病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位 描述了RNA杂交技术。
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本文内容
摘要
摘要
众所周知，基因在时空上的调控是调控基因正常表达的重要组成部分。因此，了解转录在细胞核空间内发生的位置和时间，并可视化同一细胞核内感染的附加体之间的关系，具有重要价值。本文结合了免疫荧光（IFA）和RNA-FISH技术，用于鉴定处于活跃转录状态的卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）附加体。通过标记KSHV潜伏相关核抗原（LANA），可以确定病毒附加体在细胞核内的定位。此外，通过设计靶向病毒基因内含子区域的RNA-FISH探针（该区域仅在 productive 感染期间表达），可以定位新生RNA转录本。利用这种分子探针的组合，可以可视化大型病毒转录工厂的组装过程，并分析KSHV再激活过程中病毒基因表达的空间调控。通过加入抗RNA聚合酶II抗体染色，还可以观察RNA聚合酶II（RNAPII）聚集与KSHV再激活期间病毒转录之间的关联。
引言
越来越多的证据表明，细胞核内部的时空结构在调控真核生物精细基因表达中发挥着重要作用。大多数组织特异性基因分布在多条染色体上，需要在特定刺激下以协调的方式同步调控1。细胞通过构建活性染色质中心（active chromatin hubs, ACH），将基因及其顺式调控元件聚集到特定的核空间区域，以实现协同调控1。
已有多种研究表明，尽管细胞核看起来非常致密且黏稠，但生物活性分子仍能通过扩散相对快速地穿越细胞核2。由于这种短暂的特性，大多数DNA结合蛋白会在结合位点之间“跳跃”，在细胞核空间中摸索前进，从而实现细胞核的高度适应性和多功能性2。
尽管细胞核内的生物大分子具有动态行为，但仍存在无膜的核体结构，例如（但不限于）核仁、卡哈尔体以及早幼粒细胞白血病核体（PML-NB）。这些结构通过多种机制维持其完整性，如串联DNA重复序列（核仁）、rRNA（核仁）以及结构蛋白如coilin（卡哈尔体）或PML蛋白（PML-NB）3,4,5。这些结构以及其他聚集区....
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方案
警告：本实验所用细胞系含有传染性病毒，操作时需格外小心，仅可在二级或更高级别的生物安全实验室（BSL）中进行。
1. 细胞准备与培养
- 在添加了15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液的RPMI1640培养基中培养TREx-K-RTA BCBL-1细胞（或其他KSHV感染的PEL细胞系）。
- 将细胞置于37 °C、5%二氧化碳（CO2）环境中培养，确保持续生长，并每2–4天按1:4的比例传代一次。
- 每天使用光学显微镜监测细胞培养情况，以确认细胞生长状态和形态良好；否则建议重新启动细胞培养或相应调整培养条件。
2. 胸腺嘧啶核苷同步化与裂解诱导
- 在10 cm培养皿中，将TREx-K-Rta BCBL-1细胞接种于新鲜配制的培养基中（1 × 106 个细胞/2 mL培养基）
- 向培养皿中加入200 mM胸腺嘧啶（终浓度：2 mM），混匀后孵育18小时。
- 以500 × g离心5分钟，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，再次离心后将细胞重悬于新鲜配制的培养基中。共洗涤3次。最后用新鲜配制的培养基重悬细胞。
- 让细胞退出S期，孵育8小时。
- 加入胸腺嘧啶（终浓度：2 mM），混匀后孵育16小时。....
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结果
采用了一种略微简化的实验方案，使用BCBL-1细胞，并仅对LANA和K-Rta RNA进行染色（图1）。该实验使我们能够观察处于活跃转录状态的病毒附加体在细胞中的位置，以及细胞群体对KSHV再激活刺激反应的异质性。在图1中箭头所指的细胞中，K-Rta荧光信号出现在与病毒附加体分布区域（以LANA标记）高度重合的区域，表明在KSHV基因组附近正在进行活跃的转录。在同一标本中，也可观察到如图1中箭头所示的细胞，其K-Rta荧光信号明显较弱且呈弥散分布，与LANA信号无明显重叠。这说明在细胞群体中，对再激活刺激的响应程度存在显著差异，是普遍存在的现象。
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讨论
该实验方案中有一些步骤可根据特殊情况进行调整。固定液和通透缓冲液的选择也可根据需要进行更改。对于固定液，多聚甲醛同样有效，而乙醇可用于通透处理。
建议使用甘氨酸 PBS 淬灭甲醛，以防止在缺乏牛血清白蛋白（BSA）的情况下甲醛使抗体失活；但如果盖玻片清洗充分，则可省略甘氨酸 PBS 步骤。在实验方案中，避免使用牛血清白蛋白作为封闭液。Izumiya 实验室开展的预实验显示，RNA-FISH 信号较弱，推测是由于 RNA 降解所致。如果需要对一抗进行封闭，建议使用无 RNase 的 BSA。根据以往经验，若抗体具有特异性，则反应中无需添加 BSA。然而，建议在所有孵育步骤中始终加入过量的酵母 tRNA，以防止 RNA 降解。已有观察表明，使用 tRNA 作为封闭剂可增强特异性的 RNA-FISH 信号。
已采用细胞周期同步化方法以实现更高效且同步的KSHV再激活。在细胞周期同步化过程中，羟基脲处理或血清饥饿可能是可选的替代方案。已有研究证实，羟基脲的效果与胸苷阻断法相当，尽管单独使用羟基脲孵育仅能微弱地激活KSHV。
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披露
本文作者无任何财务关系或利益冲突。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院基金（R01-DE025985）和美国癌症协会研究学者奖（RSG-13-383-MPC）的支持。本工作还获得了美国农业部基金（2015-67015-23268 和 2014-67015-21787）以及加州大学戴维斯分校新研究计划基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1650 培养基，含 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | 需预热至 37 °C |
| 胎牛血清 | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液（100 倍浓缩） | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| 胸腺嘧啶核苷 | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| 丁酸钠 | Sigma Aldrich | B5887 | |
| 甲醛溶液 | Sigma Aldrich | 252549 | 腐蚀性、有毒、健康危害 |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma Aldrich | D-5758 | 急性毒性 |
| 甘氨酸 | Sigma Aldrich | 410225 | |
| 丙酮 | Sigma Aldrich | 179124 | 易燃、有毒 |
| 甲醇 | Fisher Chemical | 67-56-1 | 易燃、有毒、健康危害 |
| 抗 KSHV/HHV-8 ORF73 大鼠单克隆抗体 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| 抗 RNA 聚合酶 II 抗体，克隆株 CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| 酵母（酿酒酵母，S. cerevisiae）来源的转移核糖核酸’s | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| 20 倍 SSC 缓冲液（柠檬酸钠缓冲液） | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| 甲酰胺 | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur 硫酸葡聚糖，50% 溶液 | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold 抗荧光淬灭试剂 | Life Technologies | S36936 | |
| 22×22 微型盖玻片 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 三维成像软件 | ||
| DeltaVision 显微镜 | |||
| Superfrost/Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 |
参考文献
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291
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