Summary
Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.
Abstract
Tek molekül Förster rezonans enerji transferi (smFRET) biomolecules dinamiklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir biyofiziksel teknik haline gelmiştir. İçin bir hücre proteinler birçok moleküler makineler işlevsel bir döngü ile birlikte etkileşim ortakları onların görevi yerine getirmek için harekete geçmeliyiz. Uzantısı iki renkli çok renge smFRET, aynı anda birden fazla etkileşimi veya konformasyonal değişim sonda olanak verir. Bu sadece smFRET deneyler için yeni bir boyut ekler aynı zamanda olay sırasını doğrudan çalışmaya ve immobilize bir örnek ve bir toplam iç yansıma Floresans kullanırken ilişkili etkileşimleri algılamaya benzersiz imkanı sunuyor mikroskop (TIRFM). Bu nedenle, çok renkli smFRET nicel bir şekilde ve daha önce ulaşılmaz bir detay çalışmak biyomoleküler kompleksleri için çok yönlü bir araçtır.
Burada, çok renkli smFRET deneyler protein üzerinde özel zorlukların üstesinden gelmek nasıl gösterir. Biz ayrıntılı protokol veri almak için ve Kinetik bilgi ayıklamak için mevcut. Bu izleme seçim ölçütü, devlet ayrılık ve devlet yörüngeleri 3D ensemble gizli Markov modeli (HMM) kullanarak gürültülü veri kurtarma içerir. Diğer yöntemlerine göre Kinetik bilgi Işınma Zamanı histogramlar ancak doğrudan HMM kurtarılır değil. Maksimum olabilirlik çerçevesinde eleştirel Kinetik modelini değerlendir ve anlamlı belirsizlikler için oranları sağlamak için bize izin verir.
Isı şok protein 90 (Hsp90) bizim yöntemi uygulayarak, biz nükleotit bağlama ve küresel konformasyon değişiklikleri protein disentangle edebiliyoruz. Bu doğrudan Hsp90 dimer ve iki nükleotid bağlama cepler arasında cooperativity gözlemlemek için bize sağlar.
Introduction
Çoğu protein işlevlerine konformasyon değişiklikler ve geçici dernekler zaman ölçeği1,2,3geniş bir dizi tarafından aracılı diğer molekülleri ile dinamik komplekslerinde yerine getirmek. Bir dış enerji kaynağı (Örneğin, ATP) bu dinamik etkileşimler yön için işlevsel bir döngü içinde kurşun ve sonuçta sigara denge kararlı durum hücrede, yaşam için önkoşul korumak için birleştiğinde.
Bu moleküler makineler tam anlamak için yapısal çalışmaları tarafından destekli bir statik tanım yeterli değildir. Buna ek olarak, temel Kinetik modeli bilgisine sahip ve Kinetik hızı sabitler belirlemek için önemlidir. Birkaç varolan yöntemler araştırmacılar faiz, Örneğin, yüzey plasmon rezonans, gevşeme yöntemleri (Örneğin, atlama veya durdu-akış spektroskopik bir okuma ile iki molekül arasında ikili etkileşimleri dinamikleri çalışmaya olanak sağlar. teknikleri) ve Nükleer manyetik rezonans. Ancak, çoğu durumda toplu deneyler için doğal sayı ortalaması nedeniyle basit iki durumlu sistemleri (Örneğin, bir bağlı ve bir ilişkisiz devlet) sınırlı onların geçerliliği uygulanır. Nerede daha fazla Birleşik veya ara ürün söz konusu durumlarda, onlar hızı sabitler yalnızca karmaşık bir karışımı verim. Optik veya manyetik cımbız veya iki renkli smFRET, Yani, bir donör ve yüzey immobilize örnek ile bir alıcısı fluorophore gibi tek molekül yöntemleri hızı sabitler için tüm konformasyon değişiklikleri gözlenen kurtarabilirsiniz. Ancak, birden fazla bağlama sitesi etkileyen etkileşimlerine gelince, bu yöntemler sınırlı kalır ve olası korelasyon iki (veya daha fazla) etkileşimleri hakkında bilgi-ecek var olmak yanına varılabilir yolu ile dolaylı sonuçlar deneyler bir dizi sadece.
Çok renkli smFRET4,5,6,7,8,9 doğrudan, gerçek zamanlı ve altında bu bileşenler arasındaki etkileşim çalışma fırsatı sunuyor yakınındaki fizyolojik şartlarda10. Bu bir örneğin, uyum bağımlı bağlayıcı bir ligand veya başka bir protein8,9,11araştırmak için izin verir. Burada sunulan genel yaklaşım belirli konumlarda, ölçüm odası yüzeye bir protein eklemek ve floresan yoğunluğu üzerinde bir prizma tipi TIRFM (için Ayrıntılar bkz: 9 saat içinde izlemek için ilgi protein(s) etiket etmektir , 12). farklı boya kayma yakınlığı sonra aralarında enerji transferi dan belirlenebilir. Stratejileri etiketleme protein ( 13' te gözden) protein değişiklik gösterebilir ve14smFRET ölçümleri aktarımında önlemek için kurallar yok.
Bir donör boya enerji farklı alıcısı boyalar çok renkli smFRET deneyinde transfer bu yana, tüm boyalar göreli konumunu bir boya tek başına15,16uyarma erişilebilir durumda değil. Ama lazer uyarma (ALEX17ve olarak gözden geçirilmiş 18) alternatif ile birlikte bu yöntem tüm spatio-temporal bilgi alt ikinci ve alt nanometre çözünürlük sağlar.
Prensipte, hesaplanan bir çok renkli smFRET denemede tüm Floresans yoğunluklarını ALEX ile birlikte yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi arası boya mesafeler kullanarak elde edilebilir. Ancak, burada ayıklama çok renkli smFRET vazgeçilmez nerede Kinetik modellerin yanı sıra durumu kimliğini doğrulamak ve ayrılık ele. "Sadece" yapı belirlenmesi üç taraflı kur çevrimi tarafından istendiğinde, yüksek sinyal gürültü oranı ile daha basit iki renkli smFRET deneyler bir dizi gerçekleştirilen12,19olabilir.
Kısmi Floresans kullandığımız (
) iki fluorophores7arasında enerji transferi için bir proxy gibi. PF floresan yoğunluğu iki renkli deney FRET verimliliğini benzer hesaplanır:
Nerede, 
emisyon kanal em şiddeti uyarma renk exile sonra ise c en uzun dalga boyu ile alıcısı. Algılama kanalları örnek odası ama kayıt farklı spektral aralıklar Floresan ışık aynı pozisyonda temsil eder. Tanımlayıcının uyarma ve emisyon için bu protokol için kullanılır (Örneğin, "mavi," "yeşil" ve "kırmızı").
Deneysel eksiklikleri nedeniyle ölçülen Floresans yoğunluklarda sadece enerji transferi aynı zamanda fluorophore ve kurulum özellikleri bağlıdır. İki fluorophores arasında gerçek enerji transfer verimi elde etmek için ölçülen yoğunluklarda düzeltilmesi gerekiyor. Aşağıdaki yordam başvuru9üzerinde temel alır. Belirgin sızıntı (lk, bir fluorophore bir kanalda gelen fotonlar tespiti için başka bir boya belirlenmiş Yani ) ve belirgin gama düzeltme faktörleri (ag, Yani, boya Floresans kuantum verimi ve algılama verimliliği kanal) olay beyazlatma bir alıcısı göstermek tek molekül izleri elde edilir.
Donör boya her olası alıcısı kanal içine kaçağı tüm veri noktaları nerede alıcısı boya ağartılmış ama hala floresan verici kaydedilen Floresans izlemeler hesaplanır (
):
Sızıntı çubuk grafik sayılarının belirgin sızıntı faktörü kullanılır. Sızıntı için Düzeltme yapıldıktan sonra izleri aynı kümesinden belirgin gama faktörü belirlenir. Floresans Alıcısı Kanal değişikliği Floresans alıcısı boya ağartma üzerine donör kanal değişikliği tarafından bölünerek hesaplanır:
C daha uzun dalga boyu ile alıcısı için algılama kanal olduğu yerde. Elde edilen dağıtım sayılarının belirgin düzeltme faktörü kullanılır.
Her kanaldaki düzeltilmiş yoğunluklarda tarafından elde edilir:
PF sonra göre hesaplanır:
Farklı popülasyonlar PFs tarafından yayılmış çok boyutlu uzayda ayrılabilir. Pozisyon ve genişliği her devletin çok boyutlu Gauss işlevlerle veri yaklaştırarak belirlenir. Tüm PF izlemeler üzerinde dayalı bir küresel HMM sonraki optimizasyonu gözlenen Kinetik nicel bir açıklamasını sağlar. Oranları küçük değişiklikler bile algılanabilir.
HMMs bir devlet modeli gürültülü zaman izlemeler koleksiyonundan gösterilirken bir yol sağlar. Sistem olarak ayrı, bir dizi birinde herhangi bir zamanda ve gerçek gözlem (Yani, emisyon) gizli durumlar bu gizli devlet20olasılıkçı bir fonksiyonu olduğunu kabul edilir. TIRFM smFRET veri söz konusu olduğunda, emisyon olasılıklar bben devlet ben başına sürekli Gauss olasılık yoğunluğu işlevleri tarafından modellenebilir. Düzenli aralıklı ayrık zaman noktalarda, bir başka bir duruma geçişler zaman değişmeyen ve yalnızca geçerli durumuna bağlıdır geçiş olasılık göre oluşabilir. Geçiş matrisi A tüm gizli durumlar arasında bu geçiş olasılıklar birIJ içerir. Başlangıç durumu dağıtım 
duruma özgü değerler verir 
bir zaman izleme noktası ilk saat için. Bir maksimum olabilirlik yaklaşım kullanarak, bu parametreler en iyi ileri geri ve Baum-Welch algoritmaları20,21ile verileri tanımlamak için optimize edilebilir. Bu maksimum olabilirlik estimators (MLE) sonuçlanır. Son olarak, büyük olasılıkla gözlemler yörüngesini üretilen devlet sıra Viterbi algoritması ile anlaşılmaktadır olabilir. SmFRET veri24,25,26 diğer HMM analizleri aksine biz bir sadece "veri ama özü Kinetik devlet modeli gerek kalmadan veri kümesinden Işınma Zamanı uygun için düzeltme" olarak HMM kullanmayın çubuk grafikler27. HMM analiz şirket içinde komut dosyalarını Igor Pro kullanarak yapılır. Kod uygulaması başvuru21tarihinde temel alır. Biz bir yazılım seti ve örnek veri bizim Web sayfasında bölüm 5 ve 6 bu iletişim kuralı (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) / izleyebilmek için sağlar. Dolu bilgisayar yazılımı elde edilebilir üzerinde rica.
Zaman PF ile veri noktaları < -1 veya PF > 2 herhangi bir algılama kanaldaki en az emisyon olasılık tüm durumları (10-200) atanır. Bu yapay geçişleri bu veri noktalarında engeller.
Emisyon değerler için parametreleri 3D PF histogram Gauss işlevleri ile uyum 5,7 adımda anlatıldığı gibi elde edilir. Bu parametreler HMM en iyileştirme sırasında sabit tutulur.
Sunulan yaklaşımda başlangıç durumu dağıtım vektör ve geçiş matrisi genel olarak izlemeler tüm topluluğu tanımlamak için kullanılır. Onlar başvuru27göre veri kümesinden tüm N molekülleri göre güncelleştirilir.
Başlangıç durumu dağıtım için başlangıç parametreleri PF çubuk grafik (Adım 5.3) 2D projeksiyonlar belirlenir ve geçiş olasılıklar için 0,05 değerler dışında aynı durumda kalmak gibi seçilen ayarlanır belirli bir eyalet dışına çıkmasına olasılık birlik için normalleştirilmiş.
Bir olasılık profil çıkarma yöntemi için onların belirsizlik için anlamlı tahminleri olarak hizmet tüm geçiş oranları21,22, güven aralıkları (CIS) vermek için kullanılır. Özel bir oranın CI sınırları hesaplamak için geçiş olasılık ilgi MLE dışında bir değere sabittir. Bu test modeli λ verimleri '. Olasılığını bir olasılık oranı (LR) test 
veri kümesi 0 göre gerçekleştirilir:
Zaman aşıyor LR 3.841, bir 2x% 95 parametreli parametre ulaşılır için bağlı % 95 güven-dağıtım ile bir özgürlük derecesi22,23.
Yöntemin gücünü Hsp90 kullanarak gösterilmiştir. Bu bol protein bakteri ve Ökaryotlar bulunur ve hücresel stres yanıt28parçasıdır. Bu bir kanser tedavi29gelecek vaat eden uyuşturucu hedeftir. Hsp90 bir homodimer bir nükleotit bağlama cep her alt birim30N-terminal etki alanında olduğunu. En az iki genel olarak farklı biçimler, kapalı bir ve bir N-terminal açık, V şeklinde conformation19,31,32arasında geçişler uygulayabilir. Dimerik doğa doğrudan Hsp90 İki nükleotid bağlama siteler arasında Interplay soruyu da gündeme getiriyor.
Aşağıda, biz veri toplama ve analizi Maya Hsp90 ve nükleotit bir üç renkli smFRET deney için adım adım bir protokol sağlar. Fluorescently etiketli AMP-PNP conformation bağımlı bağlantısını (AMP PNP *, ATP hydrolyzable olmayan bir analog) analiz edilir. Açıklanan yordamın uygulanması Hsp90 konformasyon değişiklikleri nükleotit bağlama ve aynı zamanda çalışma ruhsatı ve böylece cooperativity Hsp90 ve iki nükleotid bağlama cepler arasında ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kurulum ve önkoşulları
- Çok renkli smFRET ölçümleri bir prizma tipi TIRFM üzerinde gerçekleştirin. İki renkli kurulumuna ilişkin bir açıklama gibi bir Jüpiter yayın verilir başvuru12.
- Çok renkli TIRFM oluşturun. Genel bir düzen 9' detaylı.
- Kullanım değiştirilebilir, Diod pompalı katı hal mekanik panjurlar uyarma yolları kullanımı gereksiz hale sürekli dalga lazerler.
- Amaç girmek için arka taraftan uyarma demetinin arka yansıma engeller bir asimetrik, uzun prizma istihdam.
- 2-inç akromatik asferik erimiş silis lensler kadar ışık mümkün olduğunca toplamak ve otomatik Floresans ve anomalileri, Örneğin, kapalı Merkezi bölgelerde distorsiyonları görüntünün önlemek algılama yolları kullanın.
- EMCCD ayrı bir lens ile yonga üzerinde her algılama yola odaklan. Bu en iyi her algılama kanalını odaklanarak sağlar.
Uyarı: Sınıf 3B lazer TIRFM içinde kullanılır. Bu göz doğrudan maruz kalan, ancak diffüz yansımaları zararlı değildir Eğer tehlikeli oldukları anlamına gelir. Sistem işletilen önce lazer güvenlik önlemleri yerel hükümet yönetmeliklerine göre uymasını.
- Kurulum ve fluorophore özellikleri kullanılmadan önce dsDNA örnekleri için düzeltme faktörleri belirlemek.
- En uzun uyarma dalga boyuna sahip alıcısı ile birlikte her boya için bir yüksek-perde dsDNA örneği kullanmak (sunulan kurulum için: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). DNA Ayrıca bir biotin ile değiştirilir emin olun.
- Örnek 5 seyreltik nM TNM arabellek (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) ve 2 mM Trolox (bu arabellek ölçüm için de kullanın).
- DsDNA Hsp90 için 2,5 ve 2.7 adımlarda açıklandığı gibi hareketsiz.
- Belirgin sızıntı (lk) ve belirgin gama (ag) bir alıcısı beyazlatma olay göster tek molekül izlemeler için düzeltme faktörleri hesaplayın.
- Oluşturmak bir sandviç PEG/biotin-PEG düzgünleştirilecek kuvars slaydın bir akış odası, her iki tarafı ve bir kapak notu üzerinde yapışkan olduğunu ince bir film. Slaytlar ve pasivasyon kuvars temizlik için ayrıntı iletişim kuralları için başvuru9bakın.
- Kullanım kalın (3 mm) kuvars geometrik lazer ışık prizma ve functionalized kuvars slayt arasındaki kuvars-gliserol-kuvars arabirimi, dağınık topluluğu önlemek için slaytlar.
- Bir ince (40 µm) kullanmak olmayan yapışkan tarafı yapıştırıcı ile püskürtülür film sızdırmazlık. İnce film yüzeyine bağlı molekülleri ve objektif arasındaki mesafe azaltır. 80 ° C ısı ve devam et.
- Bir kapak makbuzu üste yerleştirin. 80 ° C ısı ve devam et. Gliserol bir damla akış odası prizma yerleştirerek kullanın.
Not: Prizma ve kuvars slaytlar yanı sıra gliserol dizin eşlemeli malzemelerdir.
- Saccharomyces cerevisiae iki tek sistein noktası mutantlar pozisyonlarda D61 veya Q385 şeklinde Hsp90 hızlı. Bir C-terminal dolandı-coil motif dimer ayrılma picomolar konsantrasyonlarda engellemek için ekleyin. Mutasyona uğramış proteinlerin ayrı ayrı etiket ve amino asit pozisyon 61, Atto488 ve Atto550 amino asit pozisyon 3859ile etiketli heterodimers elde etmek için monomerleri değişimi.
2. ölçüm
- Kamera yazılımını başlatın ve aşağıda belirtilen görüntüleme parametreleri ayarlayın:
- Sıcaklık sensörü (-95 ° C harici su soğutma ile) mümkün olduğunca düşük karanlık geçerli gürültü azaltmak için soğutma için ayarlayın.
- Tek molekül kayıt için optimize edilmiş kamera ayarlarını kullanın: 3,3 µs dikey kaydırma hızı, normal dikey saat gerilim, elektron çarpanı 1.000 kazanç 17 MHz 16-bit yatay öncesi amplifikasyon kazanç 3, dışarı, okuyun.
- "Dış" için satın alma ve çekim hızı 70 Bayan kayıt filmler için 750 edinme döngüleri uzunluğuyla harekete geçirilmesine karşılık ayarlayın.
Not: ne zaman kamera doygunluk EMCCD sensörünün önlemek için edinme Oda Işığı söndür.
- Ölçüm için yerel SSD üzerinde bir klasör oluşturun. Yazılım ayarları < otomatik kaydetme > binici için gidin, < otomatik kaydetme > etkinleştirmek ve film edinmesinin "Tiff" dosya biçimini seçin. SSD üzerindeki klasörü otomatik kaydetme konumu olarak seçin.
- Denetimleri acousto optik ayarlanabilir filtresi (AOTF), lazer işlemi denetleyen yazılım ve lazerler, AOTF, eşitler tetikleyici yazılım panjurlar yazılım algılama yol ve kameralar başlar. Lazer gücü ile AOTF (prizma girmeden önce ca. 3 mW) ayarlamak ve doğru tetikleyici deseni yükleyin.
- Prizma ve akış odası ile örnek sahibi mount, boru eklenmesi, giriş boru bir microcentrifuge kaba yerleştirin ve bir şırınga pompa çıkış boru bağlamak. Oda yaklaşık 150 µL arabelleği ile flush, uyarma hizalamak kiriş ve odak. Herhangi bir floresan kirletici yüzeyinde yavaş yavaş slayt tam algılama aralığında yaklaşık 10 bir lazer gücü ile hareket ettirerek bleach mW için tüm lazerler. Bu yaklaşık 1 saat sürer.
Not: Eğer değilse aksi belirtilmediği, 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl ve 10 mM MgCl2kullanılan arabellek içeriyor. - Odanın içine bir NeutrAvidin çözüm (tampon 0.25 mg/mL) yaklaşık 300 µL boşaltır ve 1 dk. tampon ve floş yaklaşık 300 µL ile ilişkisiz NeutrAvidin dışarı floş bir BSA solution'ı (tampon 0,5 mg/mL) odası kuluçkaya.
Not: Bu blok yüzey functionalization kalan tarafından BSA belirsiz adsorpsiyon yüzey kusurları. - Örnek akış odası ile biotinylated yaklaşık 150 µL yükleyerek hareketsiz ve (seyreltilmiş tampon + 0,5 mg/mL BSA) yükselen konsantrasyonlarda Hsp90 etiketli bir yeterli yüzey yoğunluğu ulaşılıncaya kadar hangi genellikle durum böyle bir konsantrasyon, 5-10 pM. İlişkisiz protein yaklaşık 300 µL tampon + 0,5 mg/mL BSA ile yıkayın.
- Floş 150 µL 25 nM AMP PNP * tampon + 0,5 mg/mL BSA içinde. 5 min için kuluçkaya ve doğru nükleotit konsantrasyon sağlamak için bu adım bir kez tekrar edelim.
Not: ek ve etiketlenmemiş AMP-PNP huzurunda deneyler için de 250 µM ekleyebilirsiniz AMP PNP. - Veri toplama ile başlar. Uygun bir veri miktarı için yaklaşık 1,5 saat alır yaklaşık 20 film elde etmek.
- Örnek odası uyarma ışını görüş alanı değiştirmek için piezo Step ile dik konuma getirin.
- Gerekirse amacı yüksekliğini kontrol z-piezo ile odak ayarlamak. Bu çok sık ne zaman ölçüm odası eğim monte gerekli olmamalı.
- < Sinyal al > kamera yazılımı basarak kameralarının kayıtları hazırlamak ve tetikleyici yazılımındaki < Başlat > düğmesini kullanarak uyarma/edinme döngüleri başlar. Bu floresan yoğunluğu edinimi başlatır.
- Bir kanal kayıt Floresans emisyon kurulum tüm algılama kanallarını spektral aralığını göstermek floresan boncuk ile bir film kaydederek gerçekleştirin. Sonra kalibrasyon film boncuk pozisyonlar için parlak noktalar arayarak algılayabilir ve bir Gauss merkezi konumdan yoğunluğu profile uyan belirlemek. Tüm kanallarında bulunan ve her iki eşleme uzaklık x - ve y-yönde bir 2D polinom derecesi üç9ile uygun boncuk koordinatlarını kaydedin.
3. tek molekül izlemeler yelpazesi
- Veri analizi Igor Pro kullanarak kurum içi kodlarla yapılır. "İniTIRF.ipf" açarak tüm gerekli komut dosyaları yüklemek ve doğru deneme türünü seçin.
Not: içinde aşağıdaki < düğmesini > menü veya kullanıcı arabiriminin tıklanabilir öğeleri belirtir. İşlev çağrıları tırnak, Örneğin, "Yazdır"Hello World"" gösterilir. Bu komutlar Igor Pro komut satırına (kapsayan tırnak işaretleri olmadan) yapıştırılabilir. - Algılama kanal kayıt parametrelerini yüklendiğinden emin olun.
- GUI tıklayarak başlatın < smFRET yeni | Analiz GUI >.
- Yoğunluğu ilgili kanallarında tutun Film (Yani, 512 x 512 piksel 16 bit TIFF yığınlar depolanan çerçevelerle dizisi) yükleyin. < Yük Film > düğmesine basarak ve dosyaları sözde "ana" ve "köle" kameralardan biri birbiri ardına seçerek bunu.
- Belirli bir algılama kanaldaki ilk beş kareleri toplamı en parlak noktalar için arama yaparak potansiyel tek moleküllerin konumları belirleyin. Tüm diğer algılama kanalları kanal eşleme ilgili pozisyonlarda hesaplayın. Floresan yoğunluğu izleme elde etmek için her çerçeve için merkezi bir konumda çevresinde bir piksel kare yoğunluğunu toplamı. Bunu GUI içinde < izlerini bulmak > düğmesine basarak.
Not: Meydanda (piksel) kenar uzunluğu tarafından verilir: 2 * < toplamı Pxs > + 1. - Her molekül için bir ortak ham yoğunluk izleme tüm izini sürmek-in bu nokta aynı uyarma renkle toplamı olarak hesaplar. Yoğunluk profil içinde bulunan tüm kanallar için aşağıdaki ölçütleri molekülünün değerlendirin:
- Ortak ham yoğunluk ve bir tek ağartma kabaca düz bir plato basamak tüm uyarma renkler, anticorrelated davranış uygun algılama kanalları, kırmızı Floresans tespiti için (bir ilişkili AMP PNP için FRET gösteren *) en az bir kez içinde izleme ve iki AMP-PNP varlığı gösterir kırmızı Floresans yok birden çok adımda * bir Hsp90 dimer bağlı.
- Bu kriterleri yerine Eğer daha ayrıntılı bir çözümleme için nokta Floresans izleri kaydedin. Bunu izleme imleci ile seçip < kaydet > düğmesini "zaman çizelgeleri" grafikte tuşuna basarak yapabilirsiniz. El ile tüm üç algılama kanallarını şiddeti izlemeler film başına yaklaşık 200 molekülleri mavi uyarma sonra kontrol edin.
4. kısmi Floresans izlemeler hesaplanması
- Tüm floresan yoğunluğu izleme kaydedilmiş molekülleri biri için görüntüler. İmleçler grafikte zaman aralıkları seçmek için kullanın.
- Nerede tüm fluorophores zaten ağartılmış bir saat aralığı seçin. Ortalama arka plan yoğunluğu bu aralıktan hesaplanır ve yoğunluğu izleme her kanaldaki çıkartılır. Bunu < arka plan > düğmesine basarak.
- Burada en az iki boyalar bağlı Hsp90 için FRET verimliliği aralığı seçin (Atto488 ve Atto550) mevcut. Yanıp sönen bir olay içeren izlemeler dışlamak emin olun (bkz. şekil 3B). Bu olaylar bir kanaldan başka kanal eşlik eden bir artış olmadan bir açılan floresan yoğunluğu ile karakterizedir.
- PF izlemeler hesaplayın. Bunu < PF Calc > düğmesine basarak. Belirgin sızıntı (lk) ve belirgin gama (ag) için önceden tanımlanmış düzeltme faktörleri için ham yoğunluk fotoğraf-fiziksel için düzeltmek için uygulanır ve kurulum özellikleri.
5. nüfus seçimi ve 3D Histogram montaj
- PF içinde düşük sinyal-gürültü oranı göstermektedir molekülleri kaldırın. Aralık [-1; 2] herhangi bir PF izleme için kare % 10'dan daha fazla molekül veri kümesinden kaldırılır. Bunu "RemoveTracesLowSNR()" Command Window içinden yürütmek yoluyla.
- PF veri Binned 2D tahminlerini hesaplamak. Arsa
üzerinde 
ve 
üzerinde aralığında [-0,5; 1,5] 100 x 100 depo gözleri çözünürlüğe sahip. Bunu yapmak için yürütün:- "HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"
- "HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25"
- 2D projeksiyonlar ayırt her durumda göreli nüfusu belirlemek.
- Uygun grafik önüne getirmek ve "panelHist2DCount()" yürütün.
- < Init > tuşuna basın ve en üst nokta çevresinde bir özgür-el çokgen çizer.
- < Sayı > düğmesini tıklatın. Çokgen deki veri noktalarının sayısı ve toplam sayıda veri noktası projeksiyon komut penceresinde yazdırılır.
- PF veri 3D histogramını yürüterek hazırlamak "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".
- Bir integral 1 için 3D histogram normalleştirmek. Aşağıdaki yürütün:
- "NewDataFolder/S fit0"
- "Yinelenen/O:: perde: Hist3D, Hist3D"
- "Değişken /G div sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0) =) ^ 3"
- "Hist3D / div; = Yazdırma div"
- 3D Gauss için başlangıç parametreleri uygun ve gerekli veri yapıları hazırlamak sağlar.
- Yürütmek "Gauss3D_initParam(); «««düzenleyin. W_coef_old»
- Devlet nüfus parametresi vektör ekleyin.
- Yürütmek "Gauss3D_prepareFit()."
Not: W_coef_old uygun başlangıç parametrelerini tutan bir vektörü olduğu. Devlet bu anlamına gelir
ve vektör sonunda birleştirilmiş devlet nüfus. Kovaryans matrisi simetrik olduğundan emin olun.
- S 3D Gauss işlevlerin 3D PF çubuk grafik toplamı ayırt durumları sayısı olmak S ile uygun.
- Yürütmek "do3D()." Bu bir saat veya daha fazla PC, normal bir Office başlangıç parametreleri kalitesine bağlı olarak alabilir.
- Yürütmek "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); «««düzenleyin. W_coef»
- Uygun sonucu görüntüler. Her iki 2D projeksiyonları için aşağıdaki komutları kullanın:
- "contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"
- "contourPF3D_colorize()"
üzerinde 
ve 
üzerinde 
ve vektör sonunda birleştirilmiş devlet nüfus. Kovaryans matrisi simetrik olduğundan emin olun.6. kinetik analizi ile 3D Ensemble HMM
- Bir topluluk Kinetik bilgi ayıklamak için çalıştırın HMM hazırlayın. Bir HMM veri kümesindeki tüm molekülleri üzerinden optimize edilmiştir. Önceki adımda elde ettiği bilgileri her devletin genişlik ve pozisyon 3B PF alanda tanımlamak için kullanın.
- HMM kullanıcı arabirimi başlatılamıyor (< HMM | Init HMM >) ve Birleşik uygun sayısını seçin (Hsp90 veri söz konusu olduğunda bu < NumStates > anlamına gelir = 5), sayı boyut sayısını giriş sinyali (< NumDims > = 3) ve giriş türünü (< giriş türü > "Perde 3D bgr" =).
- HMM, olasılığını yakınsama yazılım izin vererek HMM parametrelerini optimize ("prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14 yürütmek)") önceki yinelemeye göre geçiş matrisi değişikliği (10-14 bir eşiğin altına düşene kadar mutlak değişim her geçiş olasılık için toplamı için). Bu geçiş olasılıkları yaklaşık bir saat normal Office PC için MLE verir.
- Nüfus seçimi, Gauss montaj ve HMM optimizasyonu (Örneğin, % 75'i tam veri kümesi) veri alt kümelerine için yineleyin. Tam veri kümesi farklı deneyler birleşti, optimizasyon Ayrıca her tek deneyler için yineleyin. Alt kümeleri analizini el ile popülasyon seçimi ve veri kümesi içinde değişkenlik belirsizliği tahmin etmek için izin verir.
- Rapor veri kümesi heterojenite ve HMM duyarlığını geçiş olasılıklar için CI hesaplayın.
- "Cd $(kök: path3Dimport +"HMM"); yürüterek CI sınırların kaba bir tahmin almak loop_getCI_estimate_limits()."
- CI kesin sınırlarını yürüterek Hesapla:
- "loop_getCI_HMM_converge(1)"
- "CIresults_conv_new()"
- "cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"
- "cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) "
- Yorumunu basitleştirmek için kullanılabilir Kinetik bilgileri yoğunlaşmak.
- Etiketli bir nükleotit Hsp90 için ilişkili kalır zaman hakkında bilgi toplamak. Bunu AMP-PNP bağlı Birleşik daraltarak * (Yani, S1, S2 ve S3, Ayrıca bakınız Şekil 2) ve Işınma Zamanı histogram derlemek. Yürütmek "cd $(kök: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", hangi yerde bir araya getiren devletler S0 ve S4 yanı sıra S1, S2ve S3.
- Viterbi yolu ilgi her durum için durmak kere ayıklamak ve farklı deneysel koşullar için elde edilen Işınma Zamanı histogram karşılaştırın. Yürütmek "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
- Daha ayrıntılı bir resim için ayrı PF , ancak daha fazla veri çözümleme, örneğin, etiketli Hsp90 ve nükleotid, Birleşik S2 ve S ile üç renkli bir deneme durumunda kolaylaştırmak için işlevsel olarak aynı Birleşik Daralt 3 daraltılabilir. Yürütmek "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çok renkli smFRET ölçümleri iki veya daha fazla farklı etkileşim siteler arasında korelasyon doğrudan algılanmasını sağlar. Bu teknik çok bileşenli sistemler, protein kompleksleri gibi araştırmak için benzersiz işler. Açıklayıcı bir örnek olarak hizmet veren bir üç renkli smFRET deneyi, sunu üzerinde odaklanıyoruz.
Genel iş akışı yöntemi şekil 1' de gösterilen. İlk bölümü veri yazmak için çok renkli smFRET prizma tipi TIRF mikroskop oluşmaktadır. Yüzey ek strateji ve kurulum şemalarını şekil 2Atasvir edilir. Kur'un daha ayrıntılı bir açıklaması için9referans bakın. Sunulan yöntem ikinci bölümü veri analiz üzerinde odaklanır. Örnek teşkil eden floresan yoğunluğu izler şekil 2Biçinde gösterilir. Uygun zaman izleri göster: (i) bir açık beyazlatma adım Hsp90, (ii) düz yoğunluğu yaylalar, bağlı her iki fluorophores için (III) anti-korelasyon karşılık gelen kanalları ve (iv) en az bir bağlama olayı AMP PNP davranışını * (şekil 3). Seçim ölçütü karşılayan 400'den fazla molekülleri güvenilir istatistikler verim için seçildi. Okudu sisteminde, beş devlet Floresans yoğunluklarda tarafından dört Birleşik işlevsel olarak farklı (şekil 2C) olmak ile ayrılır.
Floresan yoğunluğu izlemeler kısmi floresan (PF, çok renkli smFRET deneyler için FRET verimliliği uzantısı) olabilir (şekil 4A) hesaplanır. PF boyalar yakınlığı ile ilgilidir. Üç renkli smFRET deneyde, veriler 3B alanda (şekil 5B) yayılmıştır. 3D çubuk grafik 2D projeksiyonları (şekil 4B, C) devlet ayrılması için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Başarılı bir deneyde, teorik olarak uygulanan deneysel koşullar altında beklenen tüm devletlerin kendi PF 2D projeksiyonlar tarafından ayırdedilebilir.
Birleşik Devletleri'nin göreceli nüfus 2D projeksiyonlar tepe (şekil 5C) içine alın çizim özgür-el çokgenler tarafından belirlenir. Bu yaklaşım doğru ve güvenilir9bulundu. HMM için emisyon değerler S sayıyken ayırt devletler (beş sunulan durumda; 3D Gauss işlevlerin, toplamı ile 3D PF çubuk grafik yaklaştırarak elde edilir Şekil 5 d). Düzgün yakınsama bu için sadece göreceli nüfus pben her devlet ben , konumu ve Gaussians genişliğini ücretsiz iken sabit tutulması oturuyor.
Bir topluluğu HMM tam veri kümesi Gauss uyum (şekil 6) elde edilen parametrelerine sabit emisyon olasılıklar ile optimize edilmiştir. Her geçiş için ayıklanan geçiş olasılıklar, % 95 CI belirsizlik için bir ölçü almak için (Şekil 7) belirledi.
Ayrıca, ortalama süresi bu etiketli muhabir nükleotit AMP PNP * Hsp90 için bağlı kalır farklı deneysel koşullarda (şekil 8A) ayıklanır. Bu daha da sonuçları karmaşıklığını azaltmak için yardımcı olur. Bunun AMP PNP temsil eden Birleşik için * ilişkili ve ilişkisiz biçimler sırasıyla devlet yörüngeleri çökmüş. Bu ortalama Işınma Zamanı AMP PNP * ayrılma olabilir (şekil 8B) hesaplanır.
Devamsızlık ve ek varlığı içinde gözlenen Kinetik karşılaştırarak, Hsp90 konformasyon değişiklikleri ve nükleotid devlet arasındaki korelasyon etiketlenmemiş AMP PNP, benzersiz bilgi elde edilebilir. Bu cooperativity Hsp90 ve iki nükleotid bağlama cepler arasında doğrudan çalışma sağlar. Ayrıca, substrat konsantrasyonu (Örneğin, Hill araziler) bağlama sitesi işgali bir fonksiyonu olarak ölçmek titrasyon deneyler ihtiyacını kaçınmanızı sağlar. Hsp90 gibi son derece dinamik protein sistemleri için bu yaklaşım aynı zamanda küçük değişiklikler oranları11duyarlıdır.
Resim 1 : Veri toplama ve analiz genel iş akışını. Veri çok renkli smFRET toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) üzerinde kazanılır. Sonra izleme seçimi ve kısmi floresan (PF) hesaplanması, 3D PF çubuk grafik ve 2D projeksiyonlar bunların derlenir. 2D projeksiyonlar kullanarak, tüm ayırt eyaletlerindeki nüfus belirlenebilir. Bu PF çubuk grafik için uygun bir 3D Gauss için bir kısıtlama olarak kullanılır. Gauss olasılık yoğunluk fonksiyonları sonraki 3D topluluğu için emisyon değerler olarak hizmet gizli Markov modelleme (HMM). Bu sistem Kinetik açıklamasını verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Veri toplama düzeninin. (A)piktogram bir Hsp90 dimer oluşan okudu sisteminin (sarı oval temsil etki alanı yapısı) ile Atto488 (mavi) ve Atto550 (yeşil) etiketlerini ve muhabir nükleotit AMP PNP yüzey bağlı * çözümde, etiketli ile Atto647N (kırmızı). Veri prizma tipi TIRF mikroskop lazer uyarma (ALEX) alternatif ile kaydedilirler. (B) örnek teşkil eden floresan yoğunluğu (FL Int.) izleri sonra mavi ve yeşil uyarma. (C) sembollerin Hsp90 ayırt konformasyon durumlarında (S0, S1, S2, S3, S4) ve onların ilgili tanımlayıcı bu çalışmada kullanılan işlevsel durumu (O, C, O *, C *) için. Mavi, yeşil ve kırmızı Fluorophore pozisyonları gösterilir. İki popülasyonun aynı fonksiyonel durumunu temsil eden, yani Hsp90 AMP-PNP ile Aç * (S2 ve S3) bağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Seçim kriterleri. (A) A molekül daha fazla çözümleme için seçili. (B, C) Moleküller daha ayrıntılı bir çözümleme için seçilmemiş. (B) yok düz yaylalar ve Atto550 olduğu karanlık bir durumda yaklaşık 30 s sonra yeşil uyarma (oklarla gösterilen). (C) yeşil uyarma (oklarla gösterilen) sonra birden fazla ağartma adımlar. Fl. Int.: floresan yoğunluğu, mavi: Atto488, yeşil: Atto550, kırmızı Atto647N, ex: uyarma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : PF izleri ve temsilcisi histogramlar. (A)temsilcisi floresan yoğunluğu (FL Int.) izleri ve karşılık gelen kısmi floresan (PF) izler. (B) iki ek ve etiketlenmemiş nükleotit yokluğunda ölçümü için 3D PF çubuk grafik 2D projeksiyonlar. (C) ek 250 µM huzurunda deneme için aynı projeksiyonlar AMP PNP. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Nüfus seçim süreci. (A) iki 2D projeksiyonlar beş ayırt nüfus konumunu. (B) şekil 2Csembollerin kopyası. (C) temsilcisi 3D dağılım çizim PF veri. Veri noktalarının renklendirme için yalnızca görselleştirme olduğunu. B olduğu gibi aynı renk kodu kullanılır. Göreceli nüfus belirlenmesi (D) 2D histogram içinde özgür-el çokgenler doruklarına çevresinde çizerek yapılır. Şekil 3' te tasvir iki projeksiyonlar bir birleşimini kullanarak, tüm beş nüfus ayrılır. (E) A. Depicted içinde gösterilen PF veriler histogramını için uygun 3D Gauss beş farklı popülasyonlar temsil isosurfaces, FWHM, sonuçlarıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Akış şeması topluluk 3D HMM optimizasyon. Bir model veri kümesinden tüm molekülleri için optimize edilmiştir. Başlangıç değerleri giriş modeli (ile Birleşik önceden tanımlanmış bir dizi) tarafından verilir. Veri (3D PF izleri) verilen modeli olasılığı ileri geri (FB) algoritması ile derecelendirilmiştir. Baum-Welch (BW) algoritma parametreleri bir yerel maksimum olabilirlik tahmin (MLE) verir. Küresel MLE sonra yinelemeli olarak bulunabilir. Viterbi algoritması bir modeli göz önüne alındığında en olası durumu yörünge hesaplar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Anlamlı belirsizlik tahmini CI ile. CI bir örnek hızı sabiti(a)belirlenmesi. Maksimum olabilirlik Tahmincisi (MLE) modeline göre test modeli olabilirlik oranı (LR) çevresindeki MLE oranı sabit için hesaplanır. LR 3.841 (yatay koyu gri çizgi) aştığında bağlı % 95 güven ulaşılır. (B) ayıklanan hızı sabitler ek nükleotit (kırmızı) olmadan ve AMP-PNP (mavi) ve onların % 95 CI. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Ortalama durmak zaman muhabir nükleotit AMP PNP * Hsp90 için sınır ek nükleotit huzurunda uzun süreli. (A)piktogram etiketli AMP-PNP, gözlenen ayrılma * Hsp90 tüm biçimler üzerinde ortalama Hsp90 dimer üzerinden. Hsp90 etki alanı yapısını sarı oval tarafından tasvir ve konformasyon esneklik bir açık ve kapalı dimer overlaying tarafından belirtilir. (B) ortalama AMP PNP zaman durmak * ek nükleotit (kırmızı) yokluğu ve 250 µM (mavi) AMP PNP etiketsiz varlığı için Hsp90 bağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz karmaşık protein sistemi ve adım adım açıklamasını bu ölçümlerin analiz için üç renkli smFRET verileri elde etmek için deneysel bir işlem mevcut. Bu yaklaşım doğrudan birden fazla etkileşim siteleri veya konformasyon değişiklikler arasındaki ilişki değerlendirmek için benzersiz imkanı sunuyor.
Proteinler üzerinde uygun çok renkli tek molekül verilerini elde etmek için düşük gürültü seviyesi, tekrarlanabilir ölçümler işlemi yapılması önemlidir. Bu akış odası9için verimli ve güvenilir yüzey pasivasyon protokolünü kullanarak elde edilebilir. Yeterli bir yüzeye immobilize molekülleri yoğunluğu molekülleri kaydedilmiş filmi başına verimi artırmak için kullanılmalıdır. Bu Floresan ışık tek molekülleri kaydedilen görüntülerdeki piksel yaklaşık % 5-10 üzerinde düşmek gerekir anlamına gelir. Molekülleri komşu bir çakışma neden olur çünkü aynı zamanda aşırı yükleme, engellenip. Ne zaman etiketli familyasından bir çözümde ücretsiz (AMP PNP * sunulan çalışmada), konsantrasyonu ile ölçüm lazerler ile daha kısa dalga boyları üzerinden doğrudan uyarma tarafından karışmaması için düşük olduğundan emin olun (Yani, genellikle micromolar altında iyi konsantrasyon). Ayrıca, bu bileşiklerin konsantrasyonu amaçlanan arabirimlerine belirsiz bağlama nedeniyle daha düşük olmadığından emin olun. Ayrıca, en uygun uyarma güç sinyal-gürültü oranı ve fluorophores photobleaching arasında bir denge temsil eder.
Sistem kayıt atma oksijensiz sunulan protokolünde istihdam edilmektedir. Kullanılan Atto-Tec boya deneme (uyarma döngüsü başına 70 ms aydınlatma) Zaman ölçeği üstünde yanıp sönen önemli görünmüyor ve glikoz oksidaz, katalaz ve Trolox33 oluşan bir çöpçü sistemi tarafından photo çamaşır suyu oranı hiçbir azalma gözlenmiştir ,34. Ayrıca, oksijen atma sistemleri genellikle bir micromolar konsantrasyon35kadar protein bileşenleri içeren gibi oksijen çöpçü yokluğu eserler belirsiz protein etkileşimleri, nedeniyle önler.
Başka bir önemli adım izleme seçimdir. Bir tek fluorophore yoğunluğunu özetleme için alanının boyutunu mümkün ama hala işlev kurulum noktası yayıldı daha büyük olarak küçük olması için seçilir. İzlerini analiz bu aşamada düzeltilmez beri algılama kanalları benzer belirgin gama varsa izleri sadece beklenebilir ortak yoğunluğu düz bir plato faktörler, olduğunu unutmayın. Floresan yoğunluğu izlemeleri için iyi tanımlanmış ölçütlere uyan moleküllerin analizi (Bölüm 3) dahil edilir. Zavallı bir sinyal gürültü oranı PF izlemeler moleküller daha fazla analiz hariç tutulur ve veri değerlendirme açık seçim ölçütleri kullanılır olarak etkilemez.
Veri kalitesine bağlı olarak alternatif yaklaşımlar en uygun devlet ayırma sağlar. Ücretsiz bir çok boyutlu topluluğu HMM floresan yoğunluğu izler27 bağlı veya PF izlemeler temel Birleşik karşılık gelen emisyon değerler (Örneğin, Gauss optimize ederek tahsis etmek için uygulanan olabilir PDF'ler) ve aynı zamanda Kinetik modeli en iyi duruma getirme. Her iki yaklaşımın avantajları ve dezavantajları vardır. Molekül molekül floresan yoğunluğu düzeyleri farklılık ise PF izleri olumsuz sivri içerebilir. Sunulan protokolü tarafından yapay geçişleri engelleyen sivri ortaya çıktığında ve emisyon olasılıklar üzerinden bir 3D Gauss PF çubuk grafik için uygun tahmin ederek ve sadece geçiş olasılıkları sonraki en iyi duruma getirme Bu sorunu çözer Ensemble HMM çalıştırın.
Sunulan yaklaşımı geleneksel tek molekül ölçümleri için gerekli düşük konsantrasyonlarda ile uyumlu olması için nispeten yüksek bir yakınlık ile bağlar bir etiketli etkileşim ortak ihtiyacını ile sınırlıdır. Bu yerel konsantrasyonu (etkileşim ortakları36toplam hayvan zinciri, veziküller37,38katma) veya (Örneğin, sıfır modu heyecanlı azaltmak için yöntemler artırmak için stratejiler tarafından üstesinden dalga kılavuzu39). Buna ek olarak, dikkatli seçilecek etiketleme pozisyonları var ve kontrol deneyleri şiddetli yan etkileri fluorophores dışlamak gereklidir. Hsp90 durumunda, bu genellikle enzimatik aktivite40kanıtlıyor bir ATPaz tahlil tarafından kontrol edilir. Varsa, kristal veya NMR yapısı yapısal bilgileri dikkate alınmalıdır. Tercih edilen pozisyonlar etkileşim arabirimleri uzak yüzey maruz döngüler vardır ve bir protein yüzey cebinde gömülü değil. Bu boya için büyük bir erişilebilir birim sağlar.
Çerçeve renkleri isteğe bağlı sayıda ile çok renkli smFRET deneme için uygundur. Bunlar zaten diğer tek molekül deneyler, yani olasılığı doğrudan iki süreç arasında korelasyon gözlemlemek için sorumluluk alanlarından verir ve özelliği sağlamak gibi burada, üç renkli ölçümler üzerinde odaklanmak (Örneğin, bağlama, bir etkileşim ortağı ve konformasyon değişiklikler). Bu bilgiler bir standart iki renkli smFRET deneyi erişilemez ancak herhangi bir moleküler makinenin işlevini anlamak için temel ilgi.
Sunulan deney ve analiz dynamics3zaman ölçekleri kendilerini son derece esnek olan devletler arasında geniş bir dizi görüntüleyebilir protein sistemleri karakterize yeteneğine sahip. Bu DNA veya RNA modeli gibi sistemlerinde Holliday kavşak4(çoğunlukla iki) iyi tanımlanmış durumlar arasında geçişler sergilenmesi, odaklı daha önce yayımlanmış çok renkli smFRET deneyler karşıttır. Protein sistemleri, sinyal-gürültü oranı düşüktür ve geçiş olasılıklar kümesinin tamamı ayıklama smFRET deneylerde photobleaching nedeniyle sınırlı zamansal bant genişliği nedeniyle zordur. Burada, biz gösteriyor ki - eğer dikkatli ve makul kısıtlamalar ile-uygulanan ölçme protein sistemleri içinde engelleri çok boyutlu devlet ayırma ve ensemble gizli Markov analiz9kullanarak çok renkli smFRET ile aşılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Alman Araştırma Vakfı (INST 39/969-1) ve Avrupa Araştırma Konseyi aracılığıyla ERC hibe sözleşmesi n. 681891 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup | |||
| vibration-damped optical table | Newport, Irvine, CA, USA | RS2000 | |
| OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1185052 | |
| OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1261779 | |
| OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1233470 | |
| OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1196625 | |
| laser control unit | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific Remote |
| aspheric telescope lenses | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d=25.4mm, f=50mm and f=100mm | |
| CF ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 473/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 532/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZET 594/10 | cleanup filter excitation |
| CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | cleanup filter excitation |
| DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ594RDC | dichroic mirror excitation |
| DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 570DCXR | dichroic mirror excitation |
| DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | ZQ491RDC | dichroic mirror excitation |
| AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
| λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
| CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA objective | |
| piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, Germany | Piezo Controller NV 40/1 CLE | |
| piezo stepper | Newport, Irvine, CA, USA | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit |
| achromatic aspheric lenses | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
| adjustable optical slit | Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany | 27.160.1212 | max. aperture 12 x 12 mm |
| DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | T 600 LPXR | dichroic mirror detection |
| DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | H 560 LPXR superflat | dichroic mirror detection |
| DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | HC BS R635 | dichroic mirror detection |
| BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | bandpass filter detection |
| BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
| optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
| EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
| digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
| syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow chamber | |||
| quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
| TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
| spray adhesive | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
| glycerol | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | Immersol G | |
| immersion oil | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany | IMMOIL-F30CC | |
| prism | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany | Suprasil1 | |
| aluminium prism holder | custom built | ||
| hollow setscrews | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | with custom drilling | |
| Tygon S3 E-3603 tubing | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
| PTFE tubing | Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany | S1810-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample | |||
| yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
| Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
| AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
| Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | version 2012, 32bit; misc. hardware control | |
| MDS control software | AA Opto-Electronic, Orsay, France | version 2.03a | |
| Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | version 3 | |
| Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | version 6.37 |
References
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M.
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
- Hohng, S., Joo, C., Ha, T.
- Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
- Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S.
- Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
- Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
- Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
- Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
- Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
- Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
- Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
- Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
- Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
- Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
- Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
- Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
- Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
- McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
- Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
- Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
- Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
- Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
- Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
- Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
- Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
- Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).
