Summary
Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.
Abstract
Polymorphkernigen Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel (PMN)-m/s) sind Lipid Bilayer, sphärische Microvesicles mit Größen von 50 – 1.000 nm im Durchmesser. M/s sind eine sich neu entwickelnden, wichtiger Bestandteil der Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung Maschinen. Wegen ihrer Größe und der Art ihrer Freisetzung wurde bis vor kurzem MP Existenz übersehen. Allerdings ist ihre Funktion in Gesundheit und Krankheit mit verbesserter Technik und analytischen Methoden jetzt entstehen. Die hier vorgestellten Protokolle richten sich an Isolierung und Charakterisierung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie und Immunoblotting. Darüber hinaus sind einige Umsetzungsbeispiele gegeben. Diese Protokolle für MP Isolierung sind schnelle, kostengünstige und nicht den Einsatz von teuren Kits erfordern. Darüber hinaus sorgen sie für die Kennzeichnung von MPs nach Isolierung, sowie Pre-Kennzeichnung der Quellzellen vor MP Version mit einem Membran-spezifische Fluoreszenzfarbstoff zur Visualisierung und Analyse von Durchflusszytometrie. Diese Methoden haben jedoch mehrere Einschränkungen einschließlich Reinheit von PMNs und m/s und die Notwendigkeit für anspruchsvolle analytische Instrumentierung. Ein High-End-Durchflusszytometer muss zuverlässig analysieren MPs und minimieren falsche positive liest wegen Lärm oder Auto-Fluoreszenz. Die beschriebenen Protokolle können verwendet werden, zu isolieren und MP Biogenese definieren und charakterisieren ihre Markierungen und Variation der Zusammensetzung unter anderen stimulierenden Bedingungen. Größe Heterogenität kann ausgenutzt werden, um zu untersuchen, ob der Inhalt der Membran Partikel versus Exosomen anders ist, und ob sie unterschiedliche Rollen im Gewebe Homöostase zu erfüllen. Zu guter Letzt können folgende Isolierung und Charakterisierung von MPs, ihre Funktion im zellulären Reaktionen und verschiedenen Krankheitsmodelle (einschließlich, PMN-assoziierten entzündlichen Erkrankungen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen oder akuten Lungenversagen) erkundet werden.
Introduction
Vor kurzem, "Mikropartikel/Microvesicles" aus dem Zytosol der Zelle oder Plasmamembran geworden von großem wissenschaftlichen Interesse, da neue Daten deuten darauf hin, dass diese Strukturen, angefangen bei 50-1.000 nm im Durchmesser, biologische Informationen enthalten können und als eine nicht-kanonische Methode der zellulären Kommunikation dienen. Immune Zelle abgeleitet MPs und besonders die von polymorphkernigen Neutrophilen (PMNs) sind von großem Interesse angesichts der wichtigen Rolle von PMNs in Host Verteidigung1,2, Entzündungsreaktionen3und Wundheilung 4. faszinierend, so weit, haben zahlreiche Berichte Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen von PMN-MPs5, was auf einen möglichen Kontext-, Krankheit - Arten- und Organ-spezifischen Rolle des m/s gezeigt.
In dieser Mitteilung beschriebenen Protokolle bieten eine kostengünstige, innovative und flexible Methode, um die Funktion des MPs in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Sie sind auf vielen Modellorganismen, Organe und Stimulation Bedingungen anwendbar. Sie ermöglichen die Identifizierung von mehreren Arten von m/s und können in Zukunft verwendet werden, um ihre Pro-inflammatorischen und Anti-inflammatory Funktionen. Als ein Beispiel beschrieben hier ist, wie man die Funktion von PMN-MPs in epithelialen Wunde heilen in Vitro und in Vivozu untersuchen. Die vorgestellten Protokoll zur Isolierung der Maus Knochenmark stammenden PMNs wurde mit einigen Änderungen von einem zuvor beschriebenen Methode6angepasst.
Darüber hinaus Protokolle in dieser Studie beschriebenen ermöglichen die Erkennung und Charakterisierung von spezifischen Marker, die auf PMN-MPs durch zwei komplementäre Methoden finden: Western blot und flow Cytometry. Wir finden, dass Immunoblotting der MPs mit Standardprotokollen5 ist einfach und zuverlässig, jüngste Fortschritte in der Empfindlichkeit der Flow Cytometry Instrumente und verbesserte Rauschsignal-Verhältnis jetzt können jedoch zur weiteren Analyse des MPs mit dieser Methode. Die beschriebenen Protokolle in dieser Studie zu integrieren, die jüngsten Fortschritte und Empfehlungen von original Forschungsartikel, einschließlich Änderungen an Zentrifugation Geschwindigkeit und Zeit, die Zugabe von Probe Filter- und Einfrieren/Lagerung Bedingungen7 , 8, und wie man das "Hintergrundrauschen" reduzieren, verbessern die Nachweisgrenze von PMN-MPs und unterscheiden können zwischen verschiedenen Größen der MPs.
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Protocol
Alle tierische Arbeit wurde von der nordwestlichen IACUC genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Richtlinien abgeschlossen. Für Probanden Blut zu Spenden wurde eine Einverständniserklärung vorgelegt und unterzeichnet; Darüber hinaus wurden alle Probanden in dieser Studie nach den institutionellen und Bundesrepublik Leitlinien für menschliches Wohlergehen behandelt.
Hinweis: Die Protokoll-Schritte sind unter den folgenden Abschnitten aufgeführt: (i) Maus Knochenmark Zelle isoliert; (Ii) PMN Isolation aus Maus Knochenmark; (Iii) PMN Isolation aus menschlichem Blut; (iv) MP Isolation von PMN Überstände (durch Ultrazentrifugation); (V) Charakterisierung der MPs durch Western Blot; (vi) Charakterisierung der MPs durch Durchflusszytometrie; (Viii) Anwendung der isolierten MPs auf Studie Wundheilung
1. Maus Knochenmark Zelle isoliert
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Dissektion des Femur und Tibia von den Hinterbeinen Maus
- Inhalation der Narkose eine Euthanasie-Box (z.B., ein Tipp-Feld leer 1 mL) vorbereiten. Fügen Sie ein paar Tropfen 100 % Isofluran auf ein steriles Tuch, mit Klebeband an der Innenseite der Deckel Kunststoff-Box. Gemäss neuen IACUC Richtlinien sollten Tiere nicht kommen in direkten Kontakt mit Isofluran, somit die Platzhalter ein Tipp zwischen Maus und die Gaze mit der Isofluran.
Hinweis: Isofluran ist eine leistungsstarke inhalativer Anästhetikum und sollte mit äußerster Vorsicht in einer Dampfhaube gehandhabt werden. - Einschläfern Sie Mäuse gemäß IACUC Empfehlung. Legen Sie eine Maus in der Euthanasie-Box im Schritt 1.1.1 für 1 – 5 min beschrieben, bis es nicht atmen mehr. Tod des Tieres durch Ausführen einer zervikalen Dislokation zu gewährleisten.
- Heben Sie die Verwendung von Edelstahl, 12 cm gebogen, Bauchhaut 0,17 mm X 0,1 mm Pinzette und schneiden Sie die Haut auf halbem Weg zwischen der oberen und unteren Extremitäten. Schälen Sie die Haut von hier aus zu den distalsten Teil der Maus Körper einschließlich der unteren Extremitäten. Mit 10 cm lang gerade Präparierscheren, entfernen Sie die Muskeln von den Hinterbeinen und verrücken Sie des Hüftgelenks Femur Kopf intakt.
- Mit einer Schere sezieren die Muskeln von Femur und Tibia und Femur von der Tibia zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Enden der Knochen intakt bleiben, da sie erhebliche Mengen an Knochenmark enthalten.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Fleisch durch Walzen die Knochen in einem Papiertuch. Legen Sie die sauberen Knochen in einer Petrischale mit serumfreien Medium (SFM, d.h.Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ohne Serum oder Antibiotika).
- Spülen Sie die Knochen in 70 % igem Ethanol und dann in SFM.
- 50 mL SFM in einem 50 mL konische Röhrchen vorzubereiten. In einer 10 mL Spritze laden Sie 10 mL SFM und verbinden Sie es mit einem 25 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel.
- Schneiden Sie das Ende der Knochen mit einer Schere, bis eine Öffnung an das Knochenmark (rötliche Farbe) sichtbar ist.
- Spülen Sie die Knochenmarkzellen in eine neue 50 mL Tube. Verwenden Sie eine 10 mL Spritze mit einer 26 und 5/8 Zoll-Gauge-Nadel mit ca. 3 mL/Knochen von SFM. Wenn fertig, Spülung, Aufschwemmen der Zellen in der Röhre durch Pipettieren (Verwendung Einweg 1 mL Kunststoff-Tipps) Zelle Aggregate zu brechen.
- Inhalation der Narkose eine Euthanasie-Box (z.B., ein Tipp-Feld leer 1 mL) vorbereiten. Fügen Sie ein paar Tropfen 100 % Isofluran auf ein steriles Tuch, mit Klebeband an der Innenseite der Deckel Kunststoff-Box. Gemäss neuen IACUC Richtlinien sollten Tiere nicht kommen in direkten Kontakt mit Isofluran, somit die Platzhalter ein Tipp zwischen Maus und die Gaze mit der Isofluran.
(2) PMN Isolation aus Maus Knochenmark
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Lyse der Erythrozyten
- Pellet-gesammelten Knochenmarks durch Zentrifugieren bei 350 X g für 8 min bei 4 ° C.
- Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL 0,2 % NaCl für ca. 20-30 s zur lyse des Erythrozyten-Anteil. Nicht mehr als 30 s als das PMN-Lyse führen. Geben Sie 20 mL von 1,6 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen.
Hinweis: Dieser Schritt kann zu sehr wenig PMN Aktivierung führen. - Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS und Zentrifuge wie in Schritt 2.1.1 oben. Den Überstand zu entfernen.
- Fahren Sie mit isolierenden PMNs durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung.
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Isolierung der Neutrophilen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
- Warme Polysucrose und Natrium Diatrizoate Lösungen, mit dichten 1,119 g/mL und 1,077 g/mL (siehe Tabelle der Materialien), auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch.
- Bereiten Sie Polysucrose und Natrium Diatrizoate Gradienten frisch, unmittelbar vor dem Knochenmark Zelle durch langsam Schichtung 3 mL der 1,077 g/mL Dichte Lösung über 3 mL der Lösung 1,119 g/mL Dichte in 15 mL konische Röhrchen vor.
Hinweis: Vorbereitung der gradient Lösung zu weit im Voraus wird in Vermischung der Schichten und schlechte Neutrophilenzahl Reinheit und Erholung führen. - Das Knochenmark Zelle Pellet in 1 mL eiskaltem PBS Aufschwemmen und überlagern die resultierende Zellsuspension auf die Polysucrose und Natrium Diatrizoate gradient (langsam, um zu vermeiden, Mischen der Schichten).
- Zentrifuge für 30 min bei 850 X g bei 25 ° C bei RT, ohne Bremse. Halten Sie die Reagenzien bei RT für wirksame Trennung von der Neutrophilen aus anderen Zellen im Knochenmark. Festlegen der Zentrifuge bei langsam Verzögerung für den Farbverlauf effizient gebildet und nach dem Zentrifugieren Schritt gewartet werden.
- Suchen Sie visuell mononukleären Zellschicht an der Schnittstelle von PBS und 1,077 g/mL Dichte Lösung (obere Schicht). Entfernen Sie diese Schicht und der Rest der Dichte Lösung ohne zu stören die PMN-Band.
- Sammeln Sie eine ganze PMN-Ebene und einige der zugrunde liegenden Polysucrose und Natrium Diatrizoate 1,119 g/mL Lösung in 15 mL Röhrchen mit einer Transferpipette.
Hinweis: Eine vollständige Entfernung der obersten Hautschicht wird die Reinheit der isolierten PMNs abhängen. - Top die Rohre mit gefilterten PBS (gefiltert durch einen 0,1 µm Pore Größe Filter) und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie die gebeizte PMNs mit 2 mL PBS mit Zentrifugation Bedingungen wie in Schritt 2.2.7.
- In 1 mL der gefilterten PBS Aufschwemmen und isolierten PMNs von Hemocytometer zählen.
Hinweis: Für diese Isolierung-Methode, die sich daraus ergebenden PMN Reinheit beläuft sich auf ~ 85-90 %, wie Durchflusszytometrie bewertet wurde. Die übrigen Fraktionen verunreinigen besteht hauptsächlich aus mononukleären Lymphozyten.
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PMN Stimulation induzieren MP Version
Hinweis: PMNs können freizugebende MPs mit diversen aktivierende Bedingungen, einschließlich N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), Phorbol-12-Myristate-13-Acetat (PMA) oder Interferon-Gamma (IFNγ) angeregt werden. Wichtig ist, sollte vor der Simulation, PMNs auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden.- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert Hank es ausgewogene Lösung (HBSS) Salzlösung, enthält das stimulierende Mittel der Wahl. Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.
Hinweis: Die folgenden Konzentrationen von Aktivatoren wurden erfolgreich im Einsatz in unserer bisherigen Arbeit: fMLF (0,5-1 µM für Mensch und von 2-5 µM für Maus PMNs), PMA (200 nM), und IFNγ (100 ng/mL). Wenn die Freigabe der vorher markierten MPs gewünscht wird, brüten unstimulierte PMNs (1-5 x 106) mit N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC (siehe Tabelle der Materialien) (1 µM in 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Führen Sie Schritte 2.3.1-2.3.3. - Spin-down bei 850 X g für 5 min bei 4 ° C, entfernen PMNs und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
- Fahren Sie für MP-Isolation von zellfreien Überstände mit Schritt 4.2.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert Hank es ausgewogene Lösung (HBSS) Salzlösung, enthält das stimulierende Mittel der Wahl. Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.
3. PMN Isolation aus menschlichem Blut
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Gesunde Probanden für Blut Extraktion nach institutionellen IRB Richtlinien zu rekrutieren.
- Sammeln Sie Blut aus dem Unterarm eines gesunden Freiwilligen in handelsüblichen 5 mL Natriumcitrat-haltige Rohre (siehe Tabelle der Materialien).
- Pipette 5 mL Dextran und Natrium-Diatrizoate-Lösung (Dichte von 1,113 g/mL, siehe Tabelle of Materials) in sterilen 15 mL-Tuben und langsam Schicht 5 mL frisch isolierte periphere Menschenblut oben drauf.
- Zentrifugieren Sie die Rohre für 50 min bei 400 x g bei RT (25 ° C) mit geringer Beschleunigung und keine Bremse.
- Am Ende der Zentrifugation entnehmen Sie Plasma und mononukleären Zellen (obere Schicht) mit einer sterilen Kunststoff Saug Pipette.
- Übertragen Sie die Unterschicht (PMNs) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,45 % NaCl, PMNs (Mischung gut und sanft durch das Rohr drehen).
- Zentrifuge für 10 min bei 400 X g bei 25 ° C.
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Lyse der Erythrozyten
- Gebeizte Zellen für 45 10 mL eiskaltem, sterilen Wasser hinzufügen s gefolgt von 10 mL eiskaltes sterile 1,8 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen.
Hinweis: Alle folgenden Schritte für PMN Isolierung sollte auf dem Eis zur Vermeidung von PMN Aktivierung und vorzeitige MP Version durchgeführt werden. Die Lyse Schritt selbst führt zu kleinen, aber nicht signifikant PMN-Aktivierung, jedoch ist es wichtig für die Isolierung von einer reinen PMN Bevölkerung für funktionelle Assays. - Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 250 X g bei 4 ° C mit weich abbremsen.
- Wiederholen Sie 3.2.1 und 3.2.2.
- Aufschwemmen PMNs in 5 mL eiskaltes HBSS ohne Kalzium und Magnesium. Insgesamt lebenden Zellen zu zählen (verwenden Sie einen Hemocytometer und Lebensfähigkeit Färbung bei 1:2 Verdünnung, siehe Tabelle of Materials) vor der Stimulation.
Hinweis: Isolierte PMNs sollte für Stimulation oder andere Experimente innerhalb 2 h nach Isolierung verwendet werden, um funktionelle und zellulären Veränderungen und Zelltod zu vermeiden.
- Gebeizte Zellen für 45 10 mL eiskaltem, sterilen Wasser hinzufügen s gefolgt von 10 mL eiskaltes sterile 1,8 % NaCl, Osmolalität wiederherzustellen.
4. MP Isolation von aktivierte PMN Überstände
Hinweis: Ein ähnliches Protokoll wird für die Isolierung von MPs von murinen und menschlichen PMNs verwendet.
- Pellet PMNs (300 x g, 5 min, 4 ° C) und in 0,1 µm Aufschwemmen gefiltert HBSS Lösung enthält das stimulierende Mittel der Wahl (für Beispiel 1 µM fMLF, siehe Hinweis: 2.3.1). Verwenden Sie für optimale Stimulation 100 µL Stimulation Lösung pro 10 Millionen PMNs für 20-30 min bei 37 ° C in 15 mL-Tuben.
- Folgenden Stimulation, spin-down aktivierten PMNs 600 X g für 5 min bei 4 ° C und zellfreie Überstände auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
- Zentrifugieren des PMN geclearte Überstands bei 13.000 x g, 10 min, 4 ° C Zelle Schutt zu entfernen und den geräumten Überstand in ein neues Ultrazentrifugen Rohr übertragen.
- Zentrifuge für 1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C. Überstände vor MP Speicher zu entfernen. Je nach Bedarf, pelleted Store MPs in Paraffin versiegelt Ultrazentrifugen Rohre bei-80 ° C bis zur Verwendung in Experimenten.
5. Prüfung der PMN-MPs durch westliche Beflecken
- Fügen Sie 1 % SDS Puffers (50-200 µL mit 100 mM Tris pH: 7,4), MPs pellet (aus Schritt 4.4), Transfer zum neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und lysierten MPs für 5 min kochen.
Hinweis: Die Anzahl der Abgeordneten und der Lyse Puffervolumen muss angepasst und optimiert für jedes Protein des Interesses. -
Laden Sie gleiche Mengen von PMN-m/s pro Lane im Ladepuffer enthalten 10 % β-Mercapto-Ethanol.
Hinweis: Mit unserer Methode laden wir MPs, die aus der gleichen Anzahl von stimulierten PMNs isoliert wurden.- Trennen der Lysates durch SDS-PAGE auf 10 % Polyacrylamid-Gel (verwenden Sie 50-100 V für 1-1,5 h) und total Proteinen auf Nitrocellulose-Membranen als beschriebenen9übertragen.
- Membranen für 1 h mit 5 % fettfreie Milch in 0,05 % Tween-20 Tris gepufferte Kochsalzlösung zu blockieren, und mit einer entsprechenden primären (über Nacht bei 4 ° C), gefolgt von HRP-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren.
- Visualisieren Sie die Bänder durch die Membran und der Exposition gegenüber einem Röntgenfilm in einem lichtdichten Kassette (1-24 h) Chemoluminescence-Lösung hinzufügen.
6. Prüfung von PMN-MPs durch Durchflusszytometrie
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Verdünnen Sie für Antikörper Färbung Antikörper entsprechend in FACS Puffer (PBS mit 0,1 mM EDTA, 0,1 % Natriumazid). Aufschwemmen pelleted PMN-MPs (abgeleitet von 1-3 x 106 PMNs/Zustand) in 100 µL Antikörper-Lösung.
- Wenn Annexin v Färbung, Aufschwemmen Sie gebeizte PMN-MPs in Annexin V-Puffer mit 5 µL FITC konjugiert Annexin V. Wenn mit Antikörpern Co Färbung, die gewünschten Antikörper (für ein Beispiel siehe Tabelle of Materials) direkt die Annexin V Projektmappe hinzufügen. Fügen Sie fluoreszierende Lipid Farbstoff, N-(2-aminoethyl) Maleimide (siehe Tabelle der Materialien), bei 1 µM-Konzentration in 100 µL der FACS-Puffer zu kennzeichnen und identifizieren von MPs.
- MPs in Färbelösung für mindestens 20 min bei 4 ° c inkubieren
- Waschen der MPs durch Ultrazentrifugation (1 h bei 100.000 x g bei 4 ° C); verwerfen Sie den überstand.
- Im FACS Puffer Aufschwemmen und laufen die Proben auf einem ausgewiesenen Durchflusszytometer, ausgestattet mit einer aktualisierten elektronischen Einheit für erhöhte Empfindlichkeit (siehe Tabelle der Materialien).
7. Anträge auf isolierte PMN-MPs, PMN-Funktion bei der Wundheilung zu studieren
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In Vivo Verabreichung von PMN-MPs an Kolon Wunden
- Betäuben Sie Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg). Bestätigen Sie Betäubung durch Pedal Reflex (feste Zehe Prise) und passen Sie bei Bedarf.
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Bauch und mit 28 cm Biopsiezangen und ein Endoskop mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet (z. B. ein Veterinär Endoskop für die Verwendung von kleinen Tieren, siehe Tabelle der Materialien), generieren von 3-5 oberflächliche Wunden an der dorsalen Seite des die Kolon. Nach Abschluss der Verwundung Rückkehr Mäuse zu einem Käfig platziert auf einer kontrollierter Temperatur (37 ° C) Matte bis erholt.
- Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben. Verwenden Sie ein Endoskop Bilder zugefügten Wunden 24 h (Tag 1) Post-Verwundung zu erwerben. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.
- Zur gleichen Zeit (24 h nach Verwundung) verabreichen Sie murinen PMN-m/s 2 x 106 PMNs in 100 µL HBSS + direkt in jede Wunde mit einer Koloskopie-basierte Mikroinjektion System (Verwendung einer 29-G-Nadel)9abgeleitet. Drei Tage später (4. Tag nach Verwundung) Mäuse (wie in Schritt 7.1.1) zu betäuben und verwenden Sie ein Endoskop, um Bilder der Wundheilung zurückzukaufen. Mäuse wie in Schritt 7.1.2 erholen zu lassen.
- Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), sichtbare Wunde Gliederungsbereiche im erworbenen Bilder, Maßnahme der Bereich der gleichen Wunde an Tag 1 und 4 nach Verwundung und berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss.
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Menschliche epithelialen Zellen in Vitro Wundheilung
- Graf Caco-2 BBe oder T84, menschlichen intestinalen Epithelzellen durch Hemocytometer und Samen 5 x 105 Zellen/gut in Kultur 24-Well-Platten. Inkubieren Sie die Zellen in einer Kammer standard Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2. Caco-2 BBe oder T84 erreichen Konfluenz innerhalb 48 h9. Zu Kultur Epithelzellen, DMEM und DMEM-F12 (50: 50) mit Ergänzungen wie zuvor beschrieben,9.
- Mechanische kratzen Wunden in der Monolage mit einer Pipettenspitze generieren und niedrige Saugleistung wie oben beschrieben4,9. Abrufen von Bildern der Wunde Bereiche unmittelbar nach Kratzen mit einem invertierten Phasenkontrast-differential Interferenz Mikroskop (Einsatz 5 X oder 10 X Ziele), verwendet werden als eine Zeit = 0 Bezugspunkt.
- Zerkratzt-verwundet Epithelzelle Monolagen Abgeordneten (abgeleitet von 2-4 X 106 PMNs) hinzu, und inkubieren Sie für weitere 24 h (48 h nach Verwundung, bei 37 ° C mit 5 % CO2). Zu diesem Zeitpunkt neu erwerben Sie Bilder von Grund auf neu-Wunden.
- Bevorzugte Bildanalyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) messen Wunde Bereiche bei t = 0 und t = 48 h. berechnen den Prozentsatz der Wundverschluss durch die Bestimmung des Unterschied im Wundbereich zu ausgewählten Zeitpunkten.
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Representative Results
Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse von MPs, das wurden isoliert von Mensch und Maus PMNs sind in Abbildung 1dargestellt. Die Größe Heterogenität der PMN-MPs im Vergleich zu bekannten großen Perlen wie in Abbildung 1A, B für menschliche MPs. Note bewertet werden kann, wurden keine signifikanten Unterschiede in Größe Heterogenität zwischen Maus und Mensch MPs beobachtet. Ebenso kann mit Durchflusszytometrie und Fluoreszenz Kennzeichnung, Ausdruck von Protein/s der Wahl von isolierten MPs Maus oder menschlichen Ursprungs bestimmt werden. Zum Beispiel Ausdruck von Phosphatidyl-Serin (PhS) untersucht werden kann durch Annexin V Färbung. Murine Knochenmark sind in Abbildung 1C, DPMN-MPs dargestellt. Ausdruck mehrere Marker der Wahl kann auch beurteilt werden, wie für Annexin V und CD11b Färbung des menschlichen Abgeordnete, Abbildung 2A, Bgezeigt. Eine andere Methode, PMN-MPs von Durchflusszytometrie zu erkennen ist, frisch isolierte PMNs vor Stimulation wie in Abbildung 2Czu beflecken. Beispielsweise können PMN Färbung mit der Lipid-Marker N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC vor fMLF Stimulation führt zu der Veröffentlichung der grünen Abgeordneten, das leicht durch Strömung erkannt werden. Der Hinweis wurde während der Färbung mit N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC zuvor verwendet zu kennzeichnen und m/s, die von peripheren Menschenblut10 erhalten oder Tiere11, die Verwendung von anderen Markern für die Kennzeichnung Zwecken injiziert wurden zu erkennen in Vitro oder in Vivo Anwendung sollte von jedem Prüfer bestimmt werden. Neben der Durchflusszytometrie können PMN-MPs durch Immunoblotting für interessierender Proteine analysiert werden. Wie in Abbildung 3, m/s abgeleitet von menschlichen PMNs, die mit mehreren bekannten Aktivatoren angeregt wurden, wurden für den Ausdruck des Schlüssels entzündliche untersucht (Matrix Metallopeptidase 9 (MMP-9) und Myeloperoxidase (MPO)) und Anti-inflammatory (Annexin A1) Moleküle. So offensichtlich von repräsentativen Immunoblots, PMN Stimulation mit IFNγ (50 ng/mL), PMA (200 nM), und fMLF (1 µM) in m/s mit dem Ausdruck unterschiedlicher MMP-9 geführt. Einzige Störung des Aktin-Zytoskeletts von Latrunculin B (1 µM) vor Stimulation mit fMLF (5 µM) führte jedoch zu reichliche Vorhandensein von MPO in PMN-MPs. In ähnlicher Weise wurden unterschiedliche Ebenen von Annexin A1 (hoch, keine Erkennung) auf m/s nach den beschriebenen aktivierenden Bedingungen entdeckt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PMN-MP Zusammensetzung Stimulus abhängig ist.
Schließlich, wie isolierte PMN-MPs zur Untersuchung Wunde Abbildung 4 zeigt heilende in Vitro und in Vivo Kolon Verletzungen. PMN-MPs können Kratzer verwundet epithelialen Monoschichten in Kulturen, hinzugefügt werden, wo Heilung überwacht werden kann durch bildgebende Erwerb zu vorher festgelegten Zeitpunkten. M/s können weiter direkt ins Kolon Wunden, die durch Biopsiezangen und endoskopische Bildgebung9generiert wurden, mikroinjiziert werden und ihre Wirkung auf die Heilung beurteilt werden kann. Für die in Vitro und in Vivo Analyse der Wundheilung, sind Bilder der zugefügten Wunden sofort nach Verwundung (oder sonst wie angegeben) erworben und ständig durch den Heilungsprozess zu vorher festgelegten Zeitpunkten. Verwendung von handelsüblichen Bildanalyse-Software, Änderungen im Wundgebiet (Größe) gemessen und verwendet, um die Wunde Schließung Rate bestimmen. Anwendung von PMN-MPs, die MPO entweder enthalten kultiviert epitheliale Monolagen oder in Vivo , Kolon Wunden hat nachteilige Auswirkungen, führt zu verzögerter Heilung9.
Abbildung 1 . Analyse von PMN-MP Größe und Oberflächenmarker von Durchflusszytometrie. (A) Durchflusszytometer optimiert Steuerung Perlen (siehe Tabelle der Materialien) von bekannten Größen und Scatter-Werte werden in der SSC und FSC orthogonale Darstellung angezeigt. Die Perlen werden verwendet, um einen relativen Größenvergleich mit einer PMN-MP-Probe b gezeigt bekommen (B) menschlichen PMN-MPs wurden isoliert und analysiert durch Durchflusszytometrie, die Nutzungsbedingungen für die Perlen beschrieben. Die Heterogenität in MP Größen kann gesehen werden. (C–D) M/s fMLF stimuliert murinen Knochenmark PMNs abgeleitet wurden von Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentative Flussdiagramme zeigen ungefärbten (C) oder Annexin V-FITC gebeizt (D) m/s. rechteckige Fläche zeigt Annexin V-positiven MPs (FITC-Positive m/s). SSC: Side Scatter; FSC: Forward Scatter; PhS: Phosphatidyl-Serin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . PMN-MP Färbung und Analyse von Durchflusszytometrie. (A) Unstained und (B) Annexin V-FITC - und hCD11b-APC-gefärbten MPs. Square Gegend umschließt eine Annexin V/CD11b doppelt positiven Bevölkerung von PMN-MPs. (C) frisch isolierte menschliche PMNs (1 x 106) wurden mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt , N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC und mit fMLF stimuliert. M/s von Zelle Überstände isoliert waren und von Durchflusszytometrie analysiert. Rechteckiger Bereich umschließt eine N-(2-aminoethyl) Maleimide-FITC positive MP Bevölkerung (M-FITC, Beschriftung Y-Achse). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Zusammensetzung der PMN-MPs ist Reiz abhängig. (A) Human PMNs wurden mit IFNγ, TNF, fMLF, PMA, oder eine Kombination aus Latranculin B, gefolgt von fMLF (LtB-fMLF) angeregt. M/s wurden von den daraus resultierenden Zelle Überstände durch Ultrazentrifugation isoliert und Protein Lysates in 1 % SDS Puffer bereit waren. Proteine wurden getrennt nach Größe in ein 10 % Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und für eine MMP-9, MPO oder Annexin A1 Primärantikörper, gefolgt von der entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper sondiert. (B) repräsentative Elektronenmikroskopie Bilder des menschlichen PMN-MPs zeigen Größe Heterogenität. Eine Exosom < 100 nm Größe wird durch den weißen Pfeil angezeigt. Maßstabsleiste = 250 nm (linken und rechten Panels). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Die Verwendung von isolierten PMN-MPs in der Untersuchung der Rolle von PMNs in epitheliale Wundheilung. (A) Caco-2 BBe, die menschlichen intestinale Epithelzellen überzogen waren, confluency, Kratzer verwundet und m/s abgeleitet von 3 Millionen PMNs, die hinzugefügt wurden sofort nach Verwundung unterzogen. Repräsentative Bilder zeigen Wundverschluss (48 h nach Verwundung) Kontrolle (linken Panels) und PMN-MP-behandelten Epithelzellen (richtigen Platten). Maßstabsleiste = 100 µm. (B) untersuchen die Wirkung von PMN-MPs auf Kolon Wunde heilen in Vivo, isolierte PMN-MPs wurden direkt in das Wundgebiet ein Endoskopie-basierte Mikroinjektion System injiziert (24 h nach Verwundung, die Darmspülung Wunde ist beschrieben durch eine gestrichelte Linie und die Injektion Einführungsstelle wird durch einen weißen Pfeil angezeigt). Wundverschluss war bewerteten 3 Tage später (4 Tage nach Verwundung) durch endoskopische Bildgebung. Maßstabsleiste = 300 µm. (C) 4 Tage nach Verwundung Mäuse wurden eingeschläfert und Kolon Schleimhaut Wunden mit einer Schere extrahiert, eingebettet in die optimale Temperatur (O.C.T) Verbindung und mit flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Acht Mikrometer Abschnitte der Wunden waren voller Flecken, für E-Cadherin (grün) und den nuklearen Fleck DAPI (blau) für die Bewertung des Re Epithelisierung (oberen Platten) oder für DAPI (blau) und Ki67 (rot), total und wuchernden Epithelzellen zu visualisieren die Wunde Kante (untere Platten). Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von PMN-abgeleitete MPs werden in dieser Mitteilung beschrieben. Mehrere wichtige kritische Punkte müssen für den Erfolg des Verfahrens berücksichtigt werden. Erstens muss PMNs frisch isoliert und in Experimenten innerhalb 2 h der Isolation verwendet, um zu verhindern, dass die spontane Aktivierung und Degranulation. Alle Behandlung der PMNs während Isolierung und bis zu dem Punkt der Stimulation muss auf Eis, Aktivierung und vorzeitige MP Version12zu verhindern durchgeführt werden. Zweitens: Ultrazentrifugation für 1 h oder mehr maximiert die Pelletierung MPs. dritten, für die Analyse von Durchflusszytometrie, das Gerät muss ordnungsgemäß kalibriert werden, mit einer Mischung aus Instrument angegeben fluoreszierenden Perlen (Perlen-Art passt zu einem bestimmten Instrument), MP-Größen korrekt zu definieren. Zum Beispiel während eines Herstellers von fließen Cytometers empfiehlt die Verwendung von FSC-Perlen als größenbezogenen Parameter, wurden andere für SSC Perlen optimiert. Darüber hinaus muss das Durchflusszytometer für MP-Analyse verwendet werden mit verbesserte Elektronik ausgestattet werden, am besten MPs von den Hintergrundgeräuschen lösen.
Um richtig MPs neben Größenparameter identifizieren, empfiehlt sich die Verwendung von Fluoreszenz-Färbung, wie in den oben genannten Verfahren beschrieben. Darüber hinaus sollten alle Lösungen bei der Vorbereitung und Isolierung durch gefiltert werden durch ein 0,1 µm-Filter-System zur Minimierung der Aufnahme von Staubpartikeln oder anderen Ausscheidungen, die die Geräuschkulisse während der Akquisition steigert Durchflusszytometrie. Wichtig ist, sollte die Lagerbedingungen der m/s betrachtet werden. Wenig Beweise8und unsere eigene unveröffentlichten Beobachtungen legen nahe, dass MP Einfrieren zu Membran Bruch und MP Bruch führt. Schließlich können unterschiedliche PMN Aktivierungsbedingungen und Timing ändern und MP Ertrag verbessern.
Es gibt einige Einschränkungen für diese Methode. Isolierung der Maus PMNs aus dem Knochenmark ist in der Regel nicht rein (~ 85-90 %) und ist von anderen Immunzellen (in erster Linie mononukleären Lymphozyten) kontaminiert, wie von durchflusszytometrischen Analyse bestimmt war. So können die daraus resultierende Isolate kleine Mengen von MPs freigegeben durch andere Immunzellen gehören. Alternativen stehen zur Verfügung und umfassen Isolierung von PMNs von im Handel erhältlichen magnetische Beads, dies wäre jedoch eine längere und eine deutlich teurere Verfahren. Schließlich ist ohne Fluoreszenz Kennzeichnung neben Größenparameter, endgültige Differenzierung der MPs vor Staub oder andere lösliche oder in der Luft Partikel ähnlicher Größe, die die Probe verunreinigen kann schwierig und fehleranfällig.
In der Zukunft helfen Sortierung von PMN-MPs mit spezifischer Marker beschriftet MP Zusammensetzung unter Sonderbedingungen stimulierende oder Modellen der Erkrankung aufzuklären, und hoffentlich ermöglichen den Einsatz von MPs als diagnostische Marker und mögliche therapeutische Ziele zu behandeln entzündlichen Erkrankungen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt jeglicher Art im Zusammenhang mit dieser Mitteilung
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die technische Hilfeleistung des Dr. Suchitra Swaminathan, die den nordwestlichen Feinberg School der Medizin Flow Cytometry Kern läuft. Finanzierung sorgte (NIH) DK101675.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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