Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

Det här protokollet beskriver kombinatoriska användningen av ChIP-seq, 4sU-seq, totalt RNA-seq och Ribosomen profilering för cellinjer och primära celler. Det gör det möjligt för spåra ändringar i transkriptionsfaktor bindande, de novo transkription, RNA bearbetning, omsättning och översättning över tiden, och visar samlade händelseförloppet i aktiverat och/eller snabbt föränderliga celler.

Abstract

Vid aktivering, celler snabbt ändrar sina funktionella program och därmed deras gen uttryck profil. Massiva förändringar i genuttryck uppstå, till exempel under celldifferentiering och morfogenes funktionella stimulering (t.ex. aktivering av immunceller), eller efter exponering för droger och andra faktorer från den lokala miljön. Beroende på stimulans och cellen kan sker dessa förändringar snabbt och på alla möjliga nivåer av genreglering. Visar alla molekylära processer cellkant svarar för en viss typ av stimulans/drogen är en av de svåraste uppgifterna i molekylärbiologi. Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör samtidig analys av flera lager av genreglering. Vi jämför, i synnerhet transkriptionsfaktor bindande (kromatin-immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq)), de novo transkription (4-thiouridine-sekvensering (4sU-seq)), mRNA bearbetning, och omsättningen samt översättning (Ribosomen profilering). Genom att kombinera dessa metoder, är det möjligt att visa en detaljerad och genome-wide handlingsväg.

Sekvensering nyligen transkriberade RNA rekommenderas speciellt när man analyserar snabbt anpassa eller ändra system, eftersom detta skildrar transkriptionell aktiviteten av alla gener under 4sU exponeringstiden (oavsett om de är upp- eller nedreglerade). Kombinatoriska användning av totala RNA-seq och Ribosomen profilering tillåter dessutom beräkning av RNA omsättning och översättning. Bioinformatiska analyser av hög genomströmning sekvensering resultat möjliggör många hjälpmedel för analys och tolkning av data. Den genererade data kan också spåra co-transcriptional och alternativ splitsning, bara för att nämna några möjliga utfall.

Den kombinerade metoden som beskrivs här kan användas för olika modellorganismer eller celltyper, inklusive primära celler. Dessutom vi tillhandahåller detaljerade protokoll för varje metod som används, inklusive kvalitetskontroller, och diskutera potentiella problem och fallgropar.

Introduction

Under de senaste åren har RNA-sekvensering (RNA-seq) blivit den standard verktyget för att analysera alla uttryckta RNAs inom en cell eller en organism1. För att förstå hela processen för celler anpassning som svar på en viss stimulus/medicin, är det dock nödvändigt att fullständigt bestämma alla underliggande processer, alltifrån mRNA transkription till bearbetning, omsättning och översättning. Kortsiktiga förändringar i RNA transkriptionen kan knappast mätas av totala RNAseq, eftersom ändringar av total-RNA beror på faktorer t.ex. RNA halveringstider och transkriptionell aktivitet, som är en dålig mall för reflekterande anpassning av celler för att miljöeffekter2,3. Faktiskt, en mängd nya sekvensering tekniker har utvecklats som gör en analys av de olika stegen i processen gen nr4 när de kombineras på rätt sätt. Det här protokollet beskriver hur man kombinerar några ganska enkelt tillämpliga sekvensering metoder som tillåter spårning regleringen av väsentliga lager av mRNA i ett jämförande sätt. För att analysera transkriptionell aktivitet, en mängd metoder har beskrivits, såsom Cap-analys av gen uttryck (CAGE)5, infödda töjning avskrift sekvensering (NET-seq)6och genome-wide nuclear kör (GRO-seq)7 , 8, och bromouridine-sekvensering (Bru-seq) samt 4-thiouridine-sekvensering (4sU-seq), som använder metaboliter som ingår i nyligen transkriberade RNA9,10, bara för att nämna några. Medan bur identifierar exakt transkription start platsen, NET-seq och GRO-seq leverera mer exakt information om läsning riktningar och 4sU-seq (vilket är den metod som beskrivs här) identifierar endast nyligen transkriberade RNA. Men 4sU-seq är mycket känsliga och kan appliceras i olika tidsramar att mäta kvantitativa transkriptionell verksamhet aktivt förändra celler, samt kvantitativa förändringar i mRNA bearbetning (vilket händer inom minuter)9, 11,12. 4sU-seq är dessutom perfekt att kombinera med RNA-seq att beräkna RNA omsättning priser för gener9. Transkriptionen av mRNA utförs av RNA-polymeras II (RNAPII), som i sin tur påverkas av en mängd faktorer, såsom transkriptionsfaktorer, Histon modifieringar och allmänna aktivatorer/kvinnoförtryckarna som kan även vara en del av den transkriptionell komplexa. För att testa hur många gen/arrangören/förstärkare regioner är bundna av en faktor, har ChIP-seq utvecklats, vilket är nu standard metod för detta ändamål, på grund av många kommersiellt tillgängliga antikroppar13. Men även om ChIPseq ger tydlig information om där reglera faktorer bind, avspeglar inte om det verkligen leder till förändringar i transkription14. Därför är utför ChIP-seq med 4sU-seq en idealisk kombination för sådana biologiska frågor. Reglering av genuttryck kan också inträffa i ett senare skede, eftersom mRNA och protein nivåer inte nödvändigtvis korrelerar15,16, som visar potentiellt betydande förordning på translationell eller post-translationella nivå, beroende på sammanhanget. I år 2011, ribosom profilering först hade kombinerats med RNA-seq och är nu vald analysmetod att kvantifiera förändringar som sker snabbt i protein, eftersom det finns fortfarande vissa känslighet gränser med masspektrometri17. Faktiskt, översättning priser erhålls från sådana metoder har visat sig leverera en relativt god uppskattning av förändringar i proteinnivåer (åtminstone mätt för långsiktiga förändringar) och tillåta en ännu mer detaljerad vy på processen för översättning, e.g. de bestämning av start-sida och alternativa översättning ramar17. Kombinatoriska användningen av alla fyra metoderna kan användas i steady-state mellan olika celltyper, eller i en tid-följetong experimentera i en snabbt föränderlig cell11. Denna användning ger en genome-wide översikt över förändringar i transkription faktorn bindning påverkar RNA transkriptionen, bearbetning och översättning.

Protocol

Alla metoder är i enlighet och överensstämmelse med Helmholtz Zentrum München institutionella, statliga och federala riktlinjerna.

1. beredning

  1. Gör en detaljerad plan av experimentella installationen inklusive en tidsplan, när du vill lägga till 4sU till cellodlingsmedium och när skörden cellerna för varje metod. Beroende på den biologiska frågan, noga överväga tidpunkter för prov ritning, 4sU-märkning tid och koncentration (tabell 1).
    Obs: Kontrollera effekterna av 4sU på cellernas viabilitet och betona svar i förväg (se ”Kontrollera optimal 4sU-märkning villkor” i representativa resultat och figur 1). Det rekommenderas att utföra en preliminär analys av varje metod med minst ett prov. Verifiera om kvalitet och mängd RNA/DNA räcker för djupsekvensering (se dedikerade delar av protokollet), och praktiken snabb men varsam hantering av celler under experimentet.
  2. Beräkna antalet celler som behövs för varje tidpunkt av varje metod (se tabell 2 för en grov uppskattning när du använder primära T-celler). Också överväga sekvensering färre prover av total-RNA än bara 4sU RNA (t.ex., bara för tid punkt översättning priser eller RNA omsättning bör beräknas). För att bekräfta och kontrollera betydelsen av resultaten (rekommenderas), skapa minst en biologisk replikera.
    Obs: Viktigt för alla metoder och på varandra följande tidpunkter, prover måste vara från samma start pool av celler. Minst en dedikerad forskare för varje metod rekommenderas.
  3. Förbered allt som behövs i förväg (t.ex., aliquoted 4sU, Kungliga Automobilklubben, däggdjur lyseringsbuffert och 1% formaldehyd). Efter tillägg av 4sU, Undvik att utsätta celler för starkt ljus, eftersom detta kan leda till crosslinking 4sU-märkt RNA till cellproteiner18.
  4. Poolen alla celler av intresse i en kolv strax före behandling (figur 2). Räkna cellerna (t.ex., med en hemocytometer) och använda det begärda beloppet för obehandlad kontroll av varje metod (Glöm inte att också märka den obehandlade kontrollen för 4sU-seq med 4sU). Behandla resterande celler och omedelbart dela det nödvändiga antalet celler för varje tidpunkt och metod. Hantera celler så snabbt som möjligt för att minimera stress på grund av förändringar i temperatur eller CO2 nivåer.
    Obs: till exempel prover tas 1 h, 2 h, 3 h efter behandling, då en fjärdedel av cellerna används för kontrollgrupp och tre fjärdedelar används för behandlade kontroll.

2. 4sU-märkning

Obs: Detta protokoll ändras från Rädle, et al. 19 se sina protokoll för ytterligare information om metabola märkning med 4sU. För alla metoder och på varandra följande tidpunkter, måste prover härröra från samma start pool av celler.

  1. Start av märkning
    1. Tina aliquoted 4sU strax före användning. Lägg till 4sU vid varje tidpunkt direkt till det medium som innehåller celler av intresse (se tabell 2 för rekommenderade T cell nummer, minst 60 µg RNA per tidpunkt), blanda försiktigt och placera tillbaka i inkubatorn. Kassera återstående 4sU (inte frysas).
    2. I slutet av märkning, samla celler (t.ex., cell skrapan) och centrifugera vid 330 x g under 5 minuter vid 4 ° C i polypropylene rören (som motstå höga g-krafter). Aspirera medium och tillsätt reagens för RNA isolering (≥1 mL per 3 x 106 celler, se material för rekommendation som du använder) till varje rör. Fullt återsuspendera pelleten (≥1 mL per 3 x 106 celler), inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT) och frysa prover vid-20 ° C. Prover kan förvaras vid-20 ° C under minst 1 månad.
      Varning: De reagens som används för RNA isolering är extremt farliga när komma i kontakt med hud eller ögon. Hantera dessa med omsorg och beakta säkerhetsanvisningarna.
  2. RNA förberedelse använda modifierad RNA isolering protokoll
    1. Lägg till 0,2 mL kloroform per 1 mL reagens för RNA isolering och blanda omsorgsfullt genom att skaka i 15 s. Fortsätt som nämns i protokollet metabola märkning (steg 1-12, 2. RNA förberedelse använda modifierad trizol protocol) från Rädle et al. 19
    2. Mäta RNA-koncentrationen (se Tabell för material), enligt tillverkarens instruktioner. Använda detta RNA för total RNA-seq samt (se steg 3. Total RNA-seq) eller förvaras vid-80 ° C i minst 1 månad.
  3. Thiol-specifika Biotinylation nyligen transkriberade RNA
    1. Börja med 30-80 µg totalt cellulära RNA. 60 µg RNA bör ge tillräckliga mängder nyligen transkriberade RNA.
    2. Förbereda märkning reaktion. Pipett i följande ordning (per μg RNA): 1 µL 10 x Biotinylation buffert, 7 µL RNA (innehållande 1 µg RNA späds i nuclease-fri H2O), och 2 µL biotin-HPDP (1 mg/mL). Lägg till biotin-HPDP senast och blanda omedelbart genom pipettering. Linda rören med aluminiumfolie att undvika exponering för ljus. Se diskussionen för ett alternativ till biotin-HPDP. Inkubera vid RT i 1,5 h med rotation.
    3. Lämpliga 2 mL centrifugrör (se Tabell för material) vid 15 000 x g i 2 min. Pipettera alla biotinylerade RNA i förväg spunnet 2 mL röret, tillsätt en motsvarande volym av kloroform och blanda kraftigt. Inkubera i 2-3 min tills faser börjar separera och bubblor börjar försvinna.
    4. Centrifugera vid 15 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. Försiktigt över övre vattenfasen till en ny tub.
    5. Upprepa steg 2.3.3. och 2.3.4. en gång. Lägga till 10% av volymen av NaCl (5 M) och en lika stor volym av isopropanol i vattenfasen. Centrifugera vid 20 000 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
    6. Lägga till en lika stor volym nylagade 75% etanol. Centrifugera vid 20.000 x g. Kassera supernatanten, snurra kort och ta bort återstående etanolen. Återsuspendera fullt ut i 30-100 µL H2O (Använd 1 µL H2O per 1 µg ingående RNA från steg 2.3.1) av pipett blandning.
    7. Kontrollera RNA integritet genom elektroforesisk analys, eller ta en alikvot och verifiera senare.
  4. Separation av nyligen transkriberas (märkt) och existerande (omärkt) RNA
    1. Ta bort paramagnetiska pärlor (se Tabell av material) från 4 ° C lagring och låt den stå i minst 30 min att föra dem till rumstemperatur. Värme 4sU tvätt buffert (3 mL per prov) till 65 ° C.
    2. Bered 100 mM Ditiotreitol (DTT). Väga DTT ultrafina skala och lägga till den nödvändiga mängden nuclease-gratis vatten. Alltid förbereda färska. Använd 200 µL per prov.
    3. Värm biotinylerade RNA prover (1 µg/µL) till 65 ° C i ca 10 min att denaturera och placera omedelbart på is. Tillsätt 100 µL streptividin pärlor till biotinylerade RNA och inkubera vid RT för 15 min med rotation.
    4. Placera en lämplig kolumn (se Tabell av material för rekommendationer) för varje prov till det magnetiska stativet och pre jämvikta varje kolumn med 1 mL rumstemperatur 4sU tvätt buffert.
      Anmärkning: Detta tar cirka 5-10 min. Om någon av kolumnerna inte initierat tömning efter 5 min, tryck försiktigt på toppen av kolonnen med en behandskade fingrar.
    5. Applicera en RNA/pärlor mix till mitten av varje kolumn. Kassera genomströmmande, såvida inte omärkt RNA måste återställas. I så fall samla genomströmmande och åtminstone den första tvätten. Utför återställningen av RNA som beskrivs av Rädle et al. (steg 1-7, 7. Återvinning av omärkta, obundna RNA)19.
    6. Tvätta tre gånger med 0,9 mL 4sU tvätt buffert (förvärmas till 65 ° C från steg 2.4.2.) och 0,9 mL RT 4sU tvätt buffert, respektive.
    7. Använda paramagnetiska pärlor för att återställa nyligen transkriberade RNA. Pipettera 400 µL av väl spridda RT paramagnetiska pärlor i en tub per prov och plats under varje kolumn. Eluera nyligen transkriberade RNA med 100 µL 100 mM DTT. Vänta i 3 min och utföra en andra eluering med 100 µL 100 mM DTT. (Valfritt: utföra eluering och återställning som beskrivs av Rädle et al.) 19
    8. Blanda nyligen transkriberade RNA/pärlor grundligt med pipett blanda 10 gånger och fortsätt enligt tillverkarens riktlinjer. Eluera RNA i 11 µL nuclease-fri H2O.Quantify RNA med hjälp av en lämplig fluorometer (se Tabell för material). RNA kan lagras vid-80 ° C i minst 1 månad.
      Obs: Nyligen transkriberade RNA kan användas för att förbereda cDNA bibliotek för nästa generations sekvensering (se Tabell av material för ett förslag på vilka kit att använda) eller ytterligare nedströms analyser. 100 - 500 ng RNA är tillräckliga för de flesta bibliotek förberedelser Kit (se diskussion).

3. totalt RNA-Seq

  1. Direkt ta RNA från 4sU märkt RNA efter RNA Tillredning via den modifierade reagensen för RNA isolering protokoll för total RNA-seq (se punkt 2.2.2.)
  2. För bibliotek förberedelse, späd en RNA alikvot till en slutlig koncentration på 50-100 ng / µL. Använd samma kit när det gäller bibliotek beredning av nyligen transkriberade RNA. 100 - 500 ng RNA är tillräckliga för de flesta bibliotek förberedelser kit.

4. ribosomer profilering

Observera: För alla metoder och på varandra följande tidpunkter skall prover från samma start pool av celler. För rekommendationer om vilka kit att använda, se Tabell för material.

  1. Förberedelse och isolering av Ribosomen skyddad fragment (RPFs):
    1. Använda lämpliga mängder celler för varje tidpunkt (se tabell 2 för rekommenderade T cell nummer). Behandla vidhäftande celler med Kungliga Automobilklubben som beskrivs i tillverkarens protokollet.
      Försiktighet: Kungliga Automobilklubben är mycket giftigt och kan orsaka mutationer. Undvik hudkontakt och inandning.
    2. Samla och pool icke - eller semi - adherent celler från varje gång peka till en polypropylen rör och justera slutliga koncentration till 1 x 106 celler per mL-specifika medium (t.ex., kompletterade RPMI för T-celler). Lägg till Kungliga Automobilklubben med en slutlig koncentration på 0,1 mg/mL, blanda genom att vända den polypropylen rör och inkubera i 1 min. Centrifugera celler för 5 min på 330 x g vid 4 ° C. Aspirera medium och tvätta cellerna med minst 10 mL PBS kompletteras med Kungliga Automobilklubben (slutlig koncentration på 0,1 mg/mL).
    3. Centrifugera celler för 5 min på 330 x g vid 4 ° C. Aspirera medium och tillsätt 100 µL däggdjursceller lyseringsbuffert per 10 x 106 celler. Blanda genom pipettering och utvisa genom en steril 22 25 gauge nål att lysera celler helt.
    4. Överföra cellen lysate till en förhandskyld 1,5 mL tub. Inkubera i 10 min på is med periodiska inversioner. Centrifugera i 10 min vid 20 000 x g vid 4 ° C att klargöra den lysate. Överför supernatanten till en förhandskyld 1,5 mL tub.
    5. Förbereda en 1:10 utspädning av den lysate med nuclease-gratis vatten och post en A260läsning med en spektrofotometer. Använda nuclease-fritt vatten som en tom och en 1:10 utspädning av däggdjursceller lyseringsbuffert som standard. Beräkna A260/ml koncentrationen av den lysate enligt följande ekvation:
      (En260 cell lysate - en260 däggdjur lyseringsbuffert) x 10 utspädningsfaktorn = en260/ml
    6. Skapa 200 µL portioner av den lysate på is och fortsätta med nukleotid.
      Obs: Du kan också förbereda en 100 µL alikvotens för total-RNA, tillsätt 10 µL 10% SDS och blanda. Förvaras vid 4 ° C och fortsätt med 4.3.2. Använda total-RNA från 4sU-märkt RNA rekommenderas (se steg 3. Total RNA-seq).
  2. Ribosomen Footprints
    1. Utföra nukleotid omedelbart utan att frysa den lysate. Lägg till 7,5 enheter av nuclease (ingår i rekommenderade kit) för varje A260 av lysat. Till exempel: 80 A260/ml lysat x 0,2 mL lysat x 7,5 U/A260nuclease = 120 U nuclease.
      Obs: Titrera alternativt nuclease för matsmältningen som beskrivs av tillverkaren.
    2. Inkubera nuclease reaktionen för 45 min på RT med mild blandning. Frysa 200 µL portioner av den lysate med flytande kväve och förvaras vid-80 ° C, eller stoppa nuclease reaktionen genom att lägga till 15 µL RNase inhibitor varje 200 µL alikvotens och fortsätta med steg 4.3.2.
  3. Rening av RPFs
    1. Frigöra ett prov av nuclease rötas RPFs och lägga till 15 µL RNase inhibitor. Hålla proverna på is.
    2. Rena RPFs enligt tillverkarens protokollet (kolumn rening rekommenderas) och mäta RNA-koncentrationen på en spektrofotometer.
  4. rRNA utarmning
    1. Använd 5 µg av renat RPFs för rRNA utarmning.
    2. Följ tillverkarens protokoll (steg 1-2, primära rRNA utarmning) för rRNA utarmning. Åtgärd RNA-koncentrationen av rRNA utarmat RPFs på en spektrofotometer.
  5. Sidan rening av RPFs
    1. Använd 500 ng av rRNA utarmat RPFs för sida rening.
    2. Förbereda RNA kontroll, prover och stege för sida rening. Blanda 5 µL RNA kontroll och 5 µL denatureringen gel lastning färgämne i 0,5 mL mikrocentrifug rör. Blanda 10 µL av varje RPF med 10 µL denatureringen gel lastning, respektive. Förbereda en stege alikvotens (4 µL 20/100 stege, 1 µL nuclease-gratis vatten och 5 µL denatureringen gel lastning färgämne). Den laddas mellan varje prov och kontroll för att förhindra korsningskontamination.
    3. Denaturera prover och stege genom inkubation vid 95 ° C i 5 min och placera omedelbart på is. Ladda 20 µL av varje prov (alternativt ladda 10 µL och frysa resterande prover vid 20 ° C) åtskilda av 10 µL av beredda stege på en 12% eller 15% urea-polyakrylamidgel. Ladda 10 µL av RNA kontroll. Kör gelen tills bromofenolblått bandet når botten av gelen (180 V, ~ 70 min) (figur 3).
    4. Fläcken gelen enligt tillverkarens protokollet vid 4 ° C. Använd ett mörkt-fält-transilluminator som avger blått ljus för att visualisera RNA. Punktskatt gel skivor för varje prov som motsvarar ~ 28 och 30 nt i längd. Ta RNA kontroll som referens och punktskatt det.
      Obs: RPFs är knappt synliga. Punktskatt skivor på storleken anges med kontrollen RNA - innehållande två oligos 28 och 30 NT i längd - även om proverna inte är synliga.
    5. Punktera ett hål i botten av 0,5 mL mikrocentrifugrör med en steril 20 gauge nål. Över varje gel-skiva till en separat slang och plats utjämnade rören i en 1,5 mL tub. Centrifugera under 2 minuter vid 12,000 x g. Upprepa centrifugering om gel skivor inte är helt strimla i 1,5 mL röret.
    6. Eluera RNA från störd gel skivor med 400 µL nuclease-gratis vatten, 40 µL ammoniumacetat (5 M) och 2 µL SDS (10%) varje övernattning vid 4 ° C.
    7. Överföra suspensionen till 1,5 mL filter tubes (tillhandahålls med rekommenderade kit) med 1 mL pipett spets (wide-bore tip eller self-made 1 mL spets med skurna änden). Centrifugera under 3 minuter vid 2000 x g att separera elueras RNA från gel skivor. Försiktigt Pipettera aqueous lösning i en 1,5 mL tub. Tillsätt 2 µL glykogen (tillhandahålls med rekommenderade kit) och 700 µL 100% isopropanol och butik vid-20 ° C i minst 1 h.
    8. Centrifugera vid 4 ° C i 20 min på 13.000 x g. Kassera supernatanten. Tvätta pelleten med pre kylda nylagade 80% etanol vid 4 ° C i 10 min på 13.000 x g. Kassera supernatanten och lufttorka. Återsuspendera varje prov i 20 µL och kontrollen RNA i 8 µL nuclease-gratis vatten. Förvaras vid-20 ° C om det behövs.
  6. Fragmentering, slutet reparation, 3' adapter ligatur, omvänd Transkription
    1. Utför proceduren som beskrivs av tillverkarens protokollet (fragmentering och slutet reparation, 3' adapter ligering och omvänd Transkription).
  7. Sidan rening av cDNA
    1. Förbereda prover, RNA kontroll och stege för sida rening: Mix 10 µL av varje prov och RNA kontroll med 10 µL denatureringen gel lastning dye, respektive. Förbereda en stege alikvotens (4 µL 20/100 stege, 1 µL nuclease-gratis vatten, 5 µL denatureringen gel lastning färgämne). Den laddas mellan varje prov och kontroll för att förhindra korsningskontamination.
    2. Denaturera prover och stege genom inkubation vid 95 ° C i 5 min och placera omedelbart på is. Ladda 20 µL av varje prov (alternativt ladda 10 µL och frysa resterande prover vid 20 ° C) åtskilda av 10 µL av beredda stege på en 10% polyakrylamid/7 - 8 M urea/TBE gel. Ladda 10 µL av RNA kontroll. Kör gelen tills bromofenolblått migrerar helt ur gelen (180 V, ~ 60 min).
    3. Fläcken gelen enligt tillverkarens protokollet vid 4 ° C. Använd ett mörkt-fält-transilluminator som avger blått ljus för att visualisera RNA och punktskatt gel skivor för varje prov som motsvarar ~ 70-80 nt.
    4. Fortsätt som beskrivet i steg 4.5.5 - 4.5.8 och resuspendera varje prov i 10 µL nuclease-gratis vatten.
  8. cDNA Circularization
    1. Förbereda tillräckligt circularization master mix för alla reaktioner genom att kombinera följande reagenser för varje prov på is: 4.0 µL Circularization reaktionsblandning, 2.0 µL ATP, 2.0 µL MnCl2och 2.0 µL Ligase.
    2. Tillsätt 10 µL huvudmixen i varje prov. Blanda försiktigt och centrifugera kort. Inkubera prover vid 60 ° C under 2 h. omedelbart plats prover på is.
  9. PCR-amplifiering
    1. Följ tillverkarens protokoll (steg 1-3, PCR-amplifiering) för PCR-amplifiering. Använda 4 µL av circularized cDNA för förstärkning med 9 PCR cykler för primär T-celler, för att uppnå bästa resultat.
    2. Rena bibliotek och kontrollera deras storleksfördelning, enligt tillverkarens protokollet (steg 4-8, PCR-amplifiering). Den förväntade storleken på förstärkta biblioteket är 140-160 bp (se figur 4).
    3. För sekvensering bibliotek, se tillverkarens protokollet och sekvensering anläggningen för ytterligare vägledning.

5. chIP-Seq

Obs: Detta protokoll ändras från Blecher-Gonen, et al. 14 hänvisar till sina protokoll för ytterligare information om ChIP-följande punkter För alla metoder och på varandra följande tidpunkter måste prover från samma start pool av celler.

  1. Crosslinking och skörd cellerna
    1. Crosslink lämpligt antal celler (se tabell 2 för rekommenderade T cell nummer) för varje tidpunkt med en slutlig koncentration av 1% formaldehyd i ett cellspecific medium (t.ex., kompletterade RPMI för T-celler) i 10 min i rumstemperatur med skonsam gunga. Stoppa den crosslinking reaktionen genom tillsats av glycin till en slutlig koncentration av 0,125 M.
    2. Centrifugera celler på 330 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna i iskall PBS. Upprepa steg 5.1.2 två gånger och frysa cell pellets vid-80 ° C. Frysta pellets kan lagras i minst 6 månader.
  2. Cell Lysis och ultraljudsbehandling
    Obs: Under alla cell lysis och ultraljudsbehandling steg, prover måste hållas på is eller vid 4 ° C att minimera crosslink återföring och protein nedbrytning.
    1. Återsuspendera cell pellets i 1 mL iskallt cell lysisbuffert med nyligen tillagda proteashämmare att isolera atomkärnor (Lägg fosfatas-hämmare alternativt). Inkubera i 10 min på is och centrifugera vid 2600 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
    2. Aspirera supernatanten och återsuspendera atomkärnor pelleten i 1 mL iskallt atomkärnor lyseringsbuffert med nyligen tillagda proteashämmare (valfritt: Lägg till fosfatas-hämmare). Inkubera i 10 min på is. Sonikera cellerna för att generera en genomsnittlig DNA storlek bråkdel av 0,2 - 1,0 kb (se figur 5).
      Obs: Ultraljudsbehandling villkor behöver optimeras enligt celltypen och ytterligare villkor (t.ex., mobilnummer, volym och buffert). För primär T-celler rekommenderas ultraljudsbehandling för 20-25 cykler (se material för detaljerad beskrivning).
    3. Ta en 20-50 µL alikvotens klippt kromatin och värme i 10 min vid 95 ° C och 1000 rpm skakar för att utföra en bakåt crosslink och kontrollera kromatin storlek. Tillsätt 2 – 5 µL proteinas K och inkubera i 20 min vid 56 ° C och 1000 rpm skakar. Utföra Värmeinaktivering för 10 min vid 95 ° C och 1000 rpm skakar. Rena kromatin med en lämplig kit (se Tabell för material). Kontrollera kromatin storlek på en 1% agarosgel och använda 100 bp Plus markör.
    4. Centrifugera klippt kromatin med ett medelvärde DNA storlek bråkdel av 0,2 - 1,0 kb för 10 min vid 20 000 x g och 4 ° C för att pellets olösliga kromatin och skräp. Överför supernatanten till en ny tub och hålla på is.
    5. Håll 5-10% av sonicated kromatin som indata. Frysas vid-20 ° C (används i steg 5.5.2).
  3. Par antikropp till pärlor
    1. Par 10 µg antikropp (t.ex., anti-RNA Pol II; anti-Histon H3K36me3) i 220 µL PBS (med 0,5% BSA och 0,5% Tween-20) till 80 µL superparamagnetiska pärlor kopplad till G-proteinet (se Tabell för material) för minst 1 h i rumstemperatur med rotation.
    2. Placera rören på en magnet. Vänta tills alla pärlor är bundna till magneten och avlägsna supernatanten. Ytterligare block med 6 µL sonicated lax spermier DNA i PBS (med 0,5% BSA och 0,5% Tween-20) under 30 minuter vid rumstemperatur med rotation.
    3. Placera rören på en magnet. Vänta tills alla pärlor är bundna till magneten och ta bort klara supernatanten. Tvätta pärlor med ChIP IP buffert tre gånger.
  4. Kromatin Immunoprecipitation
    1. Späd kromatin till 1 mL totalvolym atomkärnor lyseringsbuffert med nyligen tillagda proteashämmare (alternativt Lägg fosfatas-hämmare). Lägg till ChIP IP-buffert med nyligen tillagda proteashämmare (alternativt Lägg fosfatas-hämmare) till en slutlig volym av 3 mL. Hålla på is eller vid 4 ° C medan antikroppen är kopplat till pärlorna.
    2. Lägga till utspädda kromatin till antikroppen tillsammans pärlor från steg 5.3.3 och inkubera över natten vid 4 ° C med varsam rotering.
    3. Tvätta med följande buffertar (1 mL varje, se Tabell för material) i rumstemperatur i 5 min med rotation, placera rören tillbaka på magneten och ta bort supernatanten: tvätta buffert jag tvätta buffert II, tvätta buffert III och 2 x TE pH 8,0 respektive.
    4. Kassera supernatanten och lufttorka för ~ 5 min.
  5. Omvänd crosslinking
    1. Ta prover från magneten. Tillsätt 50 µL eluering buffert och blanda genom pipettering för att eluera protein-DNA komplex från pärlorna.
    2. Inkludera ingående provexemplaren från detta steg framåt. Lägg till eluering buffert för att mata in provexemplaren för en slutlig volym av 50 µL (att hålla buffert sammansättning liknar ChIP proverna) och bearbeta tillsammans med ChIP proverna.
    3. Blanda 3 µL av eluering buffert och 2 µL av RNase (DNAS gratis). Tillsätt 5 µL av mixen till varje prov och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
    4. Blanda 2,5 µL proteinas K, 1 µL glykogen och 1,5 µL eluering buffert per prov. Tillsätt 5 µL av mixen till varje prov (1 U proteinas K och 20 µg glykogen per prov) och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
    5. Inkubera proverna vid 65 ° C över natten (minst 4 tim) med skakar för att utföra omvänd crosslinking.
    6. Placera rören på magneten för minst 30 s och överför supernatanten till en ny tub. Prover kan frysas vid-20 ° C i upp till 12 månader.
  6. DNA-rening
    1. Tillsätt 140 µL väl spridda paramagnetiska pärlor i 60 µL prov (2.3:1 ratio). Pipettera försiktigt upp och ner 25 gånger för att blanda. Kontrollera att vätskan i varje rör är homogen. Odla i rumstemperatur i 2 min. Placera rören på magneten i 4 min, eller tills alla pärlor är bunden till magneten och kasta bort supernatanten.
    2. Lämna rören på magneten och tillsätt 200 µL av nylagade 70% etanol. Inkubera rören för 30 s utan att störa pärlorna. Avlägsna supernatanten och upprepa detta en gång till. Aspirera etanol helt och låta den paramagnetiska pärlor lufttorka för 4 min.
      Obs: Ofullständig etanol borttagning kan allvarligt minska DNA återhämtning och avkastning. Torka pelleten bara tills det är torrt. Uttorkning pelleten kan minska DNA återhämtning och avkastning.
    3. Ta bort rören från magneten och tillsätt 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Pipettera försiktigt hela volymen upp och ner 25 gånger för att blanda. Inkubera i 2 min i rumstemperatur. Placera rören på magneten i 4 min och överför supernatanten till en annan tube.
    4. Mäta mängden DNA med en lämplig fluorometer (se Tabell för material).
    5. Verifiera ChIP lyckades av qPCR (utspädd 1 µL i 100 µl H2O och användning 2-5 µL för qPCR). Använd specifika primers för ett positiv (känd bindningsställe protein av intresse) och negativ kontroll (t.ex., en gen som är tyst eller inte ett mål av protein av intresse).
      Obs: Biblioteket förberedelse kan utföras med 2 ng av ChIP DNA beroende på kit (se Tabell av material för ett förslag på vilket kit du använder).

Representative Results

4 sU märkning: verifierar optimal 4 sU-märkning villkor (apoptos, nukleära stress, cytoplasmiska stress), tid och koncentration: Höga nivåer av 4sU kan hämma produktion och bearbetning av rRNA och inducera cytoplasmiska samt nukleära stress30. Celler av intresse bör därför testas för 4sU-inducerad stress samt apoptos. Western blot analys rekommenderas för att visualisera p53 ackumulering, vilket indikerar nukleära stress, öka phospho-EIF2a som visar cytoplasmiska stress och fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) analys för apoptos. Hög och långvarig exponering för 4sU eller droger som thapsigargin eller arsenite kan användas för att inducera cellulär stress. För att inducera apoptos eller cell death, celler behandlades med BH3I-1 (500 ng/µL) eller ruvade för 5 min vid 95 ° C (värme chock). Annexin V/7-AAD färgning användes för att bestämma apoptotiska (Annexin V) och döda (7-AAD) celler. Märkning av in vitro- genererade primära Th1-celler för 0,5 h med 500 µM 4sU (slutliga koncentration) eller 1 h med 200 µM 4sU inducerar inte heller tecken på cellulär stress eller apoptos (figur 1) men leder till tillräckliga 4sU införlivande.

RNA märkning tid kan också förkortas (≤5 min) vilket leder till en ökning av kortlivade intronic sekvenser jämfört med längre märkning gånger. För att visualisera co-transcriptional skarvning priser, bör 4sU-märkning gånger inte överstiga 30 min. För ytterligare information om 4sUlabeling, se Rädle et al. 19

Kvalitetskontroll: RNA integritet är av stor betydelse vid behandling av RNA. Det är mest praktiskt att kontrollera RNA kvalitet 4sU-märkt RNA efter biotinylation av electrophoretical analys (se Tabell för material). Överväga att verifiera isolerade RNA från steg 2.2.2, speciellt när man använder det för sekvensering av total-RNA. RNA integritet antalet (RIN) bör vara ≥8 att säkerställa RNA integritet för vidare bearbetning (figur 3).

Electrophoretical analys kan också användas för att verifiera nyligen transkriberade RNA. Tänk på att nyligen transkriberade RNA innehåller betydligt mindre mogen rRNAs jämfört med total-RNA med typiska rRNA banden att vara mycket mindre framträdande.

Ribosomen profilering: PCR-amplifiering av cDNA biblioteket: cDNA amplifiering (steg 4.9.1) är ett viktigt steg att säkerställa bra sekvensering resultat. Analysera förstärkt bibliotek av electrophoretical analys. Ett bra urval av förstärkt bibliotek visar en topp runt 140-160 bp (figur 4A). Stora mängder av adapter dimerer bör undvikas (figur 4B) och dessa prover bör renas ytterligare med hjälp av sidan rening procedur enligt tillverkarens protokollet (sidan rening av PCR-produkter). För mycket mall eller alltför många PCR cykler kan leda till överdriven amplifiering kännetecknas av uppkomsten av högre än väntat molekylvikt banden, utsmetade PCR-produkter och adapter dimer produkter (figur 4 c). För de flesta prover 1-5 µL circularized cDNA och 9 PCR cykler för förstärkning kommer vanligtvis att ge tillräckliga mängder rätt PCR-produkten.

ChIP: kromatin klippning: Optimala klippning förhållanden måste justeras för varje typ av cell. Bestämma klippning villkor (t.ex., antal cykler, hög eller låg strömstyrka) i förväg. Använd samma antal celler och samma volym för testning, eftersom en lägre cell densiteten ökar klippning effektivitet. Försök att undvika över - eller under-klippning kromatinet. Stora kromatin fragment kan dramatiskt påverka ChIP resultat av igensättning och alltför klippning kan förstöra epitoper på proteinet av intresse, leder till en lägre effektivitet bindning av antikroppen. I detta experiment, de bästa resultaten uppnåddes när den största fraktionen av klippt kromatinet var runt 1000 bp eller något lägre (figur 5A).

Verifiering chipet av qPCR: Innan ChIP, är det lämpligt att testa om begagnade antikroppen är lämplig för ChIP (Använd om möjligt ChIP grade antikroppar) av ChIP-qPCR. Verifiera ChIP för sekvensering av qPCR innan biblioteket beredning (se steg 5.6.5). Design primers som binder till en känd målwebbplats av proteinet av intresse. Om målwebbplatsen exakta inom en gen är okänd, kan flera primer par användas att skanna genen och tillhörande rättsliga element. För RNAPII ChIP av Th1-celler Ifng, som är transcriptionally uppreglerad vid stimulering och aktin primers kan användas som en positiv kontroll. Sox9 och insulin tjäna som en negativ kontroll, eftersom dessa gener inte uttrycks i Th1 celler (figur 5B). Kom ihåg att inte använda exon-spänner grundfärger, som normalt används för qPCR av mRNA. En IgG-kontroll kan också användas för att bevisa används antikroppens specificitet. Immunoprecipitated DNA kan mätas med en lämplig fluorometer (se Tabell för material). Mängder av nonspecifically bundna DNA av IgG kontroll bör vara betydligt lägre jämfört DNA beloppet bunden av antikroppen av intresse.

Replikerar: bevis för biologiska betydelse: Det rekommenderas starkt att utföra kinetiska experimentet för alla metoder som börjar från samma pool av celler att säkerställa celler har samma identitet för alla obehandlade och behandlade prover (figur 2). Dock är det rekommenderat att ta små delprover av viktiga tidpunkter för varje metod för att jämföra prover till biologiska testmetod (t.ex., av qPCR, FACS analys). Detta ger en grov uppskattning om behandling för båda replikat var reproducerbara och du kan fortsätta med sekvensering. Validering av replikerar bör utföras med hjälp av bioinformatiska analyser. Reproducerbarheten av resultaten kan bedömas när det gäller sambandet mellan FPKM värden mellan replikat och visualiseras med hjälp av spridningsdiagram (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Kontroll av optimala 4sU-märkning villkor utan störande cellfysiologi (figur från Davari et al. 11)
(A) identifiering av cell apoptos av FACS analys: In vitro genereras Th0 celler behandlades med olika koncentrationer av 4sU (anges inom parentes) för 0,5 h, 1 h och 2 h, respektive. BH3I-1 behandling användes för att inducera apoptos bestäms av Annexin V, medan värme chock (5 min vid 95 ° C) användes för att inducera celldöd bestäms av 7-AAD. (B) Western blot analys för p53 av 4sU behandlas och aktiverade T-celler: prover var märkt med 200 µM 4sU för den angivna tiden av aktiveringen, utom den 0,5 h tidpunkten som var märkt med 500 µM 4sU. (C) Western blot analys av phospho-EIF2a och totala EIF2a i aktiverade Th1-celler med samma märkning villkor som i (B). Thapsigargin användes som positiv kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt av en kinetic setup att spåra genome-wide ändringar
Detta system illustrerar setup för att kombinera 4sU-seq, totalt RNA-seq, ribosom profilering och ChIP-seq att studera genome-wide förändringar vid cell behandling. Pool celler och upphäva det nödvändiga antalet celler för kontrollgrupp. Behandla resterande celler och dela för varje metod och tid. Etikett som obehandlad/behandlade celler för 4sU-seq med 4sU som beskrivs. Tidpunkter och prover för varje metod beror på den specifika biologiska frågan undersöks. Ta prover för varje tidpunkt och metod, och följa den dedikerade delen av protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvalitetskontroll av 4sU-märkta RNA
Total RNA och biotinylerade RNA som erhållits från aktiverade Th1-celler analyserades på en Bioanalyzer. 18S rRNA och 28S rRNA visas och RNA integritet nummer (RIN) ges av instrumentet att bestämma integritet av RNA. RIN bör ≥8 att säkerställa RNA integritet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Bioanalyzer profiler av Ribosomen profilering bibliotek
(A) A bra bibliotek: provet visar en topp på intervallet beräknade storlek (140-160 bp) och inga ytterligare rening behövs. (B), detta prov visar överdriven adapter dimer förstärkt produkt (120 bp) i förhållande till den önskade produkten (140-160 bp). Detta bibliotek kräver ytterligare rening. (C), en alltför förstärkta prov: högre än väntat molekylvikt toppar och utsmetade PCR-amplikoner är synliga (anges med pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Optimal kromatin storlek efter klippning och verifiering av ChIP av qPCR
(A) agaros gel bilden visar optimal fragment storlek klippt kromatinet från tre prover som var klippt för 25 cykler på en någon sonikator och renat som beskrivs tidigare i protokollet. (B) Q-PCR-resultat av en total RNAPII ChIP (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) är representerad som en procentandel av input. Ifng och aktin primers användes som en positiv medan Sox9 och Insulin är negativa kontroller (båda generna inte uttrycks i aktiverade Th1-celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Jämförelse av biologiska replikerar (figur från Davari o.a. 11)
Representativa spridningsdiagram jämföra uttrycksvärden (FPKM) mellan replikerar nyligen transkriberas (4sU) RNA 4 h efter stimulering av aktiverade Th1-celler. Den gröna linjen visar lika FPKM värden och rangordna korrelationen indikeras i varje tomt.

Varaktigheten av märkning (min) Rekommenderade 4sU koncentration (µM)
120 100 - 200
60 200 - 500
15 - 30 500 - 1000
< 10 500 - 2000

Tabell 1: Rekommenderade 4sU koncentrationer (från Rädle, et al. 19)
Rekommenderade 4sU koncentrationer är angivna för olika tider på märkning.

Metoden Antalet celler RNA belopp
4sU-märkning ≥ 2 x 107 ≥60µg
Ribosomen profilering ≥ 2 x107
ChIP-seq ≥ 2 x 107 - 3 x 107

Tabell 2: Begärda beloppet primär T celler
Minsta mängd krävs primära T-celler för varje metod. Belopp kan vara mindre när du använder andra celltyper.

Discussion

Analysera hela processen för genreglering är nödvändigt att fullt ut förstå cellulära anpassningar som svar på en viss stimulus eller behandling. Kombinera totalt RNA-seq, leder 4sU-seq, ribosom profilering och ChIP-seq vid olika tidpunkter till en omfattande analys av de viktigaste processerna för genreglering över tid. En djupgående förståelse för biologiska processer krävs för att definiera de experiment samt optimal tidpunkter.

Eftersom metoder för att studera genreglering förbättra snabbt, kan dessa protokoll anpassas till snabba förändringar. De ger dock de viktigaste metoderna för att studera grundläggande gen regleringsmekanismer i någon typ av cell. Här diskuterar vi några av de fallgropar och fakta måste man tänka på när man använder dessa metoder.

Celler: Cellerna måste vara mycket lönsamt och om använder primära isolerade celler, renhet av cellpopulationer måste garanteras (t.ex., FACS analys för primär T-celler). Ännu något stressade celler kan påverka resultaten av dessa mycket känsliga sekvenseringsmetoder och sänka mängden nyligen transkriberas eller översatt RNA, och leda till oönskade avläsning av stress svar i sekvensering resultaten. Den centrifugeringsvarvtal som nämns i detta protokoll till pellet celler är optimerad för primär T-celler. Således, justera hastigheten enligt celltypen.

4 sU effekter på cellfysiologi: Förutom ovannämnda alternativ för att verifiera minimal störning till cellulär fysiologi vid 4sU tillägg, kan ytterligare eller ytterligare analys utföras, särskilt när cell nummer är begränsade. Effekter på cell spridning kan testas genom att verifiera den fördubbling tid av celler genom att helt enkelt räkna märkta och omärkta celler. Nukleolära stress induktion kan också testas genom att analysera cellmorfologi via immunofluorescens färgning av nucleolin och kärnor. För att ytterligare verifiera effekterna av 4sU, kan förändrade globala genuttryck mätas genom att sammanföra läsa räknas från märkt total-RNA till namnlösa total-RNA.

Cell nummer: För in vitro- genererade T-celler rekommenderar vi att du börjar med minst mängden celler som anges i tabell 2. Välja lämpliga nummer per metod enligt vilken typ av celler. Eftersom T-celler har mindre cytoplasman och RNA jämfört med andra celler, blir sannolikt lägre mängder av andra celler tillräcklig. För ChIP-seq beroende cell nummer mycket antikroppen används och uttryck nivån av proteinet av intresse inom cellerna. För Histon eller RNAPII ChIP, kan fewe celler användas, medan cell nummer behöva ökas när transkriptionsfaktorer används, särskilt om de uttrycks på låga nivåer.

4 sU-märkning och RNA biotinylation: När du använder vidhäftande celler, kan 4sU märkning riktas som beskrivs av Rädle et al. 19 sedan celler mycket snabbt införliva 4sU, det kan läggas direkt till medlet av fjädring, anhängare eller semi vidhäftande celler.

Det rekommenderas att starta biotinylation med 60-80 µg av RNA. Dock lägre mängder av RNA kan användas, även om vi inte testa för mindre än 30 µg. lägga till en coprecipitant (t.ex., GlycoBlue) när utfällning RNA om pelleten är svårt att se. Duffy et al. har också visat att methylthiosulfonate-aktiverat biotin (MTS-biotin) reagerar mer effektivt med 4sU-märkt RNA än HPDP-biotin31. Därför kan det vara värt funderar på att byta till MTS-biotin, särskilt återvinning av små RNAs, som tenderar att ha färre uridin rester (se protokollet biotinylation nämns av Duffy et al.; se rening av 4sU-märkta RNA, Experimentella rutiner).

För återvinning av nyligen transkriberade RNA är det möjligt att använda paramagnetiska pärlor eller RNA Cleanup pärlor av ditt val. Ta alltid hänsyn till att dessa satser kan eller kan inte rena för specifika RNAs. Exempelvis om du är intresserad av MicroRNA, överväga att använda specifika kit för miRNA fånga och sekvensering.

Kvantifiering av nyligen transkriberade RNA: För att exakt kvantifiera nyligen transkriberade RNA, mätning bör utföras av en lämplig fluorometer (se Tabell för material). Inom 1 h av 4sU exponering representerar nyligen transkriberade RNA ca 1-4% av total-RNA. Nyligen transkriberade RNA på 1 h märkt, aktiverade T-celler består av ~ 90-94% av rRNA11.

Ribosomen profilering: När metoden ska vi fast beslutna att använda 1,5 x mängden nuclease än föreslog i den ursprungliga protokollet garanterar god uppslutning. Inga biverkningar har också rapporterats för förhöjda mängder nuclease. Eftersom det är ganska svårt att overdigest RPFs medan de är en del av RNA bunden av ribosomala proteiner, kan du fortfarande något öka beloppet att titrera optimal nuclease-nedbrytning.

Om mindre än 500 ng av RPF RNA återfanns i steg 4.4.2, upprepa rRNA utarmning och pool renats RPFs med RNA Clean & koncentrator-5 kolumner. Alternativt kan du ladda två identiska prover bredvid varandra på gel (steg 4.5.3) och pool gel skivor under RNA eluering från gelen (steg 4.5.6).

Vi rekommenderar att skära RPFs på en gel så tätt som möjligt till den 28 och 30 nt banden. Detta hjälper till att eliminera oönskade fragment från rRNAs och tRNAs, som senare kommer att bli en del av ditt bibliotek och minska sekvensering läsningar för din RPFs.

Det rekommenderas också att undvika UV-ljus under gel reningen. Detta kan skapa nicks i RNA fragment, as well as pyrimidin dimerer, som i slutändan kan allvarligt påverka bibliotek förberedelse och sekvensering resultat.

Bibliotek förberedelse och sekvensering av data: Ribosomen profilering protokoll gör det möjligt för att generera ett cDNA-bibliotek som är lämplig för sekvensering. Prover som genereras av 4sU-märkning kan användas direkt för bibliotek förberedelser med någon lämplig RNA-sekvensering kit. Sedan nyligen transkriberade RNA, särskilt när du använder kort märkning gånger, kanske ännu inte polyadenylated, bör inga poly-ett urval utföras. Istället rekommenderar vi starkt rRNA utarmning att förhindra att minska sekvensering djup för det riktiga provet. Med hjälp av T-celler, vi började med 400 ng nyligen transkriberas och totalt RNA (beroende på kit, se material), utförs rRNA utarmning och minskad cykler för PCR-amplifiering att minimera PCR bias. Bibliotek förberedelse kan utföras med mindre utgångsmaterial. För att beakta bibliotek komplexitet antalet PCR cykler bör optimeras.

För ChIP-seq finns det också många kits för bibliotek beredning. I våra händer bibliotek beredning arbetat väl börjar med 2 ng av ChIP DNA (se material för ett förslag på vilket kit du använder). Var noga med att kontrollera indexen för färgbalans under sekvenseringen. Vi rekommenderar sekvensering djup ≥40 x 106 läser varje för 4sU-seq, totalt RNA-seq, och ChIP-seq prover, och ≥80 x 106 läsningar för Ribosomen profilering prover. Sekvensering djupet beror på provet och nedströms bioinformatik analys och bör övervägas noga. För att analysera intronic läsningar för cotranscriptional skarvning, 100 måste bp Parade-end sekvensering väljas.

Sekvensering bias: Sekvensering blivit gold standard vid fastställandet av globala förändringar i transkription, översättning eller transkription faktorn bindande. Inom senare år, befintliga metoder drevs till sina gränser eller nya tekniker har utvecklats för sekvensering allt mindre utgångsbelopp RNA. Detta kräver förstärkning av cDNA, som introducerar buller eller bias. Nyligen, unika molekylära identifierare (UMIs) utvecklades för att experimentellt identifiera dubbletter som infördes genom PCR. Nyligen visades att UMIs bara milt förbättra sekvensering makt och falsk upptäckten hastighet för differentiell gen uttryck32. Emellertid överväga att använda unika molekylära identifierare (UMIs) för alla sekvensering bibliotek till kontroll för bibliotek komplexitet, speciellt när start med låga mängder RNA och när många PCR cykler behövs.

Buffert och stamlösningar: Alla buffertar för 4sU-seq och Ribosomen profilering måste förberedas strikta villkor RNase-fri med nuclease-gratis vatten. Det är rekommenderat att köpa färdiga nuclease-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumcitrat och vatten. För att säkerställa nuclease-fria villkor, kan ett RNase dekontaminering lösning användas för att rengöra pipetter eller ytor. Alla buffertar för ChIP-seq behöver vara minst DNAS-fri och kan förvaras i rumstemperatur. Alltid lägga till proteashämmare och, valfritt, fosfatas-hämmare just före användning och håll på is.

Bioinformatik: Analys av alla sekvensering data (d.v.s., ChIP-seq, RNA-seq och ribsosome profilering) innebär kvalitetskontroll (t.ex., med FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimning (t.ex., med cutadapt20) följt av mappning till referens genomet för cellerna under studien. För RNA-seq data (både totalt och 4sU-seq), samt Ribosomen profilering data, krävs en skarvade RNA-seq mapper, såsom ContextMap 221. För ChIP-seq data Osplitsat linjeföring är använda BWA-MEM22 tillräckligt. Genuttryck kan beräknas med RPKM modell (läsningar per Kilobase av Exon per miljoner fragment mappas)1, efter att fastställa Läs räknas per gen med hjälp av ett program, t.ex. featureCounts23. För peak kallelse från ChIP-seq data, det finns ett antal program, t.ex., Mac24 eller GEM25. Ytterligare kan nedströms analyserna utföras i R26, i synnerhet genom verktyg som tillhandahålls av det Bioconductor projekt27.

Här är en stor utmaning i att integrera 4sU- och total RNA-nivåer och translationell aktivitet från Ribosomen profilering normalisering. En klassisk metod att lösa detta problem är normalisera till nivåer av städning gener. För att minska buller på grund av slumpmässiga variationer för enskilda städning gener, det rekommenderas att inte bara använda några städning gener men medianvärdet nivåer för en större uppsättning, e.g. de > 3.000 städning gener sammanställd av Eisenberg och Italine28 . För beräkning av RNA omsättning från nyckeltal av 4sU-till total-RNA, normalisering är baserad på median omsättning priser (t.ex., förutsatt att en RNA halveringstid på 5 h)29. Men eftersom detta förutsätter inga övergripande förändringar för städning gener, rekommenderar vi använda analys metoder oberoende av normalisering, t.ex., korrelation-baserad klustring av en tidsserier av olika datatyper att identifiera grupper av gener med distinkta beteende i transkription och translation under aktiveringen. För en detaljerad beskrivning av bioinformatiska integration av olika datatyper hänvisar vi till den ursprungliga publikation11.

Analys av omsättning priser och data integration: En nyligen publicerad papper33 jämföra halveringstider bestäms av en multiplexade gen kontroll (MGC) till globala metoder kunde visa att halveringstider korrelerade bäst med sådana som erhållits genom metaboliska märkning metoder jämfört med andra metoder (t.ex., de allmänna hämning av transkription av droger). Det bör dock nämnas att skillnaderna mellan half-life beräkningar kan uppstå och ha varit beskrivs 15,34. Vi svarar för de flesta problem och skillnader som införs av stress svar på grund av långvarig 4sU exponering. Därför är det nödvändigt att utesluta den stressreaktion som infördes genom 4sU-märkning. För att ytterligare validera omsättning priser, rekommenderar vi användning av MGCs.

Dessutom kunde en uppsättning data som skapas här också användas för en mer integrativ data analys (t.ex., reglering av långa icke-kodande RNAs)35,36.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Lars Dölken för råd att upprätta 4sU märkning för primär T-celler; Elisabeth Graf och Thomas Schwarzmayr för kritiska hjälp i biblioteket generationer och sekvensering; Dirk Eick och Andrew Flatley för att tillhandahålla RNAPII och T-cells-antikroppar; N. Henriette Uhlenhaut och Franziska Greulich för hjälp bibliotek förberedelse för ChIP-seq; Caroline C. Friedel stöddes av bidrag FR2938/7-1 och CRC 1123 (Z2) från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG); Elke Glasmacher stöddes av anslaget GL 870/1-1 från Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) och den tyska Center för Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Tags

Genetik fråga 133 4-thiouridine ribosom profilering ChIP-seq RNA-seq nyligen transkriberade RNA genome-wide RNA bearbetning skarvning cotranscriptional skarvning översättning takt omsättningshastighet transkription faktorn bindande
Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C.… More

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter