nanopositioner en bin fotonen, terwijl tegelijkertijd de berekening van het deeltje van naar schatting positie op elk punt in de scan. Het scannen afbeelding toont een vierkant van zelfs intensiteit (figuur 4a) en de geschatte posities tonen een lineaire relatie met de echte positie van het deeltje over een 1 × 1 × 2 µm bereik in x, y- en z-richting (figuur 4b--f).

    Om aan te tonen real-time tracking, werden 110 nm fluorescerende deeltjes bijgehouden in water door 3D-DyPLoT (figuur 5a, b). De mean square verplaatsing (MSD) analyse toont een typische lineair gedrag kenmerkend voor de Brownse beweging (Figuur 5 c). MSD analyse van 30 trajecten bleek een hydrodynamische middendiameter van 110 nm, in een goede overeenkomst met de specificatie van de fabrikanten voor de grootte van de fluorescerende nanodeeltjes worden bijgehouden (Figuur 5 d). Daarnaast film 1 toont de real-time piëzo-elektrische nanopositioner uitlezingen en gesynchroniseerd sCMOS beelden voor een 2 min lang traject van een vrij diffusing 110 nm fluorescerende deeltje.

    Naast het kunnen bijhouden met hoge snelheid, kunnen langzaam bewegende deeltjes worden gelokaliseerd met hoge precisie. Figuur 6a - d wordt de toepassing van het systeem van de 3D-DyPLoT aan vaste deeltjes met behulp van dezelfde feedback parameters zoals gebruikt voor hoge snelheden bijhouden, waaruit een precisie van 17,6 26.4 en 53,4 nm in X, Y, en Z, respectievelijk met foton graaf tarief van 105. Figuur 6 sexies - h toont de precisie onder controle van de feedback verminderd met een factor 10, doeltreffende swapping snelheid voor precisie en exposeren een precisie van 6.5, 8.3 en 10.5 nm in X, Y en Z, respectievelijk.

    Figure 1
    Figuur 1. Schematische van 3D-tracking systeem. De 2D-EOD (EOD1 & EOD2) en de lens van de TAG (TAG) afbuigen de laser langs de XY en Z richtingen, respectievelijk. De APD (APD) gebruikt voor het verzamelen van fluorescentie fotonen, die worden verzonden naar de FPGA (FPGA). FPGA wordt gebruikt voor de positie berekening algoritme, het foton tellen, de controle van de 2D-EOD, alsmede de controle en de uitlezing van piëzo-elektrische nanopositioner (NSxy en NZz). Andere onderdelen in de afbeelding het label: spiegels (M); lenzen (L #); Pinhole (PH); Glan-Thompson polarisator (GP); half-golf plaat (W1); dichroïde filter (DC); objectief (OL, 100 X nb = 1,49); fluorescentie emissie filter (F); balk splitter (BS); XY micropositioner fase (MSxy); Z micropositioner fase (MSz). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 2
    Figuur 2. Coördinaten van de knight's tour uitgevoerd in 3D-DyPLoT. As 1 en as 2 moeten worden uitgelijnd langs de X- of Y-as door de juiste uitlijning van de 2D-EOD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 3
    Figuur 3. TAG lens software instellingen. Zie punt 4.2 TAG lens instellingen voor meer informatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 4
    Figuur 4. Deeltje scannen en positie schatting. (a) scannen afbeelding van 190 nm TL kralen met 2D-EOD rijden de laser in een 1 × 1 µm vierkante knight's tour patroon. Intensiteit van de fluorescentie wordt aangeduid met kleur. Eenheid: kHz. (b) schatting van xk, van het deeltje positie ten opzichte van het middelpunt van de 2D-EOD scannen in micrometers. De kleur in de b, cen d geeft de geschatte positie. Eenheid: µm. (c) schatting van de yk in micrometers. (d) schatting van zk, van het deeltje positie ten opzichte van de axiale middelpunt van de lens TAG scannen in micrometers. (e) geschat deeltje positie yk als een functie van de fase positie gemiddeld over het hele raster van (c). Merk op dat de positie van de geschatte deeltje verworven van de positie schatting algoritme (yk) is het eens met het echte standpunt. (f) geschat deeltje positie zk als een functie van de fase positie gemiddeld over het hele raster van (d). De geschatte positie toont een lineaire relatie met deeltje van echte standpunt over 1 × 1 × 2 µm bereik in X-, Y- en Z-richting. Merk op dat de positie van de geschatte deeltje verworven van de positie schatting algoritme (zk) is het eens met het echte standpunt. De geschatte positie toont een lineaire relatie met deeltje van echte standpunt over een 1 × 1 × 2 µm bereik in X, Y, en Z-richting. De witte schaal/omlaagbalken in (een-c) vertegenwoordigen 500 nm en de zwarte schaal in (d) balk 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 5
    Figuur 5.Het bijhouden van 110 nm fluorescerende deeltjes in water met 3D-DyPLOT. (een) 3D traject van een vrij diffusing 110 nm fluorescerende nanoparticle in water. (b) TL intensiteit als functie van de tijd voor het traject in (een). (c) MSD van het traject in (een). De blauwe lijn is de gemeten MSD terwijl de gestippelde rode lijn is de beste fit lijn van lineaire regressie. (d) MSD analyse 30 gevaar opleverende, tonen een gemiddelde hydrodynamische diameter van 110 nm, in een goede overeenkomst met de grootte van de fluorescerende nanodeeltjes worden bijgehouden. De diameter van de deeltjes werd berekend aan de hand van de relatie van Stokes-Einstein. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 6
    Figuur 6. Precisie van vaste deeltjes bijhouden. (een) A vast deeltje wordt bijgehouden door 3D-DyPLoT op verschillende graaf tarieven. De precisie is (b) 17,6 nm in X, (c) 26.4 nm in Y, en (d) 53,4 nm in Z in een tempo van de emissie van 100 kHz. (e) wanneer het sonderen van tragere processen, de controle van de feedback-constante (Kik) kan worden verminderd door een factor 10 te vergroten van precisie. Onder de controle van deze verlaagde feedback is de precisie (f) 6.5 nm in X, (g) 8.3 nm in Y en (h) 10.5 nm in Z in een tempo van de emissie van 100 kHz. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figuur S1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

    S2 figuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.

    Figuur S3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

    Aanvullende informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hoewel vele verscheidenheden van 3D één deeltje bijhouden methoden naar voren zijn gekomen in de afgelopen jaren, is robuuste real-time tracking van 3D diffusie van de hoge snelheid bij lage foton graaf tarieven met een eenvoudige opstelling nog steeds een uitdaging, die de toepassing ervan op belangrijke biologische beperkt problemen. De 3D-DyPLoT methode beschreven in deze protocoladressen deze uitdagingen in een verschillende manieren. Ten eerste zijn de excitatie en detectie trajecten vereenvoudigd sterk ten opzichte van andere implementaties waardoor uitlijning, eenvoudig en robuust. Ten tweede, de bewegende laser plek en positie schatting algoritme schattingen op te leveren exacte positie voor de feedback lus, de feedback stabieler te maken. Ten derde, de daadwerkelijk grote registratiebereik (1 x 1 x 4 µm) van de dynamisch bewegende laser spot zorgt voor bijhouden van snel bewegende deeltjes. Om te zien waarom dit grote detectie gebied is van cruciaal belang, is het belangrijk om te overwegen de intrinsieke reactietijd van de piëzo-elektrische nanopositioner. Hoge snelheid piëzo-elektrische stadia hebben resonanties op voorschrift van 1 kHz, de reactietijd worden over de volgorde van 1 ms. In 1 ms, een 100 nm nanoparticle met een coëfficiënt van de diffusie van 4 µm2/s te beperken, zal verspreiden op gemiddelde 90 nm vanuit het midden van de diffractie-li mited detectie volume. Dit is alleen de gemiddelde verplaatsing en echt willekeurige beweging stappen veel groter dan dit, wat leidt tot het deeltje verlaten het focal volume en eindigt de huidige traject zal vertonen. De situatie is zelfs slechter voor kleinere deeltjes, waar steeds grotere thermische diffusive stappen leiden tot verlies van tracking. Het effectief grote detectie gebied zorgt voor de tracking-systeem om te overwinnen van intrinsieke piëzo-elektrische fase lag en herstellen van grote diffusive sprongen in de positie van het deeltje, verhoging van de algehele robuustheid van het mechanisme voor het bijhouden. Tot slot, het grote scangebied kan het systeem gemakkelijk te halen naar nieuwe deeltjes, waardoor voor opeenvolgende trajecten te snel verwerven en grote gegevenssets samengesteld.

    De gebruiker moet houden in het achterhoofd zijn er enkele kritische stappen. Ten eerste, de aanpassing van zowel de 2D-EOD en de TAG-lens staan kritisch tegenover. Beide moeten goed worden uitgelijnd zodat de optimale precisie te verkrijgen. Ten tweede, de parameters die worden gebruikt in de schatting van de positie in de vaste deeltjes scannen stap goed moeten worden gekalibreerd (Zie Figuur 4). De geschatte deeltje positie moet overeenkomt met de positie van de particle overeenkomt met het midden van de laser scanbereik. Tot slot, de feedback integraal-constanten zijn (Kik) erop gericht zijn zorgvuldig, beginnend met een geringe waarde en speedramp tot trillingen in acht worden genomen, dan back-naar ongeveer 80% van deze waarde.

    Er zijn een paar aanvullende opmerkingen over 3D-DyPLoT in mening afhankelijk van de gewenste toepassing te houden. Hoewel de geoptimaliseerde positie schatting is ontworpen voor gebruik met Brownse beweging, is het ook goed geschikt naar directionele beweging. Het algoritme kan rechtstreeks worden toegepast op elke vorm van beweging omdat het alleen de positie onzekerheid die Gaussiaans, niet de echte deeltje positie wordt uitgegaan. Voor gevallen waar permanente lineaire beweging wordt verwacht, een aanvullende termijn kan worden toegevoegd aan de term voorspelling in de positie schatting algoritme (Zie vergelijking 3 in de Aanvullendeinformatie).

    De selectie van de parameters voor de 2D-EOD en TAG moet zorgvuldig worden overwogen bij het instellen van de 3D-DyPLoT. Van bijzonder belang is de bin gebruikte tijd voor de knight's tour door de 2D-EOD gescand. In een ideaal scenario zou de knight's tour worden gesynchroniseerd met de periode van de lens van de TAG om ervoor te zorgen efficiënte bemonstering. Het is echter cruciaal voor het overwegen van de reactietijd van de 2D-EOD te voeren veranderingen in spanning. Voor de eenheid die hier wordt gebruikt, is er een tijd van de reactie van 2-3-µs, nadat de spanning wordt toegepast voordat de gewenste plek is bereikt. Tijde 20 µs bin is dit ongeveer 10-15% van de tijd van de collectie. Verminderen van de tijd, zodat deze overeenkomt met de TAG lens periode van ~ 14 µs verhoogt de Fractie van de tijd van de bin, oftewel de vertragingstijd van de 2D-EOD. Dit leidt tot onjuiste waarden voor de positie van de laser of onjuiste ramingen.

    Een andere factor voor de experimentator in gedachten te houden is temporele resolutie. Terwijl de hier getoonde gegevens worden verzameld op een gegevenssnelheid van 100 kHz, is het is dat de ultieme temporele resolutie uiteindelijk gedefinieerd waarmee gegevens worden gebruikt voor de meting van positie. Als de uitlezing van de nanopositioner wordt gebruikt als de positie van de particle (Figuur 6), zal de temporele resolutie afhangen van de waarde van de constante integraal controle. Bijvoorbeeld, voor het integraal besturingselement weergegeven in Figuur 6a-d, de fase-reactie is op voorschrift van 1 ms, terwijl voor dit laatste cijfer 6e-h, het is over de volgorde van 10 ms. Indien sneller temporele resolutie is gewenst, dan is de foton-door-foton resultaat van het algoritme van de schatting positie zal correleren met het foton graaf tarief. Bijvoorbeeld, een tarief van 10 kHz emissie levert 100 µs temporele resolutie en een tarief van 100 kHz emissie levert een temporele resolutie van 10 μs. Daarnaast sinds de precisie volgt een Equation 2 relatie41, de ruimtelijke en temporele precisie zijn gekoppeld. Dientengevolge, bepaalt de helderheid van de sonde de ruimtelijke en temporele precisie.

    In dit protocol beschreven we de setup, de lay-out en de uitlijning van een hoge snelheid real-time 3D één deeltje tracking methode die gebruik maakt van een 2D-EOD en TAG lens om dynamisch een gerichte laser plek om snelle deeltje positie schatting. We beschreven dan monster voorbereiding en parameter optimization werkwijze. 3D-DyPLoT biedt een robuuste en relatief eenvoudige manier om lock-on snel bewegende en nederigen diffusive deeltjes uitstoten. De eenvoudige optische lay-out kunt gemakkelijk naar de kant-poort van elke bestaande Microscoop stand worden toegevoegd, zodat het kan worden gecombineerd met imaging modules. Met dit protocol hopen we dat de RT-3D-SPT dat meer op grote schaal toegepast door meer onderzoekers worden kan inspelen op snel, drie dimensionale biologische processen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgments

    Dit werk werd gesteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health award onder nummer R35GM124868 en door Duke University.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
    Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
    TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
    XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
    Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
    Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
    Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
    APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
    Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
    Software National Instruments LabVIEW
    Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
    Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
    Pinhole ThorLabs P75S PH
    Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
    Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
    Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
    Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
    Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
    Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
    Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
    10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
    PBS Sigma D8537
    190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
    110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
    Coverslip Fisher Scientific 12-545A
    Powermeter Thorlabs PM100D
    CMOS Thorlabs DCC1545M
    Iris Thorlabs SM1D12D
    Microscope Mad City Labs RM21

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

    Tags

    Bioengineering kwestie 131 één deeltje bijhouden optische microscopie fluorescentie beeldvormingssystemen optische vallen optica 3D-tracking real-time deeltje bijhouden
    Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for… More

    Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter