Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem

Published: March 23, 2018 doi: 10.3791/56974
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Summary

Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Abstract

Çalışmalar mikrobiyal toplulukların nispeten ucuz, hızlı ve yüksek işlem hacmi sıralama gelişimi ile yaygın hale gelmiştir. Ancak, tüm bu teknolojileri ile gibi tekrarlanabilir sonuçlar birleştirmek uygun önlemler ve denetimleri bir laboratuvar iş akışı üzerinde bağlıdır. Bu özellikle düşük-biyokütle örnekleri ile nerede bakteriyel DNA kirletici yanıltıcı sonuçlar üretebilir önemlidir. Bu makalede mikroplar insan meme süt örneklerinden bir düşük - için orta - throughput ölçekte 16S ribozomal RNA (rRNA) V4 bölgesinin hedeflenen sıralama kullanarak tanımlamak için yarı otomatik bir iş akışı ayrıntıları. Tam yağlı süt de dahil olmak üzere gelen numune hazırlama protokolünü açıklar: örnek lizis, nükleik asit ayıklama, amplifikasyon 16S rRNA gen ve Kütüphane hazırlık kalite kontrol önlemleri ile V4 bölgesinin. Önemlisi, protokol ve tartışma belirgin hazırlama ve analiz düşük-biyokütle örnekleri de dahil olmak üzere çevre, reaktif tarafından uygun pozitif ve negatif kontrol eder, PCR inhibitörü kaldırma, örnek kirlenme konuları göz önünde bulundurun veya deneysel kaynakları ve tekrarlanabilirlik sağlamak amacıyla tasarlanan deneysel en iyi yöntemler. Açıklandığı gibi protokol insan sütü örnekleri için belirli ise, harika veya koruma arabellekte stabilize donmuş temizleme bezi, toplanan örnekleri de dahil olmak üzere çok sayıda düşük ve yüksek biyokütle örnek türleri için uyarlanabilir.

Introduction

İnsanlar kolonize mikrobiyal toplulukların insan sağlığı ve hastalığı etkileyen metabolizma, bağışıklık geliştirme, duyarlılık hastalık ve aşı ve ilaç tedavisi1, yanıt için önemli olduğuna inanılan 2. microbiota insan sağlığı üzerindeki etkisi şu anda anlamak için çaba vurgulamak ile tanımlanmış anatomik bölmeleri (Yani, deri, bağırsak, oral, vb), yanı sıra yerelleştirilmiş sitelerle ilişkili mikroplar tanımlaması Bu bölmeler3,4. Araştırmacı bu çabalarına destek hızlı ortaya çıkması ve mikrobiyal genetik içeriği (microbiome) analiz için bir örnek kitlesel paralel bir platform sağlayan yeni nesil sıralama (NGS) teknolojilerin artan erişilebilirlik olduğunu. Pek çok fizyolojik örnekleri için karmaşık ve bol ilişkili microbiome (Yani, dışkı), ancak, bazı örnekler için microbiome tarafından düşük mikrobiyal biyokütle (Yani, insan sütü, alt solunum yolu) nerede temsil edilir duyarlılık, deneysel eserlerin ve olası bulaşma önemli konular haline. Microbiome çalışmaları ve uygun deneysel tasarım ortak sorunları birden çok gözden makaleler5,6,7,8konu oldu.

Burada sunulan sağlam bir NGS deneysel boru hattı insan sütü microbiome karakterize rRNA 16S V4 bölge9 hedeflenen sıralama üzerinde temel alır. İnsan sütü Microbiome analizi değil karmaşık sadece bir doğal olarak düşük mikrobiyal biyokütle10, ama Ayrıca tarafından yüksek düzeyde insan DNA'sı11,12,13,14 arka plan ve potansiyel ertelenmiş ayıklanan nükleik asit PCR inhibitörleri15,16 . Piyasada bulunan ayıklama kitleri ve örnek hazırlama toplu işlemleri arasında değişkenlik en aza indirmeye yardımcı yarı otomatik platformlar bu protokolü kullanır. O örnekleri protokol her adımda doğrulamak ve boru hattı sağlamlık'bağımsız bir ölçü sağlamak için kalite kontrol işlenir iyi tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleştirmek. İletişim kuralı olarak açıklanan insan sütü örnekleri özgü olsa da, bu tabure, rektal, vajinal, Cilt, areolar ve sözlü temizleme bezi10,17de dahil olmak üzere diğer örnek türleri kolayca uyarlanabilir ve için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir microbiome analizleri gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm iletişim kuralı adımlar için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır ve sıkı kirlilik önleme yaklaşımlar alınması gerekir. Kirlenme örneklerin en aza indirmek için sonrası amplifikasyon çalışma alanları için alanları iş akışını öncesi amplifikasyon işten gözlemlemek. Kullanılan tüm malzemeler steril, ücretsiz RNase, Dnaz, DNA ve pyrogen. Tüm pipet ipuçları süzülür. Bir akış protokolü adımlardan (şekil 1) sağlanır.

1. örnek lizis

Not: Örnek lizis ve nükleik asit ayıklama mühendislik ve yordam denetimleri yerine çevre bakteri giriş örnekleri en aza indirmek için nerede bir temiz oda ortamında bir DNA/RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. Temiz Biyogüvenlik Kabini (BSC) çalışma alanı herhangi bir nükleik asit kirlenme ortadan kaldırmak için uygun yüzey temizleyici ile.
    2. Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° C'ye ayarlayın
  2. Guanidinium thiocyanate lizis arabellek hazırlamak (tablo malzemeleri görmek)
    1. Lizis arabellek precipitates için kontrol edin. Precipitates 37 ° C'de ısınma tarafından yeniden dağıtılması
    2. 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) ile lizis tamponunun 600 µL her örnek için hazırlayın. Bir ekstra % 20 birim başına örnek göz önünde bulundurun.
  3. Numune hazırlama
    1. Tam yağlı süt donmuş, buz çözme. Aliquot 5 mL bütünün 15 mL veya BSC bir 5 mL steril tüp içine süt ve buz üzerinde tutun.
    2. 5-mL süt aliquot 5000 x g 4 ° C'de hücreler cips için de 10 min için spin.
    3. Yağ katman kaldırmak için şimdi tüp, plastik spatula ile veya büyük üst katmanda pipet ucu delik.
    4. Pelet bozmadan, tüm süpernatant 100 µL dışında kaldırın.
    5. Pelet 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspending tarafından yıkayın.
    6. 1 negatif kontrol steril PBS 1 mL 5 mL tüp ekleyerek hazırlayın.
    7. Süspansiyon temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarmak ve bir microcentrifuge 1 dk (oda sıcaklığında (RT) 5000 x g) için spin.
    8. 1000 µL steril süzülmüş pipet ucu tüm süpernatant/yağ katmanı iptal etmek için kullanın.
    9. Ayıklama aynı gün kendine değil dondurursanız hücre bir etanol/kuru buz Bulamaç koyarak cips ve hemen-80 ° C dondurucu transfer.
  4. Örnek bozulma ve homojenizasyon (Boncuk atan)
    1. β-ME için Pelet içeren lizis arabelleği 600 µL ekleyin ve süspansiyon bir boncuk tüp aktarın.
    2. Her ayıklama toplu 12 10 örnekler, 1 negatif kontrol (3.7 yukarıdaki hazır) ve (bir sonraki adımda hazırlanan) 1 olumlu denetim içerir.
      1. 1 pozitif kontrol lizis arabellek ve bakteriyel sahte örneği (kullanılan sahte bir kez hulâsa, bir konsantrasyon, DNA'ın yaklaşık 0.2 ng/µL kuran) 20 µL hazırlayın.
    3. Girdap tüm tüpler 15 için şiddetle boncuk s.
    4. 700-800 rpm'de sallayarak ile ısı kontrollü vortexer 10 dk, 37 ° C'de ısı örnekleri.
    5. Tüpler otomatik örnek topu bağdaştırıcı kümesi yükleyin.
    6. Boncuk 30 Hz değerinde 1 dk. için yendi.
    7. Adaptör seti sökmeye ve el ile geçiş adaptörü ile örnek plakalar sol robotik kol araç şu robot kol için ayarla.
    8. Boncuk için başka bir 1 dk 30 Hz'de yendi.
    9. Santrifüj tüpleri için 25 ° C'de 3 dk 17,200 x g de
    10. Tüm süpernatant değil almak birisi örnek veya boncuk üstündeki yağ tabakasının örnek dibinde kalan ve bir homogenizer sütun için geçerli için dikkatli olmak bir 200 µL pipet ile kaldırmak.
    11. Homogenizer sütun maksimum hızda, 17,200 x g, 25 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi
    12. DNA ve RNA (herhangi bir diğer tüp kullanmayın) arıtma için otomatik araç ile kullanmak için bir 2 mL üreticinin microcentrifuge tüp eluate 350 µL aktarın. Herhangi bir kalıntı yağlı katman aktarmak için dikkatli olun.
    13. Akış yoluyla birim daha az 350 µL ise, β-ME ile lizis tampon 350 µL son bir hacim için ekleyin.
    14. Örnekleri RT için en fazla 2 saat devam etmeden önce otomatik DNA arıtma aleti kullanarak nükleik asit yalıtım için terk veya-80 ° C'de dondurmak
  5. Çalışma alanını Temizleme
    1. Temiz tüm yüzeylerde enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın sonra % 70 etanol ile sprey ve yüzey silin.

2. izole DNA/RNA

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. Isı blokta açın ve 70 ° c sıcaklık ayarlayın
    2. Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın
    3. 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, 50 mL tüp ile 70 ° c içeren elüsyon arabellek (EB) sıcak
    4. 350 ısınmak donmuş örnek lysates 2 mL tüpler 37 ° c kadar tamamen µL çözdürülen herhangi bir çökelti (yaklaşık 10 dakika).
  2. DNA arıtma
    1. Girdap ve 2 mL tüpler ile örnek kısaca santrifüj (3000 x g 10 için s).
    2. 2 mL tüpler otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik, üreticinin yönergelerini başına takip shaker içine yerleştirin.
    3. Rotor adaptörleri almak ve onları örnek sayısına göre tepsi kurmak.
    4. Örnek'ın kimliği (ID) göre her rotor adaptör etiketleyin.
    5. Kapakları kesme ve DNA ve RNA için bireysel spin sütunları kenarlarını düzeltmek.
    6. DNA spin sütun koleksiyon tüp olmadan rotor adaptör yerleştirin. Toplama tüp atmak.
    7. Koleksiyon tüpler 1,5 mL etiketleyip rotor adaptör yerleştirin.
    8. Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.
    9. Üretici 1000 µL filtre-ipuçları ipucu raflar yerleştirin.
    10. 2-mL üreticinin microcentrifuge Tube (başına belirli makine Protokolü yönergeleri) örnek sayısını temel alan RNase free su ekleyin.
    11. Tüp boru yuvaya microcentrifuge tüp Slots "A" takın.
    12. Reaktif şişeleri ve 10 mL minimum hacmi ile doldurun kalan herhangi bir reaktif atmak.
    13. Reaktif şişe raf (hariç EB şişe) Reaktif şişe takın.
    14. Sıcak EB reaktif şişe pozisyon 6 50 mL tüp sizden ekleyin.
    15. Onay 1,5 mL tüpler rotor adaptörleri sıkıca yerleştirilir.
    16. Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "ekstraksiyon kiti" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Kit'in adı 350 µL bölümü A özel DNA" → düzenlemek elüsyon birime 100 µL (varsayılan) veya düşük biyokütle örnekleri → için 50 µL "Start."
    17. Tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarın ve onları tepsiye yerleştirin.
    18. Rotor adaptör pozisyon 3 DNA spin sütundan atmak.
    19. Rotor adaptörleri atmayın, RNA pozisyonu 2.
    20. Pozisyon 3 eluted DNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −20 ° C.
    21. Herhangi bir örnek üzerinde aksi takdirde atma bırakılırsa örnek içeren tüpler shaker ve −20 ° C, deposunda toplamak.
    22. Protokolü "Kit'in adı 350 µL Bölüm B RNA" RNA'ın daha fazla arıtma ile devam edin.
    23. RNA arıtma yaklaşık 350 µL akışı-rotor adaptörleri orta konumda olan aracılığıyla üzerinden yapılacaktır.
  3. RNA arıtma
    1. RNA spin sütun koleksiyon tüp ve kapak olmadan rotor adaptör yerleştirin.
    2. Yeni 1,5 mL tüpler koleksiyonu etiket ve el kitabında belirtildiği gibi rotor adaptör ekleyebilirsiniz.
    3. Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.
    4. Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "Üretici Kit" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Standart bölümü B RNA" → "Başlangıç."
    5. Rapor tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarmak ve tepsiye koyun.
    6. RNA spin sütun 3 konumdan atmak.
    7. 3 konumundaki 30 eluted µL RNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −80 ° C.
    8. Reaktif şişe kaldırın.
    9. Rotor adaptör içeriği uygun tehlikeli atık kanallar aracılığıyla atın.
  4. Temiz iş istasyonu
    1. Tüm otomatik DNA/RNA arıtma gerecin aksesuarları, reaktif raflar, tepsi ve diğer herhangi bir yüzey gibi enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın ve ile durulayın sprey (DI) su deiyonize sonra koyup kuruyuncaya kadar bırakın.
    2. Enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm sprey otomatik araç ile sadece üretici onaylanmış, santrifüj ile birlikte kullanılan tüm yüzeyler içini silin, 10 dakikadır bırakın ve % 70 etanol ile silin. Araç zarar verebilir dekontaminasyon çözümlerin diğer türleri kullanmayın.

3. hedeflenen 16S PCR Set-up

Not: Kurulum 16S PCR için belirlenen ön amplifikasyon çalışma alanı temiz oda içinde bulunan gerçekleştirilir. Reaktifler ve örnekleri hazırlanan ve PCR nüsha (96 toplam nüsha gerçek örnekleri ve ayıklama pozitif ve negatif kontrolleri artı 2 PCR su kontrol dahil 30 örnekleri, her örnek için gerçekleştirmek için sıvı işleyicisi üzerine yüklenen kombine örnekleri ve denetimleri). PCR reaksiyonları toplandı ve kapalı sonra örnek plaka bisiklet için bir sonrası amplifikasyon bölgesinde yer alan bir termal cycler transfer edilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. PCR iş istasyonunuzu temizledikten. Sprey bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, takip ve sonunda % 70 etanol.
    2. 16S PCR çalışma hazırlama (bkz: hedefli 16S PCR çalışma) bir doğru örnek liste ve ata farklı barkodlu astar her örnek9. Çalışma sayfası ve (bkz: plaka 1) plaka haritalar yazdırın.
  2. PCR ana karışım hazırlama
    Not: 16S astar seçimi belirli çalışma için ilgi bölge dayanır ve çalışma veya örnek türüne göre değişebilir. Bu nedenle, astar siparişi vermeden önce bu 16S rRNA en iyi hangi alanda ilgi belirli çalışma için mikropların yükselterek onaylamak önemlidir. Yazılı olarak bu 16S V4 bölge amplifikasyon için iletişim kuralıdır. Farklı astar/bölge seçilmişse, termal Bisiklet tavlama sıcaklığı ayar gerektirebilir.
    1. Her şeyi hazırlamak için PCR iş istasyonu içinde çalışmak.
    2. 50-100 µL DNA örnekleri-20 ° c ve gerekli tüm Kimyasalları almak ve onları buz çözme. Girdap ve kısa bir süre spin aşağı.
    3. Astar 5 mikron 20 µL en küçük bir birim içinde çalışma konsantrasyonu için önceden seyreltilmiş.
    4. Yalnızca çalışma sayfasında hesaplama göre ileri astar ile belirli 5 mL tüp ana PCR karışımında hazırlayın.
  3. Robot sıvı işleyicisi otomatik PCR kurulum için hazırlanıyor
    1. Örnekleri, 32-şey gerecin örnek adaptörü almak ve 50-100 µL üretici yönergelerine göre 96-şey plaka haritaya göre DNA örnekleri yükleyin.
      1. Her PCR plaka için temiz örnek tüpte 30 µL PCR su koyarak 2 negatif denetimlerini ayarlayın.
      2. Tüm örnekleri açık konumda kilitli kapaklar ile 32-şey gerecin örnek bağdaştırıcısında yerleştirin.
    2. Ters astar9 için
      1. Belirli Bar kod içeren her ters astar kapağını çıkarın #'tek bir seferde (değişiklik eldiven arasında çapraz bulaşma önlemek için).
      2. En fazla 32 astar gerecin reaktif bağdaştırıcısında yerleştirin.
    3. 96-şey PCR tabak almak ve çalışma adı, örnek numarası, Tarih ve teknisyen baş harfleri ile etiketleyin.
    4. Robot sıvı işleyicisi yükleme
      1. Reaktif adaptör B1 bulunduğu yer. Bir kenar efekti önlemek için dikkatli bir şekilde bağdaştırıcı kavrama tarafına karşı bir kenarına yerleştirin ve yavaş yavaş diğer kenarına getirmek. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.
      2. Yer konum C1 örnek adaptör. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.
      3. Girdap 5 mL ana mix, kapağı açın ve pozisyon a cihazın ana mix ve reaktif blok üzerine yerleştirin.
      4. PCR plaka yarı etekli PCR plakaları tutma amaçlı 96-şey gerecin bağdaştırıcısında yerleştirin.
      5. Çalıştır başlatın ve yeni bir dosya olarak kaydedin.
      6. Yönergeleri izleyin ve onay işaretini her sorulduğunda: bir, ipuçları vardır, iki, atık kutusu kullanılabilir ve üç, başla.
    5. Çalışma tamamlandıktan sonra hata iletileri için makine kontrol ederek hiçbir hataları olduğunu doğrulayın.
    6. 12 veya 8 şerit kapaklar, girdap ile plaka şiddetle, mühür ve bir 96-şey plaka spinner kullanarak 1dk için spin aşağı ve buz üzerinde veya buzdolabında yerleştirin.
    7. Ters astar ve örnekleri içeren tüpler kaldırın.
    8. 96-şey plaka sonrası amplifikasyon odasına götürün ve termal cycler ve döngüsü (bkz. Tablo 1) termal Bisiklete binme koşullardan tabloya göre tabağa yükleyin.

4. hedeflenen 16S Post-PCR kalite kontrol Jel Elektroforez için teyp tabanlı platformu kullanarak

Not: Post-PCR kalite kontrol (QC) ve tüm sonraki adımları laboratuar bir belirlenmiş sonrası amplifikasyon alanda yapılmaktadır. DNA otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisinde analiz edilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. İş istasyonu bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, ardından püskürtme ve % 70 etanol tarafından nihayet temiz.
    2. Tüm malzeme ve ekipman gerekli toplamak.
  2. Reaktifler hazırlamak
    1. Örnek arabellek ve merdiven 30 dk en az 25 ° c ısı kontrollü vortexer yerleştirin.
  3. Reaktifleri ısınma iken, PCR örnekleri 3 PCR çoğaltır her örnek için bir tek tüp havuzu tarafından hazırlamak
  4. Cihazda örnekleri yükleyin.
  5. Kısaca girdap ve tüpler havuza alınan PCR ürünü ile aşağı spin.
  6. Cihazın 96-şey plaka RT bir raf yerleştirin ve etiketleyin.
  7. Kısaca girdap ve spin örnek arabellek ve merdiven aşağı.
  8. 3 µL örnek arabellek 96 iyi plaka (ihtiyacı en az 53 µL/ekran teyp) her şey için ekleyin.
  9. Örnekleri çift sayıda çalıştırın; Tek sayıda örnekleri, örnek arabelleği 4 µL boş bir kuyuya ekleyin.
  10. Merdivenin 1 µL bir merdiven için de ekleyin.
  11. Harita ekleyin 1 µL havuza alınan PCR ürününün belirlenen için de.
  12. Kapak plakasını folyo mühür ile
  13. Girdap gerecin vortexer ve adaptör 2.000 devir / dakikada 1 dakika kullanarak plaka.
  14. Örnek varsa tüp alt aşağı spin kabarcıklar konum aşağı tekrar çevir.
  15. Yazılımını başlatın.
  16. Ekran teyp ve yükleniyor İpuçları araç yükleyin.
  17. 96-şey adaptörle parçası analyzer içine örnekleri yükleyin.
  18. Koşuya denetleyicisi yazılımıyla ayarlayın.
  19. Hatta numaralı kuyu seçtiğinizden emin olun.
  20. Örnek kimliklerini yazın.
  21. Kontrol edin tüm kuyu ekran teyp gri renkle vurgulanır.
  22. Pipet ipuçları analyzer tanır emin olun.
  23. Başlat'ı seçin ve (ad, örnek numaraları ve Tarih çalışma) sonuçları kaydetmek için bir dosya adı belirtin.
  24. Daha fazla bilgi için üreticinin yönerge bakın.
  25. Çalışma tamamlandıktan sonra ipucu, ekran teyp ve tüpleri atmak.
  26. 16S tepe nM (315-450 bp V4 için arasında) verileri analiz. Bu zirve seçilen astar bağlı olarak değişir.

5. Kütüphane hesaplama, Havuzu, temizlik ve QC

  1. Amplicon boyutu ve Derişim tüm örneklerinin belirledikten sonra havuz son istenen hacim ve nM havuza alınan kitaplığı için elde etmek için kitaplıklarına (bkz. örnek hesaplama).
  2. Temizlik ve silis-zar bazlı bir saflaştırma kullanarak havuza alınan kitaplığı kit PCR ürünlerinin, üretici göre konsantresi ( Tablo malzemelerigörmek) iletişim kuralı.
    1. DNA 50 µL son hacmi ile elute.
  3. Temizlenmiş Kütüphane konsantrasyonu hemen bir yer için bir çift telli DNA yüksek hassasiyet kit kullanarak üreticinin protokole göre ölçmek.
    1. Havuza alınmış ve temizlenmiş Kütüphane 2 µL 198 µL seyreltme arabellek artı boya (1: 100 seyreltme) ile sulandırmak.
    2. Fluorometrik aygıttan ölçülen değeri kaydedin ve seyreltme faktörü göre dönüştürün.
  4. Havuza alınan kitaplığının (ng/µL) okuma konsantrasyon kullanarak, Kütüphane Derişim nm hesaplayın. 1 µL su katılmamış Kütüphane OD260/280 microvolume Spektrofotometre üzerinde ölçmek için kullanın.
    Not: Yeterli saflık kütüphanesinin 1.8-2.0 değeri gösterir.
  5. Sonraki nesil sıralama için hazır kadar son Kütüphane-20 ° C'de depolayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan Protokolü oluşturulan veri buluşma Protokolü duyarlılık, özgüllük ve kirlenme kontrolü için kriterler emin olmak için önemli kalite kontrol (QC) adımları içerir. Protokolün ilk QC adım PCR güçlendirme 16S V4 bölgesinin (Şekil 2) izler. Bir µL PCR ürününün her örnekten 315-450 bp (Şekil 2, kırmızı ok) beklenen boyut aralığı içinde olduğunu onaylamak için Elektroforez tarafından analiz edildi. Bazı insan sütü örnekleri belirli ürün daha düşük miktarda üretilen (şekil 2A, Karşılaştır yolları 3 ve 9-11 şerit ile 4-8), ya düşük seviyelerde öne çıkarma sırasında bu örnekleri veya PCR inhibitörleri etkilenmişimdir mikrobiyal DNA çıkarılan. Daha az 2.0 üretmek örnekleri için nM aralığında 315-450 bp (şekil 2A, lane 7), PCR inhibitörü Temizleme ürün taşınan-dışarı bir tek adım kit kullanarak ve yeniden güçlendirilmiş örneğidir. Başarı oranı yaklaşık % 40 temizlenmesidir sonra örnek amplifikasyon kurtarılması için. Nefelometri için her örnek (şekil 2B) belirli ürün örnekleri sıralama için eşit molar havuzu için gerekli hacmi belirlemek için önemlidir. Havuza alınan bir kütüphane hedeflenen sıralama için genellikle belirli bir PCR ürünü (şekil 3) tarafından hakimdir. Non-spesifik ürün kütüphanede önemli miktarda ise, bir jel-arıtma adım akışına eklenmelidir.

Şekil 2Asunulan örnekte belli belirsiz bantları arabellek denetimlerinde gözlenir (BC; yolları 2 ve 12) ve negatif kontrol (PC; lane 1), su PCR olası çevresel veya reaktif kirlenme gösteren. Böyle grup nadir değildir ve genellikle düşük miktarda PCR ürünü temsil (örneğin, < 1 nM) ve sıralama sırasında kaç okuma sayar üretin (< 1000). Bu örnekler gerçekten çok düşük sıralama sayıları (4A rakam, şerit 1 ve 11; okumak var mı temsilcisi sıralama sonuçları (şekil 4) onaylamak Şekil 4B, tampon ve PCR su yolları) ve önemlisi, kontrol örnekleri için takson kompozisyon insan sütü örneklerinden farklıdır (şekil 4A; yolları ile karşılaştır şerit 1 ve 11 2-10). Negatif denetimler, denetimleri ve örnekleri, arasındaki takson bileşiminde önemli örtüşme ile birlikte yüksek okuma sayıları Çapraz bulaşma ve geliştirilmiş kontaminasyon kontrolü için ihtiyaç göstermektedir.

Sıralama sonuçlar (şekil 4) insan sütü microbiome ile ilişkili özellikleri yüksek çeşitlilik göstermek ve her örnek (şekil 4A, yolları 2-10) için sayıları sıralama sayısı değişkenlik okuyun. Buna ek olarak, insan sütü örnekleri ile birlikte işlendiği sıralama sonuçları için sahte bakteriyel takson kompozisyon gösterdi ve sahte önceki iş akışı ishal ( şekil 4A karşılaştırmak için elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir sayar okuyun , lane 12 rakam 4B, sahte şerit ile). Sahte şerit için tutarlı sonuçlar insan sütü örnekleri için gözlenen değişkenliğin otantik bir deneysel sonuç ve içsel iş akışının değişkenliği olmayan bir işlev olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: akış şeması hedefli 16S ardışık sıralama düzeninin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kalite kontrol analizi 16S V4 amplicons. (A)16S V4 amplicons görüntüsünü Jel Elektroforez tarafından bir otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisi'ni kullanarak çözüldü. 16s V4 amplicons Caporaso vd göre oluşturulan 9ve bir µL PCR ürünleri analiz üreticinin esaslarına göre yüksek hassasiyet DNA reaktifler kullanarak. En insani süt örnekleri (şerit 3-6 ve 8-11) ve bakteriyel sahte (lane 13) üretilen bir birincil PCR ürünü beklenen boyutu yaklaşık 400 bp (kırmızı ok). Şeritte 7 insan sütü örnek belirli ürün önemli miktarda üretmek için başarısız ve temizleme ve yeniden güçlendirme tabidir. Minimum ürün PCR negatif kontrol (PC, lane 1) için algılandı ve lizis arabellek negatif denetimleri (M.Ö., yolları 2 ve 12) en az kirlenme analiz örnekleri mevcut belirtti. MW, molekül ağırlığı işaretleri: üst alt ve kırmızı yeşil çubuklar tanımlamak 1.500 bp ve 25 bp boyutu işaretleri, sırasıyla, içinde her lane. Lane 3 jel üzerinden (a) (B) üst Electropherogram. Birincil PCR ürünü kırmızı dikey çubuklar tarafından tanımlanan en yüksek bölgesi içinde düşer ve bir ortalama PCR ürün boyutunu 396 sonuçlanan 299-497 bp büyüklükleri arasında değişen parçaları oluşur bp. Gating beklenen amplicon boyutundan (i biraz daha geniş bir tarih yapılır n bu durumda 315-450 bp) tüm örnek tepe eklediğinizden emin olmak. Alt ve üst tepeleri 25 parça boyutlarıyla ilişkilendirmek bp ve 1.500 bp, anılan sıraya göre. Alt: tepe bölgesi, konsantrasyon ng/µL PCR ürününün tepe bölgesi içinde ve Derişim nm belirli PCR ürününün boyutu parametreleri özetleme grafik. Bu bilgiler ne kadar hesaplamak için kullanılır her örneği sıralama için eşit bir molar kütüphanede havuza alınmış (bkz. örnek hesaplama). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir havuza alınmış ve konsantre sıralama kitaplığı Electropherogram. Sıralı için bireysel örnekleri eşit molar miktarda havuza alınan bir kitaplığa kombine edilmiştir. Kütüphane yapıldı sonra temizlenmiş ve toplam hacmiyle 50 µL silis-zar bazlı bir PCR kiti kadar temiz kullanarak yoğunlaşmıştır. Son hazırlık ve sunuş Kütüphane sonraki nesil Sekanslama üzerinde sıralama için üreticinin protokole göre yapılmıştır. Bu kitaplığı başarıyla ek bantları varlığı rağmen sıralı. Beklenen boyutu aralık dışında PCR ürünleri hakkında bir endişe ise üreticinin iletişim kuralı bir jel boyutu seçimi adım eklenmesi önerir. Genellikle bu QC adım gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: negatif ve pozitif denetimleri değerlendirilmesi. (A)göreli zenginliği ile hakim olmak ve insan sütü örnekleri bir ayıklama toplu bakteriyel özellikleri. Bir QC tedbir olarak, hemen ardından bir sıralama çalışma besteleri otomatik DNA/RNA arıtma araç üzerinde yüklü olarak her ayıklama toplu oluşturulur. Sayılar her örnek çubuğunun altındaki ilgili örnek için filtre uygulanmış okuma sayısı gösterir. Arabellek denetimleri besteleri insan sütü örnekleri farklı vardır. (B) göreli zenginliği arabellek, sahte ve PCR denetimleri bakteriyel özellikleri. Okuma ve kompozisyon tüm olumsuz (arabellek ve PCR su) ve pozitif (bakteriyel sahte) denetimleri için değerlendirilir. Arabellek ve su değişir, ancak sahte topluluk oldukça kararlı kalır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

16S rRNA, hedeflenen yeni nesil sıralama microbiome karakterizasyonu18için yaygın olarak kullanılan, hızlı bir tekniktir. Ancak, toplu iş etkileri, çevresel kirlenme, örnek Çapraz bulaşma, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere birçok faktör, olumsuz deneysel sonuçlar etkiler ve onların yorumu7,19 yıkmak , 20. en iyi sağlam 16S analizleri kolaylaştırmak için microbiome iş akışları birleştirmek gerekir iyi deneysel tasarım, uygun kontrollerin kullanımı, iş akışı adımlarını kayma ayrılığı ve en iyi yöntemler uygulanması. Burada açıklanan protokolü her biri bu parametreleri içerir ve yukarıdaki zorlukları ve çeşitli örnekleri için 16S iş akışı uygulamak için önemli deneysel araçları sunar.

İyi deneysel tasarım 16S microbiome analizleri için önemlidir. Bu uygun toplama ve depolama örneklerinin yanı sıra 16S faiz bölge için uygun astar yelpazesi içerir. Örneğin, iyi yenidoğan gut microbiome21gelişiminde önemli bir rol oynar Bifidobacterium, amplifikasyon olduğundan V4 bölge (515F/806R) insan sütü için seçilir. Diğer astar kümelerini (örneğin, 27F/338R, 515F/926R) mikrobiyal diğer topluluklar çalışmalar için daha uygun olabilir. Önemli bir Not Bu tavlama sıcaklığı hedeflenen 16S için PCR ve beklenen amplicon boyutuna göre astar seçimi değişebilir.

İletişim kuralı değiştirilebilir başka yerlerde iş akışı dahil QC adımların sonuçlarını temel alır. Ya hiç veya çok az DNA hedeflenen 16S PCR güçlendirme adım takip algılandığında sorun giderme için birkaç seçenek vardır. 1) örnek bir PCR inhibitörü kaldırma adım koymak mümkün olabilir. Bir tek adım kit kullanarak aşağıdaki PCR inhibitörü kaldırma gerçekleştirilen her üreticinin Protokolü amplifikasyon zaman, 2 yaklaşık yüzde kırkı başarılı) daha çıkarılan DNA için hedeflenen 16S eklenebilir PCR, ya da 3) yeni ve potansiyel olarak daha büyük bir aliquot süt varsa işlenebilir. Kütüphanede silis-zar bazlı arıtma takip beklenen boyutu aralık dışında PCR ürünleri hakkında bir endişe ise, bir jel arıtma adım eklenebilir. Son olarak, QC adımları aşağıda ayrıntılı olarak anlatılan kirlenme kanıtı olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Önemli kirlilik tespit edilirse, o zaman nerede kontaminasyon tanıttı bağlı olarak, her iki PCR tekrar edilebilir veya gerekirse, örnek yeniden ayıklanan olabilir. Neyse ki, iyi laboratuar uygulamaları ile nadir olaylar bunlar. Son olarak, bu iletişim kuralını uyarılar düşük biyokütle örnekleri ve özellikle insan sütü amplifikasyon içinde vurgulamak için bulunmakta iken, protokol kolayca oral, Anal, vajinal ve cilt temizleme bezi veya sünger gibi dışkı amplifikasyon için değiştirilebilir. Diğer örnek türleri seçilir, dikkate hangi ayıklama kitleri belirli örnek türü için en uygun olan verilir.

Toplu iş etkileri kitleri, reaktifler veya sıralama ishal nedeniyle değişkenlik microbiome çalışmalarda önemli kaynaklarıdır. DNA ekstraksiyon kitleri, diğer reaktifler, birlikte çok20,22,23,24ile önemli ölçüde değişebilir bakteriyel DNA'ın düşük seviyelerde sahip. Kitleri, reaktifler, tek bir sürü kullanarak büyük bir proje için kiti kirlenme en aza indirmek için tasarlanmış kitleri seçerek analiz7basitleştirmek. Konular ve denetimleri örnekleri yan yana işlenir. En iyisi tüm örnekleri için tek bir çalışma, her ikisi de konu ve kontrol, çalışan tek bir sıralama içine dahil edilebilir. Eğer çok sayıda örnekleri toplu olarak işlenmek üzere, temsilcisi konular ve denetimleri örnekleri her toplu iş iş işlemde dahil ve birlikte işlenebilir. Toplu iş işleme kirlenme (Yani, insan sütü) düşük-biyokütle örneklerin en aza indirmek için yüksek biyokütle (Yani, dışkı) olan örnekleri tarafından organize etmek önemlidir. Bu gibi durumlarda, düşük biyokütle örnek türleri ilk ve o zaman yüksek biyokütle örnekleri aynı çalışma için işlem.

Düşük biyokütle örnekleri benzersiz sorunlar için microbiome çalışmaları, çevre, reaktifler, aletleri kirlenme olarak teşkil ve araştırmacı otantik topluluk üyeleri düşük bereket7 ' mevcut birbirinden ayırt etmek zor yapabilirsiniz , 25 , 26 ve bu da yapay olarak örnek deneysel işlem19ile tanıtılmaktadır. Burada açıklanan iş akışı önemli deneysel negatif denetimleri hem örnek hazırlama adım (salt arabellek lizis denetimi), hem de PCR adım (PCR su kontrolü) içermektedir (bkz: şekil 4). Bu denetimler kirlenme kaynakları tanımlamak ve tezgah veya silico27,28,29,30etkili düzeltici önlemler kolaylaştırmak yardımcı olur. Negatif denetimleri dikkatle değerlendirilir ve çalışma sonuçları7ile bildirdi.

Kirlenme en aza indirmek için temiz pre-PCR güçlendirme alanı ve sonrası amplifikasyon alanı deneysel etkinliklerine kayma ayrım önemlidir. En iyi şekilde, temiz oda için PCR ana mix hazırlık ve Master bir örnek hazırlama/ek alan mix ve bir ayrı ölü hava kutusu veya adanmış sarf malzemeleri konut bir biyolojik güvenlik kabini dahil olabilir ve küçük donanımları gerekli için hem bir alana sahip Ana karışım hazırlama. Temiz oda tasarım yüksek verimlilik partikül hava (HEPA) filtreleme olumlu hava akımı sistemiyle içermektedir. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı kontrollü, düşük-mikrobiyal çevre bakımı için önemlidir ve saç, laboratuvar mont, eldiven, içerir ve ayakkabı kapsar. İdeal olarak kitleri/reaktifler ve örnekleri ayrı özel buzdolabı/dondurucu içinde depolanır. PCR Kur aynı zamanda belirlenen iş istasyonlarında temiz oda içinde yürütülen; örnekleri otomatik pipetting platformu üzerinde yüklenen kadar açık ayrılması ayıklanan DNA astar stokları ve reaktifler korunur. PCR kurulum tamamlandıktan sonra plaka sonrası amplifikasyon alanına transfer ve termal cycler yüklendi.

Sonrası güçlendirme alanlarına temiz alanlarda çalışma etkinliğini akışını kısıtlamak önemlidir; reaktifler, aletleri veya sonrası amplifikasyon bölgelerden gelen malzemeleri temiz alanına retrograd bir harekettir yok. Herhangi bir sonrası amplifikasyon alanları girdiğiniz personel girişinden (kadar ertesi gün) 24 saat temiz alan çubuklu. Yukarıdaki iş akışı ek konuları protokolleri temizlik temiz ve sonrası amplifikasyon alanlarda çalışma yüzeyleri ve enstrümantasyon nükleik asit kirlenme en aza indirmek için uygulanması gerekir. Eğer mümkün olmayan fiziksel engeller veya ayrı Odalar, tüm çabaları kadar ayrı alanlarda yukarıya belgili tanımlık iş ayarlamak için alınması gerekir.

Kontaminasyon ek olarak, microbiome çalışmalar duyarlılık, değişkenlik ve tekrarlanabilirlik31tarafından zorlanmaktadır. Bu iletişim kuralı adreslerini elde edilir, tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleşmeyle tarafından bu sorunları ve güçlendirilmiş her toplu örnekleri (bkz. şekil 4b) ile birlikte sıralı. Bu denetim oluşturulan deneysel sonuçların tekrarlanabilirlik değerlendirir sürekli bir iç başvuru sağlar ve ortaya çıkan sorunları gidermek için kullanılabilir. Örneğin, kalite ayıklanan sahte DNA'ın etkili örnek lizis ve DNA ekstraksiyon, hangi genomik DNA denetimlerin özledim için bir ölçü sağlayabilir. PCR amplicons sahte örnek için kalite kontrolünü de PCR verimliliği ve özgüllük belirtebilirsiniz. Ayrıca, sahte birden çok bakteri türleri oluşur çünkü takson sahte örnek için sıralama sonuçlarında gösterimi tarafından işlenen toplu örnekleri için göreli duyarlılık varılabilir. İdeal bir sahte topluluk anahtar bakteriyel türler analiz ediliyor kompartımanda algılama yeteneğini değerlendirir ve bu nedenle sahte topluluk bileşimi tarafından çalışma değişir gerekebilir. Şekil 4agörüldüğü gibi örnek sıralama sonuçları arasında önemli ölçüde değişkenlik, ama sıra sonuçları bakteriyel sahte toplum için son derece tekrarlanabilir (bakınız şekil 4b).

Şekil 4 sahte toplumda 33 suşların klinik yalıtır ticari olarak kullanılabilir ve yerel bir arada eşsiz bir karışımı olmakla birlikte, piyasada bulunan bir sahte topluluk son zamanlarda gelişmiş32oldu.

Burada açıklanan iş akışı farklı microbiome çalışmalar arasında genel olarak adres tekrarlanabilirlik için onun yetenek sınırlı olmasına rağmen araştırmacılar dahil etmek uygun deneysel sağlayan önemli bir deneysel yaklaşım sağlayın denetimleri ve monitör tekrarlanabilirlik kendi sonuçları içinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Helty Adisetiyo, doktora ve Shangxin Yang, doktora Protokolü gelişimi için teşekkür etmek istiyorum. Genel destek için uluslararası anne çocuk ergen AIDS klinik denemeler grubu (IMPAACT) tarafından Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) ulusal kurumları, Sağlık (NIH) Ödülü numaraları altında sağlanan UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) ve UM1AI106716 (IMPAACT LC), Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (NIMH) ortak fon ile. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AllPrep RNA/DNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction kit
Eliminase Fisher Scientific 435532 RNase, DNase, DNA decontaminant
Thermo Mixer Fisher Scientific temperature-controlled vortexer
Buffer RLT plus Qiagen 1053393 guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit
ß-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 63689-25ML-F ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds
LME Beads MP Biomedicals 116914050 bead tube
QIAgen TissueLyzer Qiagen 85300 automated sample disruptor adapter set
QIAshredder column Qiagen 79654
QIAgen RB tube manufacturer's microcentrifuge tube in kit
QIAcube and related plasticware Qiagen 9001292 automated DNA/RNA purification instrument
DNA exitus plus Applichem A7089 non-enzymatic decontamination solution
EB Buffer Qiagen 19086 elution buffer
QIAgility and related plasticware Qiagen 9001532 robotic liquid handler
PCR water MO BIO 17000-
5PRIME HotMasterMix Quantabio 2200400
Barcoded reverse primers Eurofin No Catalog #'s designed and ordered
96 well PCR plate USA scientific 1402-9708
Tapestation 2200 and related plasticware Agilent G2964AA automated DNA/RNA fragment analyzer
D1000 reagents for Tapestation Agilent 5067-5585 Sample buffer and ladder are part of this kit
OneStep PCR Inhibitor Removal Kit Zymo Research 50444470 PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit.
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216
NanoDrop Thermo Fisher microvolume spectrophotometer
MiSeq 300 V2 kit Illumina 15033624/15033626
MiSeq Illumina No Catalog #'s next generation sequencer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 133 16S ribozomal RNA Microbiome yeni nesil sıralama anne sütü insan sütü düşük biyokütle
Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih,… More

Tobin, N. H., Woodward, C., Zabih, S., Lee, D. J., Li, F., Aldrovandi, G. M. A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples. J. Vis. Exp. (133), e56974, doi:10.3791/56974 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter