Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Полуавтоматические рабочего процесса представлен целевой последовательности 16S рРНК от материнского молока и других видов биомассы температура образца.

Abstract

Исследования микробных сообществ стали широко с развитием виртуализации сравнительно недорогой, быстрый и высокой пропускной способности. Однако как с всеми этими технологиями, воспроизводимые результаты зависят от лаборатории рабочий процесс, который включает в себя надлежащие меры предосторожности и контроля. Это особенно важно с низким биомассы образцов, где заражения бактериальной ДНК может генерировать заблуждение результаты. Эта статья подробно описывает полу автоматизированный рабочий процесс для идентификации микробов из образцов молока груди человека с помощью целенаправленных последовательности региона V4 16S рибосомная РНК (рРНК) низкого и среднего throughput масштабе. Протокол описывает пробоподготовки от цельного молока в том числе: образца лизиса, извлечения нуклеиновой кислоты, усиление V4 региона гена 16S рРНК, и библиотека с мерами контроля качества. Важно отметить, что протокол и обсуждения рассмотреть вопросы, которые характерных для подготовки и анализа образцов низкой биомассы, включая соответствующие позитивные и негативные элементы, ПЦР ингибитор удаления, пример загрязнения окружающей среды, реагент, или экспериментальных источников и экспериментальной наилучшей практики, призванные обеспечить воспроизводимость. В то время как протокол, как описано для образцов человеческого молока, он адаптируется к многочисленные типы биомассы низкого и высокого образца, включая пробы на палочки, замороженные аккуратные, или стабилизации в буфере сохранения.

Introduction

Считается, что микробных сообществ, которые колонизировали людей являются критически важным для здоровья человека и болезнь влияющих на метаболизм, иммунных развития, восприимчивость к болезням и ответы на вакцинацию и наркотики терапия1, 2. подчеркнуть усилия, чтобы понять влияние микробиоты на здоровье человека в настоящее время идентификации микробов, связанные с определенными анатомическими отсеков (т.е., кожи, кишечника, Оральный секс, и т.д.), а также локализованные сайты в рамках Эти отсеки3,4. Лежащие в основе этих следственных усилий является быстрое появление и увеличение доступности технологий следующего поколения последовательности (НГС), которые предоставляют массивно параллельной платформу для анализа содержания микробных генетических (микрофлора) образца. Для многих физиологических образцы, связанные микрофлора комплекс и обильные (то есть, стул), но для некоторых образцов, микрофлора представлена низкими микробной биомассы (то есть, человеческое молоко, нижних дыхательных путей) где чувствительность, экспериментальных артефактов и возможного загрязнения становятся основным вопросам. Общие проблемы исследований микрофлора и соответствующий экспериментальный дизайн были предметом нескольких обзор статей5,6,,78.

Представленные здесь надежные экспериментальные трубопровода NGS основан на целевые последовательности рРНК 16S V4 региона9 характеризовать микрофлора грудного молока. Анализ микрофлора грудного молока сложен не только низких микробной биомассы10, но дополнительно высокий уровень ДНК человека фон11,12,13,14 и потенциальные уноса ПЦР ингибиторы15,16 в извлеченной нуклеиновых кислот. Этот протокол основывается на коммерчески доступных извлечения наборы и полуавтоматические платформ, которые могут помочь свести к минимуму колебаний через образец подготовки пакетов. Она включает в себя четко определенных бактериальных макет сообщество, которое обрабатывается вместе с образцами, как контроль качества проверяет каждый шаг в протоколе и обеспечить независимый метрики надежности трубопроводов. Хотя протокол как описано специфичен для образцов материнского молока, он легко адаптируется для других образцов типов включая стула, ректальные, вагинальные, кожи, рыхлой и устные тампоны10,17и может служить отправной точкой для Исследователи, которые желают выполнять анализ микрофлора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для всех шагов протокол должны носить надлежащего средства индивидуальной защиты (СИЗ), и подходы к профилактике строгие загрязнения должны быть приняты. Наблюдать поток работ от предварительного усиления работы после усиления работы районы для сведения к минимуму загрязнения образцов. Все источники, используемые стерильные, без РНКазы, DNase, ДНК и пирогена. Все наконечники фильтруются. Схема шагов протокола предусмотрено (рис. 1).

1. образец Lysis

Примечание: Образец лизис и извлечения нуклеиновых кислот, выполняются с использованием комплект экстракции ДНК/РНК в среде чистый номер где как технических, так и процедурные элементы управления находятся в место для сведения к минимуму введение экологических бактерий образцы.

  1. Подготовка области работы
    1. Очистить область с соответствующей поверхности пылесоса для устранения любого загрязнения нуклеиновой кислоты работы кабинета по биобезопасности (BSC).
    2. Включите Вортекс регулируемой температурой и установите его в 37 ° C.
  2. Подготовка Гуанидиновые тиоцианат литического буфера (см. таблицу материалы)
    1. Проверьте литического буфера для осадков. Повторно распустить преципитаты потепления на 37 ° C.
    2. Подготовка 600 мкл буфера lysis с 6 мкл β-меркаптоэтанол (β-ME) для каждого образца. Рассмотрим дополнительный объем 20% на сэмпл.
  3. Подготовка образца
    1. Если заморожен цельного молока, оттепели его на льду. Аликвота 5 мл состава молока в 15 мл или 5 мл стерильной в BSC и держать его на льду.
    2. Спиновые 5-мл молока, кратные 10 мин на 5000 x g при 4 ° C до Пелле клетки.
    3. Удалить слой жира, теперь верхний слой в трубу, с пластиковой лопаточкой или большой родила наконечник пипетки.
    4. Не нарушая гранулы, удалите все супернатант за исключением 100 мкл.
    5. Помыть лепешка, resuspending в 1 мл стерильного фосфатный буфер (PBS).
    6. Подготовьте 1 отрицательный контроль путем добавления 1 мл стерильного PBS в 5-мл.
    7. Передача подвеска для пластиковых чистой 1.5 мл пробирок и спина в microcentrifuge за 1 мин (5000 x g при комнатной температуре (RT)).
    8. Используйте кончик стерильного отфильтрованного пипеткой 1000 мкл отбросить весь слой супернатант/жирных.
    9. Если не извлечение в тот же день, оснастки заморозить клетка Пелле, поставив его в суспензии этанола/сухой лед и немедленно перевести его в морозильник-80 ° C.
  4. Пример нарушения и гомогенизации (шарик избиение)
    1. 600 мкл буфера lysis, содержащих β-ME Пелле и передачи подвеска к трубе шарик.
    2. Каждый пакет экстракции 12 содержит 10 образцов, 1 отрицательный контроль (подготовленных на шаге 3.7 выше) и 1 положительный контроль (подготовлен на следующем шаге).
      1. Подготовка 1 положительный контроль с буфера lysis и 20 мкл бактериальных образца макет (макет сообщества используется имеет концентрацию, однажды извлечены, приблизительно 0,2 нг/мкл ДНК).
    3. Вихревой все шарик трубы энергично для 15 s.
    4. Образцы тепла на контролируемой температурой Вортекс при 37 ° C за 10 мин, с тряску при 700-800 об/мин.
    5. Загрузить трубы в набор адаптеров disruptor автоматической выборки.
    6. Шарик избили за 1 мин на 30 Гц.
    7. Разбирайте адаптер набор и вручную переключить адаптер с образца пластины из левой манипулятор присвоено право манипулятор инструмента.
    8. Шарик бить еще 1 мин на 30 Гц.
    9. Пробирок на 17 200 x g, за 3 мин при 25 ° C.
    10. Удалите все супернатант с 200 мкл пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не получить любую из жировой слой в верхней части образца или шарик остаточного в нижней части образца и применяются к столбцу гомогенизатора.
    11. Центрифуга гомогенизатор столбцы на максимальной скорости, 17 200 x g, за 3 мин при 25 ° C.
    12. Передача 350 мкл элюата производителем 2-мл пробирку microcentrifuge для использования с помощью автоматизированного инструмента для очистки ДНК и РНК (не использовать любой другой трубки). Будьте осторожны, чтобы не передавать любые остаточные жировой слой.
    13. Если объем потока через менее чем 350 мкл, добавьте буфер lysis с β-ME окончательный объем 350 мкл.
    14. Оставить образцы на RT для до 2 ч перед нуклеиновой кислоты изоляции с помощью автоматизированного инструмента очищения ДНК, или заморозить при температуре-80 ° C.
  5. Очистка области работы
    1. Чистой все поверхности в использовать раствором неферментативного обеззараживания, оставить на 10 мин, а затем спрей с 70% этанола и протрите поверхность.

2. изолировать ДНК/РНК

  1. Подготовка области работы
    1. Включите блок тепла и установите температуру до + 70 ° C.
    2. Включите Вортекс регулируемой температурой и установите температуру до 37 ° C.
    3. Разминка Элюирующий буфер (EB), содержащий 10 мм трис-Cl, рН 8,5, в 50-мл трубку до 70 ° C.
    4. Разминка 350 мкл лизатов замороженных образцов в 2 мл пробирок при 37 ° C до тех пор, пока полностью разморозить без любой преципитат (примерно 10 минут).
  2. Очистка ДНК
    1. Вортекс и центрифуги, 2 мл пробирок с образца кратко (3000 x g 10 s).
    2. Вставка 2 мл трубки в шейкере после автоматизированных ДНК/РНК очистки инструмента загрузки диаграммы, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Получить ротора адаптеров и установить их на лоток, основанный на количество выборок.
    4. Этикетке каждого ротора адаптер на основе образца (идентификация).
    5. Cut off крышками и сглаживания отдельных спин столбцов для ДНК и РНК.
    6. Вставьте столбец спин ДНК без трубки коллекции в адаптер ротора. Выбросите коллекции трубки.
    7. Ярлык 1,5 мл коллекции трубок и вставьте в ротор адаптеров.
    8. Набор адаптеров ротора в центрифуге после автоматических ДНК/РНК очистки инструмента загрузки диаграммы.
    9. Вставьте наконечник стойки производителя 1000 мкл-советы фильтр.
    10. Добавьте бесплатно РНКазы воды производителем 2-мл пробирку microcentrifuge основанный на количество выборок (на специальных машинных команд протокола).
    11. Вставьте трубу в слот «A» пробки microcentrifuge трубки слотов.
    12. Отменить любые реагента, что осталось в бутылки реагента и заполнить с минимальным объемом 10 мл.
    13. Вставьте реагент бутылки в стойку бутылка реагента (за исключением EB бутылка).
    14. Добавьте теплой EB от 50 мл реагента бутылка позицию 6.
    15. Проверка 1.5 мл пробирок, плотно помещаются в ротор адаптеров.
    16. Закройте крышку инструмент и выберите: «РНК» → «добыча комплект» → «Животных, тканей и клеток» → «kit имя 350 мкл часть A Custom ДНК» → редактировать элюции тома µL 100 (по умолчанию) или 50 мкл для низких биомассы образцы → «начать».
    17. Когда закончите, удалите ротор переходников из центрифуги и разместить их на лоток.
    18. Удалить столбец спин ДНК от ротора адаптер позиции 3.
    19. НЕ выбрасывайте ротор адаптеров, РНК находится в положении 2.
    20. Удаление 1,5 мл коллекции пробирки, содержащие eluted дна в позиции 3 и хранить в −20 ° C.
    21. Соберите образца содержащие трубы от шейкер и хранить в −20 ° C, если любой образец осталось, в противном случае отмены.
    22. Продолжите с протоколом «kit имя 350 мкл часть B РНК» для дальнейшей очистки РНК.
    23. РНК будет осуществляться из примерно 350 проточный мкл, который находится в среднем положении ротора адаптеров.
  3. РНК
    1. Вставьте столбец спин РНК без его коллекции пробки и крышки в адаптер ротора.
    2. Ярлык новый 1,5 мл трубки для сбора и вставить их в ротор адаптер, как указано в руководстве.
    3. Набор адаптеров ротора в центрифуге после автоматических ДНК/РНК очистки инструмента загрузки диаграммы.
    4. Закройте крышку инструмент и выберите: «РНК» → «Производителя комплект» → «Животных, тканей и клеток» → «Стандартные части B РНК» → «Старт».
    5. После завершения удаления адаптеров ротор из центрифуги и разместить их на лоток.
    6. Удалить столбец спин РНК от позиции 3.
    7. Удаление 1,5 мл коллекции пробирки, содержащие 30 мкл этого eluted РНК в позиции 3 и хранить в −80 ° C.
    8. Удаление реагент бутылки.
    9. Распоряжаться ротора адаптер содержимое по каналам соответствующих опасных отходов.
  4. Чистой рабочей станции
    1. Спрей всех автоматизированных ДНК/РНК очистки инструмента аксессуары, такие как реагент стойки, лоток и любой другой поверхности в использовать раствором неферментативного обеззараживания, оставить на 10 минут и промыть деионизированная вода (DI), а затем дайте высохнуть.
    2. Спрей автоматизированный инструмент с единственным производителем одобрил решение неферментативного обеззараживания, протрите внутри центрифуги вместе со всех поверхностей в, оставить на 10 минут, а затем протрите с 70% этиловом спирте. Не используйте другие виды очистки решения, как они могут повредить прибор.

3. целевые 16S ПЦР Set-up

Примечание: Установка для ПЦР 16S осуществляется в рабочем места для предварительного усиления расположен в чистой комнате. Реагенты и образцы подготавливаются и затем загружены на жидких обработчик выполнять ПЦР для каждого образца, в трех экземплярах (30 образцов, которые включают в себя истинный образцы и извлечения положительной и отрицательной контроля, плюс 2 ПЦР воды контроля в трех экземплярах, в общей сложности 96 Комбинированные примеры и элементы управления). После реакции PCR собираются и опечатаны, пластину образца передается тепловая велосипедист, расположен в районе после усиления для езды на велосипеде.

  1. Подготовка области работы
    1. Очистите рабочую станцию ПЦР. Спрей, который всех поверхностей в с ДНК РНКазы, DNase, decontaminant, следуют DI воды два раза и, наконец, этанол 70%.
    2. Подготовьте лист ПЦР 16S (см. целевые 16S ПЦР листа) с точный список и назначить различные перепутываются Праймеры для каждого образца9. Распечатайте лист и пластины карты (см. пластина 1).
  2. Подготовка мастер смесь ПЦР
    Примечание: 16S грунтовка выбор основан на области интереса для конкретного исследования и может изменить тип исследования или образец. Таким образом перед заказом грунты, важно подтвердить, какие области 16S рРНК лучший усиливает микробы интерес для конкретного исследования. Этот протокол, как написано предназначен для усиления 16S V4 региона. Если выбраны различные грунтовки или региона, отжига температура тепловой Велоспорт могут потребовать корректировки.
    1. Работа в Рабочая станция PCR подготовить все.
    2. Взять 50-100 µL пробы ДНК от-20 ° C и все необходимые реагенты и размораживать их на льду. Вортекс и кратко вращаться вниз.
    3. Праймеры предварительно разбавляют до рабочей концентрации 5 мкм в минимальный объем 20 мкл.
    4. Подготовка мастер смесь ПЦР в конкретных 5 мл грунтом только вперед согласно вычисления на листе.
  3. Подготовка обработчик роботизированной жидкость для автоматической установки PCR
    1. Для образцов вывезти инструмент 32-ну пример адаптер и загрузить 50-100 µL пробы ДНК согласно карте 96-луночных пластины согласно инструкциям производителя.
      1. Для каждой пластины ПЦР созданная 2 негативный контроль размещения 30 мкл воды ПЦР в чистый образец трубки.
      2. Поместите все образцы на 32-ну инструмент образца адаптер с шапки, заблокированы в открытом положении.
    2. Для обратного грунтовки9
      1. Снять крышку каждого обратного грунт с конкретными штрих-код # 's один в то время (смена перчаток между ними, чтобы избежать перекрестного загрязнения).
      2. Место максимум 32 грунтовки на инструмент реагент адаптер.
    3. Возьмите плиту 96-луночных ПЦР и метку с именем исследования, количество образцов, Дата и инициалы техник.
    4. Загрузка обработчик роботизированной жидкость
      1. Поместите адаптер реагента в позиции B1. Для того, чтобы избежать эффекта края, тщательно место один край адаптер против стороны сцепление и медленно принести другой край вниз. Убедитесь в том, добиваться на всех углах адаптеров.
      2. Поместите адаптер образца в позиции C1. Убедитесь в том, добиваться на всех углах адаптеров.
      3. 5-мл мастер перемешать, открыть крышку и поместите его в положение A на инструмент мастер смеси и реагента блока.
      4. Место пластину ПЦР на 96-луночных инструмент адаптер, который предназначен для держать половина обогнул ПЦР планшетов.
      5. Запустить запустить и сохранить в новый файл.
      6. Следуйте подсказкам и флажок каждой строки: одну, советы доступны, два, отходов поле доступно, и три, начать.
    5. После завершения запуска, убедитесь, что не было никаких ошибок, проверив машину для сообщений об ошибках.
    6. Печать пластину с 12 или 8 газа шапки, вихревой энергично и спина вниз за 1 мин, с использованием 96-луночных пластины spinner и поместите его на льду или в холодильнике.
    7. Удаление пробирки, содержащие обратный грунты и образцы.
    8. Возьмите 96-луночных пластины в комнате после усиления и загрузить пластину на тепловая велосипедист и цикла согласно таблице Велоспорт тепловых условий (см. таблицу 1).

4. целевые 16S пост ПЦР контроля качества с помощью ленты на основе платформы для электрофореза геля

Примечание: Пост-ПЦР контроля качества (КК) и все последующие шаги осуществляются в заданном районе после усиления лаборатории. В автоматическом анализаторе фрагмент ДНК/РНК анализируется ДНК.

  1. Подготовка области работы
    1. Очистите рабочую станцию, распыления, decontaminant всех поверхностей в с РНКазы, DNase, ДНК, следуют DI воды два раза и, наконец, на 70% этиловом спирте.
    2. Соберите все материалы и оборудование, необходимое.
  2. Подготовка реагентов
    1. Место буфер образца и лестница в Вортекс регулируемой температурой при 25 ° C для минимум 30 мин.
  3. В то время как прогревается реагентов, подготовьте ПЦР пробы путем объединения 3 реплицирует ПЦР для каждого образца в одну трубу
  4. Загрузить образцы на инструменте.
  5. Кратко вихря и спин вниз трубы с совместного продукта PCR.
  6. Поместите инструмент 96-луночных пластину на стойку в RT и измените его метку.
  7. Кратко вихря и спином вниз буфер образца и лестница.
  8. Добавьте 3 мкл пример буфера в каждой скважине 96 хорошо пластины (необходимо по крайней мере 53 мкл/экран лента).
  9. Запуск четное количество образцов; Если есть нечетное количество выборок, добавьте 4 мкл пример буфера в пустой колодец.
  10. Хорошо добавьте 1 мкл лестницы лестница.
  11. После карты, добавить 1 мкл пуле ПЦР продукта его назначенный хорошо.
  12. Крышка с печать фольгой
  13. Вихрь пластину с помощью инструмента Вортекс и адаптер при 2000 об/мин за 1 мин.
  14. Спиновые вплоть до позиции, которую образца в нижней части трубки, если есть пузырьки спин вниз снова.
  15. Запуск программного обеспечения.
  16. Загрузите экрана ленты и загрузки советы в инструмент.
  17. Загрузить образцы в анализаторе фрагмент с 96-луночных адаптер.
  18. Настройка запуска с помощью программного обеспечения контроллера.
  19. Убедитесь в том выбрать четные скважин.
  20. Напишите пример идентификаторы.
  21. Проверьте, что все скважины ленты экрана, выделены серым цветом.
  22. Убедитесь, что анализатор признает все наконечники.
  23. Выберите Пуск и укажите имя файла для сохранения результатов (исследование имя, образец номера и дату).
  24. Обратитесь к инструкции производителя для получения более подробной информации.
  25. После завершения запуска утилизируйте наконечник, экран ленты и трубки.
  26. Анализ данных для 16S пик Нм (между 315-450 bp для V4). Этот пик будет варьироваться в зависимости от выбранного грунтовки.

5. Библиотека расчет, объединение, очистки и КК

  1. После определения размера ампликон и Молярность всех образцов, бассейн библиотек для достижения конечного желаемого объема и Нм для объединения библиотеки (см. Пример расчета).
  2. Clean-up и концентрат, Объединенные библиотеки с помощью очистки на основе кремния мембраны комплект для продуктов ПЦР, по словам производителя протокола (см. Таблицу материалы).
    1. Элюировать ДНК с окончательный объем 50 мкл.
  3. Измерьте концентрацию уборка библиотеки сразу, используя двойной мель ДНК высокой чувствительности комплект для флуориметр, согласно протоколу производителя.
    1. Развести 2 мкл пуле и уборка библиотеки с 198 мкл буфера для разведения плюс краситель (разбавления 1: 100).
    2. Запись измеряемых от флуориметрический устройства и преобразовать его согласно коэффициент разрежения.
  4. При концентрации, чтение (нг/мкл) для объединения библиотеки, вычислить Молярность библиотеки в Нм. Использование 1 мкл неразбавленном библиотека для измерения OD260/280 на microvolume спектрофотометром.
    Примечание: 1.8-2.0 значение надлежащей чистоты библиотеки.
  5. Храните окончательный библиотека при-20 ° C до готовности для следующего поколения последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленные здесь протокол включает важные контроля качества (КК) меры для обеспечения что встречаются данные критерии для протокола управления чувствительность, специфичность и загрязнения. Протокол первого шага КК следует амплификации PCR 16S V4 региона (рис. 2). Один мкл ПЦР продукта от каждого образца была проанализирована методом электрофореза, чтобы подтвердить, что он был в пределах ожидаемого размера 315-450 bp (рис. 2, красная стрелка). Некоторые образцы человеческого молока генерируется нижнюю конкретного продукта (рис. 2A, сравнить дорожки 3 и 9-11 с полосы 4-8), предлагая либо низкий уровень извлечения микробной ДНК в этих образцов, или перенос ПЦР ингибиторов во время извлечения. Для образцов, которые производят меньше чем 2.0 Нм продукта в диапазоне bp 315-450 (рис. 2A, переулок 7), ПЦР ингибитор очистка осуществляется с помощью комплекта один шаг и образец снова усиливается. Успех ставки для восстановления амплификации образца после очистки составляет примерно 40%. Количественный конкретного продукта для каждой выборки (рис. 2B) имеет важное значение для определения его объема равных Молярная объединения образцов для виртуализации. Обобщённые библиотека для целевой последовательности обычно доминируют конкретный продукт PCR (рис. 3). Если есть значительное количество неспецифической продукта в библиотеке, шаг очищение геля следует добавить в рабочий процесс.

В этом примере, представлены на рисунке 2A, слабый полос наблюдаются для контроля буфера (до н.э.; полос 2 и 12) и ПЦР воды отрицательный контроль (PC; переулок 1), указанием возможного загрязнения окружающей среды или реагента. Такие группы не редки и обычно представляют собой небольшое количество продукта PCR (например, < 1 Нм) и производят несколько чтения графов во время виртуализации (< 1000). Результаты представителя последовательности (рис. 4) подтверждают, что эти образцы действительно имеют очень низкий последовательности чтения графов (Рисунок 4A, полос 1 и 11; Рисунок 4B, буфера и ПЦР воды полос) и, главное, состав таксонов для образцов элемента управления отличается от образцов человеческого молока (рис. 4A, сравнить дорожки 1 и 11 с полосы 2-10). Высокий чтения графов в негативный контроль, а также пересекается в составе таксонов между элементами управления и образцы, предлагает перекрестного загрязнения и необходимость совершенствования загрязнение контроля.

Результаты секвенирования (рис. 4) демонстрируют высокое разнообразие в таксонов, связанные с микрофлора грудного молока и изменчивость числа последовательности чтения графов для каждого образца (рис. 4A, полосы 2-10). В отличие от последовательности результаты для бактериального макет обрабатываемых наряду с образцов материнского молока продемонстрировал таксонов состав и читать графов, которые были сопоставимые результаты, полученные для макета в предыдущих запусков рабочего процесса (Сравните Рисунок 4A , переулок 12 с Рисунок 4B, макет полосы). Согласованные результаты для макет полосы указывают наблюдаемой изменчивости для образцов молока аутентичные экспериментальный результат, а не функция встроенных рабочих процессов изменчивости.

Figure 1
Рисунок 1: схема конвейера секвенирования 16S целенаправленных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: контроль качества анализа 16S V4 ампликонов. (A) гель образ 16S V4 ампликонов решена путем электрофореза с помощью автоматического анализатора фрагмент ДНК/РНК. 16S V4 ампликонов были получены согласно Caporaso и др. 9и один мкл каждого продукта PCR был проанализирован с помощью ДНК реагенты высокой чувствительности согласно рекомендациям производителя. Большинство человеческих образцов молока (полос 3-6 и 8-11) и бактериальных макет (переулок 13) производства основного продукта ПЦР на ожидаемый размер приблизительно 400 bp (красная стрелка). Образец материнского молока в переулок 7 не производят значительное количество конкретного продукта и был предметом очистки и повторного усиления. Минимальное продукт был обнаружен для ПЦР отрицательный контроль (PC, переулок 1), и буфера lysis негативный контроль (BC, полосы 2 и 12) указано минимальное загрязнение в анализируемых образцов. МВт, молекулярный вес маркеры: верхний красный и Нижняя зеленые полоски определить 1500 bp и 25 bp размер маркеров, соответственно, в каждом ряду. (B) Top Electropherogram Лейн 3 от геля в (A). Основной продукт PCR попадает в области пик, определенной красный вертикальные полосы и состоит из фрагментов размером от 299-497 bp, что приводит к среднего размера продукта PCR 396 bp. Gating делается на немного шире диапазон, чем размер ожидаемого ампликон (i n это дело 315-450 bp) не забудьте включить весь образец пик. Верхняя и Нижняя вершины коррелируют с фрагмент размерами 25 bp и 1500 bp, соответственно. Дно: диаграммы, подведение итогов параметров размера для региона пик, концентрация в нг/мкл ПЦР продукта в пределах региона пик и Молярность в Нм для конкретного продукта PCR. Затем эта информация используется для расчета, сколько каждого образца будет выполняться в равных Молярная библиотеки для виртуализации (см. Пример расчета). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Electropherogram библиотеки пула и концентрированные секвенирования. Количество отдельных образцов секвенировать равных Молярная были объединены в пуле библиотеку. Библиотека была затем очищены и сосредоточены на суммарный объем 50 мкл, с использованием на основе кремния мембран PCR очистить комплект. Заключительная подготовка библиотеки для секвенирования на следующее поколение sequencer был проведен по данным производителя протокол. Эта библиотека успешно был секвенирован несмотря на присутствие дополнительных полос. Если существует озабоченность по поводу продуктов ПЦР вне ожидаемый размер диапазона, производителя протокол предполагает добавление шага выбора размера гель. Этот шаг КК обычно не выполняется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Оценка негативные и позитивные элементы. (A) относительного обилия бактериальной таксонов извлечения пакета с элементами управления и образцов материнского молока. Как мера КК композиции каждого извлечения пакета загрузки на автоматизированный инструмент очистки ДНК/РНК формируются сразу же после запуска последовательности. Номера в каждом баре образца указывают количество отфильтрованных операций чтения для соответствующего образца. Композиции буфера элементы управления отличаются от образцов материнского молока. (B) относительного обилия бактериальной таксонов в буфер, макет и элементы управления ПЦР. Количество операций чтения и состав вычисляются для всех негативных (буфер и ПЦР воды) и положительный (бактериальный макет) элементов управления. Композиции из буфера и воды различаются, но макет сообщества остается довольно стабильной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Целевые секвенирование нового поколения 16S рРНК методика широко используется, быстрое микрофлора характеристика18. Однако многие факторы, включая пакет эффектов, загрязнение окружающей среды, пример перекрестного загрязнения, чувствительность и воспроизводимости может отрицательно повлиять на экспериментальные результаты и смешал их интерпретации7,19 , 20. наилучшим образом содействовать надежной 16S анализы, микрофлора процессы должны включать хороший экспериментальный дизайн, использование надлежащего контроля, пространственной сегрегации в шаги рабочего процесса и применения передовой практики. Описанные здесь протокол включает в себя каждый из этих параметров и обеспечивает важные экспериментальные инструменты для решения вышеуказанных проблем и реализации рабочем 16S для различных образцов.

Хороший экспериментальный дизайн имеет решающее значение для анализа 16S микрофлора. Это включает в себя надлежащего сбора и хранения образцов, а также выбор 16S Праймеры для региона интерес. Например регионе V4 (515F/806R) выбран для материнского молока, потому что она имеет хорошее усиление бифидобактерии, которая играет важную роль в развитии новорожденных кишки микрофлора21. Другие наборы грунтовка (например, 27F/338R, 515F/926R) может быть более подходящим для исследования других микробных сообществ. Важное примечание это отжига температура для целевых 16S ПЦР и ожидаемый ампликон размер может меняться в зависимости от грунтовка выбора.

Другие места, что протокол может быть изменен основаны на результатах шагов КК, включены в рабочий поток. Для устранения неполадок при обнаружении нет или мало ДНК после шаг амплификации PCR целевых 16S существуют несколько вариантов. 1) образца можно положить через PCR ингибитор удаления шаг. Усилители, следующие ПЦР ингибитор удаления с помощью комплекта один шаг выполняется за производителя протокол успешно примерно сорок процентов времени, 2) более извлечь ДНК могут быть добавлены к целевой 16S PCR, или 3) новых и потенциально более Алиготе молока может быть обработана, если таковые имеются. Если существует озабоченность по поводу продуктов ПЦР вне диапазона ожидаемый размер после очистки на основе кремния мембраны библиотеки, шаг очищение геля могут быть добавлены. Наконец КК шаги имеют решающее значение для определения, если есть доказательства загрязнения, который подробно рассматривается ниже. Если обнаруживается значительное загрязнение, в зависимости от того, где вводится загрязнение, либо PCR можно повторить или в случае необходимости, образец может быть повторно извлеченные. К счастью с надлежащей лабораторной практики, это редкие события. Наконец в то время как этот протокол написаны, чтобы выделить предостережения в усилители низкой биомассы образцов и конкретно молоку, протокол можно легко изменить для амплификации устные, ректальные, вагинальные и кожи тампоны или губки, а также стул. Если выбраны другие типы образцов, затем рассматривается вопрос извлечения наборы являются оптимальным для конкретного образца типа.

Пакетное эффекты обусловлены наборы, реагенты или последовательность работает являются важными источниками изменчивости в исследованиях микрофлора. Наборы экстракции ДНК, наряду с других реагентов, имеют низкий уровень бактериальной ДНК, которая может существенно варьироваться много20,,2223,24. Для крупного проекта, используя один много комплектов материалов, реагентов, выбрав наборы, призванные свести к минимуму загрязнение комплект может упростить анализ7. Образцы как субъектов, так и элементы управления обрабатываются бок о бок. Это лучше, если все образцы для проведения одного исследования, как предмет и управления, могут быть включены в одной последовательности запуска. Если большое количество образцов должны обрабатываться в пакетах, образцы, которые являются репрезентативными как субъектов, так и элементы управления включены в каждой партии и обрабатываются вместе. Важно также организовать пакетной обработки для сведения к минимуму загрязнения образцов низкой биомассы (например, молока), образцы, которые являются высокая биомасса (то есть, стул). В таких случаях процесс низком биомассы примера типы первый, а затем высокой биомассы для того же исследования.

Низкая биомассы образцы представляют уникальные проблемы для микрофлора исследования, как загрязнение окружающей среды, реагенты, инструментов, и исследователь может сделать его трудно отличить Аутентичные сообщества членов, присутствующих в низкой изобилие7 , 25 , 26 и те, которые искусственно вводятся для образца через экспериментальный процесс19. Рабочий процесс описан здесь включает в себя важные экспериментальные негативный контроль как шаг подготовки образца (только для буфера lysis управления), так и ПЦР шаг (ПЦР воды управления) (см. Рисунок 4). Эти элементы управления помогают выявлять источники загрязнения и способствовать эффективные меры по исправлению положения на скамейке или в silico27,28,29,30. Негативный контроль тщательно оцениваются и сообщил результаты исследования7.

Чтобы свести к минимуму загрязнение, пространственной сегрегации экспериментальной деятельности в чистой pre-PCR амплификация области и после усиления области имеет важное значение. Оптимально, чистой комнате площадью как для подготовки мастер смесь ПЦР и образец подготовки/Добавление мастера смешивать области и может включать отдельный мертвый воздух ящик или шкаф биологической безопасности жилья выделенный расходных материалов и мелкое оборудование необходимы для подготовка Мастер микс. Чистая комната дизайн включает в себя позитивные воздуха система с высокой эффективностью фильтрации твердых частиц воздуха (HEPA). Использование средств индивидуальной защиты имеет важное значение для поддержания управляемой, низкий микробной среде и включает в себя автоклаву, халатах, перчатки, и бахилы. Наборы/реагенты и образцы, идеально хранятся в отдельный выделенный холодильников/морозильников. ПЦР установки осуществляется также в чистой комнате в назначенных рабочих станций; четкое разделение грунтовка запасов и реагенты от ДНК сохраняется до тех пор, пока образцы загружаются на платформу автоматизированного дозирования. После завершения установки ПЦР пластина переданы области после усиления и погружены тепловая велосипедист.

Важно ограничить поток трудовой деятельности от чистых районов после усиления районы; Существует нет ретроградного движения реагентов, инструментов или поставок из районов после усиления в чистой зоне. Персонала, которые введены в любой из областей после усиления запрещен въезд в область чистой за 24 часов (пока на следующий день). Помимо приведенных выше соображений рабочего процесса очистки протоколы должны быть реализованы в как чистые, так и после усиления областях, чтобы свести к минимуму загрязнение нуклеиновой кислоты рабочих поверхностей и инструментария. Если не возможны физические барьеры или отдельные комнаты, все усилия должны приниматься для работы в областях как далеко врозь как можно скорее.

Помимо загрязнения микрофлора исследований оспариваются, чувствительность, изменчивость и воспроизводимость31. Этот протокол адреса эти вопросы путем включения определенных бактериальных макет сообщества, которая добывается, усиливается и виртуализированных наряду с каждой партии образцов (см. рис. 4b). Этот элемент управления обеспечивает постоянное внутреннюю ссылку, которая оценивает воспроизводимость экспериментальные результаты, полученные и может быть использован для устранения проблем, которые возникают. Например качество макет ДНК может обеспечить метрики для эффективного образца лизис и экстракции ДНК, какие элементы управления геномной ДНК пропустить. Контроль качества ампликонов ПЦР для макет образца может также указывать ПЦР эффективность и специфичности. Кроме того потому что макет включает в себя несколько типов бактерий, относительной чувствительности для пакета обработанных образцов может быть выведено представление таксонов в последовательности результатов пробный образец. Идеальный макет сообщество будет оценивать способность обнаруживать основных бактериальной видов в отсеке анализируются, и таким образом состав макет сообщества может потребоваться отличаться от исследования. Как показано на рисунке 4a, существует значительная вариабельность результатов секвенирования, но последовательность результатов для бактериальных макет сообщества высокую воспроизводимость (см. рис. 4b).

В то время как макет сообщества на рисунке 4 представляет собой уникальную смесь 33 штаммов из комбинации коммерчески доступных и местные клинических изолятов, коммерчески доступных макетов сообщество недавно был развитых32.

Хотя рабочего процесса, описанного здесь ограничен в своей способности широко адрес воспроизводимость через исследования различных микрофлора, она обеспечивает важный экспериментальный подход, который позволяет исследователям включать соответствующие экспериментальные элементы управления и воспроизводимость монитора в пределах их собственных результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Helty Adisetiyo, PhD и Ян Shangxin, PhD для развития протокола. Общая поддержка для международного материнской педиатрических подростков СПИДа клинических испытаний группы (IMPAACT) была представлена в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) из национальных институтов здравоохранения (НИЗ) под номерами премии UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) и UM1AI106716 (IMPAACT LC), при совместном финансировании от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека (NICHD) и Национальный институт психического здоровья (NIMH). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 133 16S рибосомной РНК микрофлора секвенирование нового поколения грудное молоко молоке низкий биомассы
Метод для последовательности целевых 16S образцов материнского молока
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter