Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57019
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

Summary

इस प्रोटोकॉल में, baculovirus Sf9 कोशिकाओं में baculovirus प्लाज्मिड के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित और एक सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में परिवर्धित है । supernatant हेपरिन अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है और आगे ultracentrifugation द्वारा ध्यान केंद्रित । इस प्रोटोकॉल के उत्पादन और जीन थेरेपी आवेदन के लिए baculovirus के शोधन के लिए उपयोगी है ।

Abstract

Baculovirus परंपरागत रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और वैक्सीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, हाल ही में, baculovirus जीन थेरेपी आवेदन के लिए एक होनहार वेक्टर के रूप में उभर रहा है । यहाँ, baculovirus bacmid कोशिकाओं की एक अनुयाई संस्कृति में baculovirus प्लाज्मिड डीएनए (Sf9) के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित है. Baculovirus बाद में Sf9 कोशिकाओं में एक सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में विस्तारित है जब तक वांछित मात्रा प्राप्त की है । इसके बाद हेपरिन अपनत्व क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग कर संस्कृति supernatant से शुद्ध होती है. वायरस supernatant हेपरिन कॉलम पर लोड किया जाता है जो हेपरिन के लिए baculovirus के संबधों के कारण supernatant में baculovirus कणों को बांधता ग्लाइकोप्रोटीन ढंक देता है । स्तंभ एक बफ़र के साथ दूषित पदार्थों को निकालने के लिए धोया जाता है और baculovirus एक उच्च-लवण बफ़र के साथ स्तंभ से eluted है । eluate एक isotonic नमक एकाग्रता और baculovirus कणों को पतला है आगे ultracentrifugation का उपयोग कर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । इस विधि का उपयोग करना, baculovirus को केंद्रित किया जा सकता है 500-संक्रामक कणों की एक 25% की वसूली के साथ गुना । हालांकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित उत्पादन और संस्कृतियों से baculovirus के शुद्धि 1 एल को दर्शाता है, विधि स्केलed किया जा सकता है एक बंद प्रणाली निलंबन संस्कृति में एक नैदानिक उत्पादन के लिए जीन थेरेपी आवेदन के लिए ग्रेड सदिश ।

Introduction

Baculovirus मुख्य रूप से fugiperda रिकॉमबिनेंट Autographa californica नाभिकीय multicapsid वायरस (पॉलीहेड्रोसिस) का उपयोग करके lepidopteran धब् AcMNPV (एस एफ) 9 कीट कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और टीकों के उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है 1 , 2 , 3 , 4. हाल ही में, यह जीन थेरेपी आवेदन5के लिए एक होनहार वेक्टर के रूप में उभर रहा है । यह एक व्यापक मेजबान और ऊतक tropism के लिए जाना जाता है, दोनों quiescent और proliferating कोशिकाओं को संक्रमित, गैर रोगजनक है, और मेजबान गुणसूत्र4,5,6में एकीकृत नहीं करता है । इसके अलावा, baculovirus सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति है जो स्केलेबल है और भविष्य नैदानिक उत्पादन1के लिए बंद प्रणाली प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है में उत्पादित किया जा सकता है ।

cytotoxicity7,8,9को कम करते हुए प्रभावी transduction प्राप्त करने के लिए baculovirus कणों की शुद्धता महत्वपूर्ण है । Baculovirus अपने infectivity पर सीमित प्रभाव के साथ ultracentrifugation या स्पर्श प्रवाह निस्पंदन (TFF) द्वारा केंद्रित किया जा सकता है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं को न केवल वायरस के कणों लेकिन यह भी सेलुलर मलबे और Sf9 संस्कृति है, जो इन विट्रो (व्यक्तिगत अवलोकन) में विषाक्त हो सकता है और सूजन या एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है जब vivo मेंइस्तेमाल किया से प्रोटीन ध्यान । इस से बचने के लिए, विशेष रूप से जब अत्यधिक केंद्रित वायरस शेयरों का उपयोग, संक्रामक baculovirus की जरूरत है और शुद्ध कणों से अलग किया ।

कई तरीकों की शुद्धि और एकाग्रता के लिए सूचित किया गया है baculovirus वैक्टर10,11,12। उपलब्ध दृष्टिकोणों में से, हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी एक एकल कदम प्रदूषित प्रोटीन के कम एकाग्रता के साथ शुद्धि के उच्च स्तर के लिए अनुमति देता है12. विधि baculovirus13,14के लिए रिसेप्टर के रूप में heparan सल्फेट की पहचान पर आधारित है । कॉलम और baculovirus के बंधन पर Sf9 सेल supernatant लोड करने के बाद, कॉलम शारीरिक (isotonic) बफर के साथ धोया जा सकता है असीम या ढीले रूप से बाध्य दूषित कणों को दूर । हेपरिन के लिए बाध्यकारी के बाद से प्रतिवर्ती है, baculovirus कणों एक उच्च नमक बफर के साथ eluted जा सकता है, जो तुरंत शारीरिक (isotonic) नमक एकाग्रता के लिए पतला है आसमाटिक सदमे से रोकने के लिए12। इसके अलावा, baculovirus के उत्पादन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पर कब्जा और क्रोमैटोग्राफी कॉलम से रेफरेंस, एक बंद प्रणाली प्रक्रिया है जो वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रथाओं (cGMP) के साथ संगत है का उपयोग किया जा सकता है ।

यहां, हम निर्माण, शुद्धि, और संक्रामक baculovirus की एकाग्रता के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान संबध क्रोमैटोग्राफी और केंद्रापसारक का उपयोग कर । संक्षेप में, हम प्लाज्मिड संस्कृति में एक baculovirus अनुयाई डीएनए के साथ Sf9 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा baculovirus उत्पादन और आगे सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में संक्रामक baculovirus का विस्तार । हम हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी का उपयोग baculovirus शुद्ध और अंतिम चरण के रूप में उपयोग ultracentrifugation के लिए अत्यधिक जीन थेरेपी आवेदन के लिए वेक्टर ध्यान केंद्रित ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल का सारांश करने वाले चित्रण के लिए चित्र 1 देखें ।

1. Baculovirus प्लाज्मिड डीएनए का शुद्धिकरण

  1. बैक्टीरियल संस्कृति से युक्त हो जाना baculoviral प्लाज्मिड डीएनए (bacmid)14 के 200 मिलीलीटर में £ शोरबा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ; कनमीसिन (50 µ g/ml), टेट्रासाइक्लिन (10 µ g/एमएल), और गेन्तमयसीं (7 µ g/एमएल), 16 ज के लिए 37 ° c पर एक कक्षीय शेखर सेटिंग पर 300 rpm ।
  2. मानक क्षारीय lysis प्रोटोकॉल15का उपयोग कर बैक्टीरियल संस्कृति से bacmid डीएनए शुद्ध, और ते बफर में bacmid भंग.

2. Baculovirus का उत्पादन

  1. संस्कृति एक कक्षीय शेखर मशीन में 135 rpm और 28 डिग्री सेल्सियस में एक पाली कार्बोनेट Erlenmeyer कुप्पी से युक्त सीरम मुक्त कीट संस्कृति मध्यम1,2,3में Sf9 कोशिकाओं ।
    नोट: यदि Sf9 कोशिकाओं जमे हुए स्टॉक से गल रहे हैं, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और विकास के घातीय चरण में प्रवेश के लिए कम से कम दो सप्ताह की अनुमति ।
  2. Sf9 कोशिकाओं गिनती Trypan नीले रंग के साथ धुंधला के बाद एक hemocytometer के साथ विकास के घातीय चरण में काटा । बीज 1 x 106 व्यवहार्य Sf9 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 6-well ऊतक संस्कृति में इलाज प्लेट मध्यम के 2 मिलीलीटर में । एक मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए संलग्न करने के लिए सेल की अनुमति दें ।
  3. वृद्धि मध्यम सीरम मुक्त पूरक है अनुग्रह कीट संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
  4. कीट कोशिका अभिकर्मक रिएजेंट का उपयोग कर Sf9 कोशिकाओं में bacmid डीएनए Transfect ।
    1. अनुग्रह के कीट मध्यम के 100 µ l के साथ 8 µ l कीट कोशिका अभिकर्मक रिएजेंट को मिलाएं ।
    2. bacmid डीएनए के 2 µ जी को अनपूरक कीट माध्यम के 100 µ एल में पतला करें, और धीरे से भंवर करके मिलाएं ।
    3. पतला कीट कोशिका अभिकर्मक रिएजेंट के साथ पतला डीएनए जुडा है, और धीरे मिश्रण । कमरे के तापमान पर 15 से 30 मिनट के लिए मशीन ।
    4. डीएनए-कोशिकाओं पर लिपिड मिश्रण dropwise जोड़ें । लगभग 5 घंटे के लिए एक मशीन में 28 ° c पर मशीन
  5. कोशिकाओं से अभिकर्मक मिश्रण निकालें और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  6. कीट संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और एक मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के लिए जारी रखने के बिना मीडिया बदल रहा है ।
    नोट: यदि bacmid एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन होता है, इसकी अभिव्यक्ति कोशिकाओं 48 एच पोस्ट-अभिकर्मक में पता लगाया जा सकता है । Baculovirus transfected Sf9 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है और संस्कृति माध्यम है जो बाद में untransfected कोशिकाओं को संक्रमित में स्रावित । पूरे सेल जनसंख्या 5 दिनों में baculovirus से संक्रमित हो जाता है और वायरल संक्रमण के लक्षण दिखाता है, cytopathic प्रभाव भी कहा जाता है । इन सेल व्यास में वृद्धि, कोशिका द्रव्य में रिक्तिकाएं/granules, सेल विकास और मृत या लीजड ड कोशिकाओं की समाप्ति सेल संस्कृति में मौजूद हैं । हालांकि, यदि अभिकर्मक या संक्रमण दक्षता इष्टतम नहीं है, तो संस्कृति एक स्पष्ट cytopathic प्रभाव नहीं दिखा सकती है । cytopathic प्रभाव 200-400X आवर्धन पर एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के साथ visualized किया जा सकता है । Baculovirus संक्रमित कोशिका विरोधी gp64 एंटीबॉडी11के साथ धुंधला द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
  7. हार्वेस्ट baculovirus supernatant 5 दिनों के बाद अभिकर्मक और लेबल के रूप में पी1 वायरस स्टॉक ।
  8. baculovirus supernatant का संग्रह करें, जो प्रकाश में संवेदनशील है, पंजाब में 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ अंधेरे में । अल्पावधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (90 दिन तक) या पर-80 ° c लंबी अवधि के लिए ।
  9. बीज 6 × 106 Sf9 कोशिकाओं में एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति-इलाज प्लेट कीट संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर में । कक्षों में प्रारंभिक baculovirus supernatant (P1) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. हार्वेस्ट baculovirus supernatant (पी2) में 5वें दिन के बाद संक्रमण ।
  11. बीज Sf9 कोशिकाओं के 50 मिलीलीटर (3 एक्स 106 कोशिकाओं/एक 250 मिलीलीटर पाली कार्बोनेट Erlenmeyer कुप्पी में कीट संस्कृति मध्यम में निलंबन संस्कृति में और एक कक्षीय शेखर मशीन में कुप्पी जगह है । कोशिकाओं को पी2 स्टॉक के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 135 rpm को हिला जबकि 28 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान बनाए रखने ।
    नोट: संक्रमण के तीन या चार दिन बाद, संपूर्ण Sf9 कोशिका जनसंख्या cytopathic प्रभाव दिखाएगी, जो उच्च-titer baculovirus उत्पादन का एक संकेत है ।
  12. अनुक्रमिक baculovirus supernatants बढ़ाना जब तक वांछित मात्रा प्राप्त की है (पी3, पी4,....) 10 से 50-प्रत्येक बाद के संक्रमण में सेल संस्कृति की मात्रा गुना बढ़ द्वारा ।
    नोट: पी3 संक्रमण के 3आरडी दौर है जिसमें 500 मिलीलीटर से 1 एल Sf9 सेल संस्कृति के पी2 baculovirus supernatant के 10 से 20 मिलीलीटर से संक्रमित किया जा सकता है; पी4 संक्रमण के 4वें दौर है जिसमें Sf9 सेल संस्कृति के 5 से 10 एल पी3 baculovirus supernatant के 100 से 200 मिलीलीटर, और इतने पर संक्रमित किया जा सकता है । आमतौर पर, Sf9 कोशिकाओं सीरम मुक्त कीट संस्कृति मीडिया में 3 × 106 कोशिकाओं/एमएल में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1,000 x जी में baculovirus supernatant के लिए सेलुलर मलबे को हटाने और 50 इकाइयों के साथ baculovirus supernatant का इलाज/एमएल nuclease (250 इकाइयों/µ एल स्टॉक के) 2 एच के लिए 37 ° c में जीनोमिक डीएनए और आरएनए को पचाने के लिए । supernatants को एक 0.45 माइक्रोन निस्पंदन इकाई के माध्यम से फ़िल्टर करें ।

3. क्रोमैटोग्राफी प्रणाली की तैयारी

  1. क्रमिक रूप से नमूना और बफर लाइनों एक बाँझ पानी, 1 एन सोडियम हीड्राकसीड, पानी, और धोने बफर के साथ क्रोमैटोग्राफी प्रणाली तैयार (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर 150 मिमी सोडियम क्लोराइड युक्त, पीएच 7.0) एक रैखिक प्रवाह की दर पर 50 मिलीलीटर/
  2. एक हेपरिन 50 µm कॉलम तैयार (10 × 10 सेमी, क्रमिक रूप से चल रहे स्तंभ सफाई बफर (5 cv बाँझ 20 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर 2 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.0) और 5 cv धोने बफर की एक रैखिक प्रवाह की दर पर 7 मिलीलीटर की स्तंभ मात्रा (cv)) से 7.9 मिलीलीटर/

4. Baculovirus वेक्टर का शुद्धिकरण

  1. क्रोमैटोग्राफी सिस्टम निम्नानुसार सेट करें:
    1. baculovirus supernatant लोड करने के लिए नमूना लोड प्रवेश बंदरगाह का उपयोग करें ।
    2. वॉश बफ़र लोड करने के लिए बफ़र प्रवेश पोर्ट A1 का उपयोग करें । के साथ एक बोतल तैयार धोने बफर के कम से 500 मिलीलीटर और बोतल में धोने बफर लाइन जगह है ।
    3. रेफरेंस बफर लोड करने के लिए बफर प्रवेश बंदरगाह A2 का उपयोग करें (1.5 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 8.0 के साथ 20 मिमी सोडियम फॉस्फेट). एक बोतल तैयार करें जिसमें कम से 500 एमएल का रेफरेंस बफर हो और रेफरेंस बफर लाइन को बोतल में जगह हो ।
    4. स्तंभ पास-थ्रू baculovirus supernatant, वॉश बफ़र, और eluted baculovirus एकत्रित करने के लिए भिन्न संग्राहक में कई 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों सम्मिलित करें ।
  2. Equilibrate पांच 7.9 मिलीलीटर स्तंभ खंड (सीवी) के साथ वॉश बफर (40 एमएल) के एक रैखिक प्रवाह दर पर 7.0 मिलीलीटर की हेपरिन कॉलम/
  3. हेपरिन स्तंभ पर baculovirus supernatant के 250 मिलीलीटर लोड का नमूना पंप का उपयोग (प्रवेश नमूना बंदरगाह) क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के एक रैखिक प्रवाह दर पर 2.0 मिलीलीटर/
  4. हेपरिन कॉलम के माध्यम से धो बफर के 10 सीवी (80 एमएल) चलाने के 2.0 मिलीलीटर/मिनट के एक रैखिक प्रवाह की दर पर जब तक पराबैंगनी (यूवी) अवशोषक वक्र (280 एनएम) बेसलाइन पर लौट आया है और स्थिर हो जाता है ।
  5. Elute ने 7.9 एमएल हेपरिन कॉलम से baculovirus पार्टिकल्स का रेफरेंस बफर के 5 सीवी (40 एमएल) के साथ रेखीय फ्लोर रेट पर 4.0 एमएल/वर्णलेख पर प्रोटीन की तेज रेफरेंस कैपेसिटी के लिए देखें जब baculovirus के कण अलग कर देना कॉलम से निकलते हैं ।
  6. बाद के रेफरेंस, तुरंत eluted baculovirus supernatant पतला 10-पानी में 20 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर का उपयोग करने आसमाटिक सदमे से बाद में केंद्रापसारक के दौरान baculovirus कणों की निष्क्रियता को रोकने के गुना कमजोर ।
  7. baculovirus supernatant, वॉश बफ़र, और eluate की लोडिंग के दौरान संग्रहीत स्तंभ प्रवाह-थ्रू सहित प्रत्येक भिन्न के 100 µ l को संग्रहीत करें. शुद्धिकरण प्रक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए इन baculovirus अंशों को HT1080 में संक्रमित करें (अनुभाग 6 देखें).
  8. स्तंभ साफ़ करने वाले बफ़र और वाश बफ़र के साथ स् तंभ साफ करें । अंत में, 5 CV बाँझ के साथ कॉलम कुल्ला पानी में 20% इथेनॉल के एक रैखिक प्रवाह दर पर 7.0 मिलीलीटर/
  9. पानी के साथ क्रोमैटोग्राफी प्रणाली को साफ, 1 एन सोडियम हीड्राकसीड, फिर से पानी के साथ, और 20% पानी में इथेनॉल ५०.० मिलीलीटर की एक रैखिक प्रवाह दर/मिनट और 20% इथेनॉल में प्रणाली की दुकान ।

5. Baculovirus की एकाग्रता

  1. पूर्व बंध्याकरण केंद्रापसारक ट्यूबों एक आटोक्लेव का उपयोग कर । एक ऊतक संस्कृति हूड में प्रत्येक ultracentrifuge ट्यूबों के लिए baculovirus supernatant के एक बराबर मात्रा में जोड़ें । एक संतुलन से ट्यूब वजन मापने और बाँझ पंजाबियों के साथ ultracentrifuge ट्यूबों की सामग्री का वजन समायोजित करें ।
  2. प्लेस ultracentrifuge ट्यूबों के प्रत्येक दप 32 तिवारी रोटर की बाल्टी का विरोध में ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 80,000 × g पर ultracentrifuge भागो ।
  4. एक ऊतक संस्कृति हूड में ultracentrifuge ट्यूबों खोलें और baculovirus गोली को हटाने के बिना तरल महाप्राण aseptically ।
  5. जोरदार pipetting द्वारा प्रत्येक ट्यूब की गोली reसस्पेंड अप और 200 µ एल के साथ नीचे (डब्ल्यू) 0.5% से युक्त
  6. केंद्रित baculovirus को cryovials (50 से 100 µ l प्रति शीशी) और स्टोर पर-80 ° c में स्थानांतरित करें ।

6. अनुमापन of Baculovirus

  1. संक्रमण के पहले दिन, Trypan नीले रंग के साथ कोशिकाओं धुंधला के बाद एक hemocytometer का उपयोग कर HT1080 कोशिकाओं गिनती । 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के 2 मिलीलीटर में एक 6-अच्छी तरह से थाली में बीज 1 x 105 HT1080 कोशिकाओं । कई अतिरिक्त कुओं बीज संक्रमण के समय में मौजूद कोशिकाओं की सही संख्या का निर्धारण करने में सक्षम होना करने के लिए । संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में कोशिकाओं और 5% सह2।
    नोट: HT1080 कोशिकाओं अनुमापन के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में वे heparan सल्फेट के एक उच्च स्तर के रूप में व्यक्त अंय सेल लाइनों की तुलना में16। के बाद से HT1080 कोशिकाओं अनुयाई हैं, अनुमापन सरल और कम समय लेने के रूप में पारंपरिक Sf9 आधारित अनुमापन का उपयोग करने की तुलना में है ।
  2. संक्रमण के दिन, कुओं से कोशिकाओं की गिनती द्वारा प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण । पतला मूल baculovirus जो कॉलम शुद्धि से पहले अलग सेट किया गया था जोड़कर कोशिकाओं को संक्रमित है, और कॉलम प्रवाह के माध्यम से, धोने, और रेफरेंस भागों से नमूने के साथ । प्रत्येक नमूने के लिए, कमजोर पड़ने और मात्रा empirically संक्रामक baculovirus कणों के आधार पर निर्धारित करते हैं, और तपसिल में एक अच्छी तरह से संक्रमित ।
  3. संक्रमण के दो दिन बाद, ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण । कोशिकाओं को एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है अगर वे एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदा GFP)17व्यक्त करते हैं ।
  4. titers (प्रति मिलीलीटर संक्रामक इकाई) की गणना संक्रमण के समय में मौजूद कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, कमजोर पड़ने का कारक है, और सूत्र का उपयोग कर कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिशत: (संक्रमण के दौरान कोशिकाओं की संख्या × फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं × कमजोर पड़ने कारक) एमएल में baculovirus की/volume ।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि संक्रमण के समय प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या 1.2 × 105है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रतिशत है 5%, कमजोर पड़ने का कारक है 100, और पतला baculovirus की मात्रा जोड़ा है 10 µ एल, titer 6 × 107 संक्रामक इकाइयों (IU) है एमएल.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रवाह आरेख में है (चित्र 1) । कदम एक थाली में अनुयाई संस्कृति में baculovirus उत्पादन करने के लिए bacmid डीएनए के साथ Sf9 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक शामिल हैं, सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति, nuclease उपचार और केंद्रापसारक और निस्पंदन द्वारा स्पष्टीकरण में बाद में प्रवर्धन, और हेपरिन अपनत्व का प्रयोग शुद्धि क्रोमैटोग्राफी ultracentrifugation के साथ एकाग्रता के बाद ।

गल जाने के बाद, Sf9 कोशिकाओं को ठीक करने और विकास के घातीय चरण में प्रवेश करने के लिए कम से दो सप्ताह की जरूरत है । सक्रिय रूप से बढ़ती Sf9 कोशिकाओं अनुयाई संस्कृति में bacmid डीएनए के साथ transfected हैं । अभिकर्मक के दो दिन बाद, baculovirus लिफाफा नच की अभिव्यक्ति, gp64 पता चला है और बाद में, baculovirus उत्पादन11शुरू की है । के बाद से baculovirus प्रतिकृति सक्षम है, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि के माध्यम से स्रावित किया जाता है कि नव उत्पादित baculovirus के साथ कोशिकाओं के एक प्रगतिशील संक्रमण की वजह से धीरे-धीरे बढ़ जाती है. सेल supernatants युक्त Baculovirus 5 दिन अभिकर्मक के बाद काटा जाता है जब पूरे सेल आबादी संक्रमित हो गया है । यह प्रारंभिक वायरस supernatant गद्यांश 1 (P1) स्टॉक के रूप में निर्दिष्ट किया गया है । पी1 स्टॉक एक बड़ी थाली में Sf9 कोशिकाओं की एक नई वरीयता प्राप्त अनुयाई संस्कृति के बाद के संक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है । पूरे सेल जनसंख्या 5 दिनों में संक्रमण के संकेत से पता चलता है जो cytopathic प्रभाव (चित्रा 2) कहा जाता है । दूसरी अनुयाई सेल संस्कृति से supernatant काटा जाता है और पी के रूप में नामित2 स्टॉक है । Baculovirus supernatant आगे सीरम मुक्त कीट कोशिका संस्कृति माध्यम के साथ एक शेखर कुप्पी में हौसले से जोड़ा Sf9 कोशिकाओं के चल रहे संक्रमण के माध्यम से Sf9 निलंबन संस्कृति में परिलक्षित होता है । प्रत्येक संक्रमण चक्र के अंत में, कोशिकाओं के अधिकांश एक वृद्धि हुई सेलुलर व्यास और मृत या लीजड ड कोशिकाओं, जो baculovirus संक्रमण के पूरा होने के लिए संकेत कर रहे हैं के साथ cytopathic प्रभाव दिखा. Baculovirus स्टॉक क्रमिक रूप से वांछित मात्रा (पी3, पी4,....) प्राप्त होता है जब तक परिलक्षित होता है । supernatant कम गति के केंद्रापसारक द्वारा Sf9 कोशिकाओं से अलग है, एक nuclease चिपचिपापन को कम करने के साथ इलाज किया, एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर, बाद में शुद्धि और एकाग्रता कदम में इस्तेमाल होने से पहले ।

baculovirus को शुद्ध करने के लिए, संक्रमित Sf9 कोशिकाओं से supernatant एक हेपरिन कॉलम पर लोड किया जाता है । हेपरिन स्तंभ धीरे से दृढ़ता से बाध्य baculovirus और ढीले बंधे प्रोटीन दूषित पदार्थों के साथ संतृप्त हो जाता है । हेपरिन कॉलम धोने बफर के साथ कुल्ला है जब तक कि पराबैंगनी (यूवी) अवशोषक वक्र (280 एनएम) के लिए आधार रेखा को रिटर्न और स्थिर हो जाता है, स्तंभ से असीम और लचर बाध्य सामग्री को हटाने का संकेत है जब तक दूषित पदार्थों को हटा दें । दूसरी ओर Baculovirus कणों को हेपरिन कॉलम में दृढ़ता से बाँध देते हैं. इसलिए, स्तंभ वाश बफ़र में वायरस की कोई महत्वपूर्ण मात्रा का पता लगाया है । हेपरिन-बाउंड baculovirus कणों पीएच 8.0 में सोडियम क्लोराइड के 1.5 मीटर के साथ eluted और isotonicity पाने के लिए और वायरस निष्क्रियता को रोकने के लिए बफर के साथ 10 गुना पतला कर रहे हैं । प्रोटीन की एक तेज चोटी रेफरेंस के दौरान मनाया जाता है जो baculovirus अंश (चित्रा 3) से मेल खाती है । नमूना लोड हो रहा है, धोने, और इस क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया रेफरेंस के लिए अनुकूलित शर्तों शुद्ध संक्रामक baculovirus कणों की 50% से अधिक वसूली उपज । पतला supernatants आगे 500 तक ध्यान केंद्रित कर रहे है और ultracentrifugation के साथ गुना और 0.5% BSA है, जो एक शुद्ध 25% वसूली11पैदावार युक्त पंजाब में तैयार की ।

Figure 1
चित्र 1 . baculovirus के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए योजनाबद्ध आरेख । Sf9 कोशिकाओं bacmid डीएनए के साथ कोशिका संस्कृति का इलाज प्लेट transfected में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । Baculovirus supernatant काटा जाता है और अनुयाई संस्कृति में नए Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित किया जाता है । संक्रमित कोशिकाओं को बाद में सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में प्रचारित कर रहे हैं । Baculovirus supernatant एक nuclease के साथ इलाज किया, केंद्रापसारक, और फ़िल्टर्ड । Baculovirus हेपरिन संबध कॉलम क्रोमैटोग्राफी, बफर में पतला द्वारा शुद्ध है, और ultracentrifugation द्वारा केंद्रित aseptically । अंत में, baculovirus supernatant-80 ° c पर संग्रहित है । (यह आंकड़ा Nasimuzzaman एट अल, 2016 से अनुकूलित किया गया है, मॉल थेर तरीकों क्लीन देव. 2016; 3:16071 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . baculovirus संक्रमित Sf9 कोशिकाओं के Cytopathic प्रभाव । Baculovirus supernatant एक ऊतक-संस्कृति इलाज प्लेट में Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पांच दिनों के संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के साथ visualized थे. क) किसी नियंत्रण के रूप में संक्रमित Sf9 कक्ष । ख) Baculovirus संक्रमित Sf9 कोशिकाओं cytopathic प्रभाव दिखा । कोशिकाएँ 200X आवर्धन पर दिखाई जाती हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . के दौरान प्रवाह-थ्रू में संक्रामक baculovirus की संख्या हेपरिन अपनत्व क्रोमैटोग्राफी. HT1080 कोशिकाओं के संक्रमण से Baculovirus titers का अनुमान लगाया गया । परीक्षण किए गए नमूने स्तंभ रन-थ्रू, वाश और eluate सहित थे. नमूनों को आवश्यकतानुसार पतला किया गया. रेखा (डार्क डायमंड्स) प्रत्येक अंश में baculovirus की कुल संक्रामक इकाइयों (IU) को दिखाता है । स्तंभ प्रवाह-नमूना और वाश बफ़र के अंश आकार प्रत्येक ट्यूब में 40 मिलीलीटर थे, और eluate प्रत्येक ट्यूब में 10 मिलीलीटर था । (यह आंकड़ा Nasimuzzaman एट अल, 2016 से अनुकूलित किया गया है, मॉल थेर तरीकों क्लीन देव. 2016; 3:16071 अनुमति के साथ.) कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में Sf9 कोशिकाओं में baculovirus के उत्पादन का वर्णन है जो निलंबन संस्कृति और baculovirus के शुद्धिकरण में एक हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर रहा है. इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए पैरामीटर्स उपज को अधिकतम करते है और संक्रामक baculovirus की निष्क्रियता को कम करते हैं । यहां उपलब्ध कराई गई प्रोटोकॉल baculovirus कणों की एक काफी सुधार वसूली से पता चलता है के रूप में दूसरों के द्वारा हासिल की वसूली के लिए9।

व्यापक मेजबान रेंज और ऊतक tropism के कारण, कई अध्ययनों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में आयोजित किया गया, जिगर, आंख, अंडाशय, प्रोस्टेट, और baculovirus के साथ वृषण-मध्यस्थता जीन डिलिवरी5,6,7,8 . Baculovirus ऐसे आत्मघाती जीन, ट्यूमर दमन जीन के रूप में चिकित्सीय जीन, युक्त वैक्टर, और ट्यूमर एंकोडिंग जीन विशिष्ट एंटीजन सफलतापूर्वक पूर्व नैदानिक पशु मॉडल18,19में आयोजित किया गया है । हालांकि baculovirus मानव कोशिकाओं transduce कर सकते हैं, यह केवल कीट कोशिकाओं में प्रचारित किया जा सकता है और, एक परिणाम के रूप में, मानव प्राप्तकर्ताओं के लिए एक जोखिम पैदा नहीं करता है ।

Baculovirus bacmid डीएनए के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा कीट कोशिकाओं में उत्पादित है । bacmid की गुणवत्ता उच्च titer baculovirus के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है । आम तौर पर, हौसले से तैयार bacmid उन से बेहतर प्रदर्शन करता है समय की लंबी अवधि के लिए फ्रिज में जमा हो जाती है । सक्रिय रूप से बढ़ती Sf9 कोशिकाओं transfected कुशलतापूर्वक जो उच्च titer baculovirus का उत्पादन कर रहे हैं । प्रवर्धन चरण के दौरान, यह निलंबन संस्कृति में कोशिका एकाग्रता और संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया baculovirus supernatant की मात्रा को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि कोशिकाओं को baculovirus कणों का अनुपात इष्टतम नहीं है, baculovirus की उपज की उंमीद से कम हो सकता है (व्यक्तिगत प्रेक्षण, MN) ।

हेपरिन स्तंभ पर baculovirus supernatant लोड करते समय, यह स्तंभ के माध्यम से गुजर सकता है कि वायरस कणों के लिए प्रवाह के माध्यम से जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि ऐसा होता है, तो एक निचले स्तंभ रन गति आवश्यक हो सकता है या supernatant की छोटी मात्रा स्तंभ पर लोड किया जाना चाहिए । baculovirus supernatants में मौजूद अधिकांश संदूषित पदार्थों को क्रोमैटोग्राफी चलाने के वाशिंग स्टेप के दौरान धुल जाते हैं । हम सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के रजत दाग-polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) जेल और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन द्वारा baculovirus की पवित्रता का मूल्यांकन किया और पाया कि हमारे शुद्ध baculoviruses अच्छी गुणवत्ता12हैं ।

हम ध्यान से बाध्यकारी शर्तों को अनुकूलित किया है और पाया कि POROS हेपरिन माध्यम अंय हेपरिन मीडिया से बेहतर है (उदा HiTrap या Capto हेपरिन) baculovirus कणों पर कब्जा करने की क्षमता में (व्यक्तिगत अवलोकन). उच्च नमूना गति और क्षमता पर baculovirus बाँध करने के लिए हेपरिन की क्षमता बड़े पैमाने पर निर्माण की प्रक्रिया के लिए बहाव प्रसंस्करण समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा baculovirus, हेपरिन मध्यम भी अंय दूषित प्रोटीन है कि हेपरिन के लिए एक समानता बांधता है । कम आणविक भार दूषण के अधिकांश हेपरिन क्रोमैटोग्राफी चलाने के एक स्पर्श प्रवाह निस्पंदन (TFF) कदम बहाव सहित द्वारा समाप्त किया जा सकता है । TFF भी केंद्रापसारक के लिए एक विकल्प के रूप में प्रयोग किया जाता है उत्पाद20ध्यान केंद्रित ।

इस प्रोटोकॉल अंय वायरस और प्रोटीन है कि हेपरिन के लिए एक समानता है की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, वॉश और रेफरेंस बफर बंदिशों में संशोधन और फ्लोर रेट की आवश्यकता हो सकती है ।

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन अच्छी तरह से शुद्ध baculovirus supernatants सीधे का उपयोग कर काम करता है । इसलिए क्रूड baculovirus का इस्तेमाल रिकॉमबिनेंट प्रोटीन प्रोडक्शन के लिए किया जा सकता है । हालांकि, अगर baculoviruses के लिए एक सदिश के रूप में उपयोग किया जाता है vivo जीन स्थानांतरण, या एक टीके के रूप में, क्रोमैटोग्राफी, जेल निस्पंदन और/या ultracentrifugation के रूप में अतिरिक्त शुद्धीकरण कदम शुद्ध और केंद्रित baculovirus प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं कणों और विषाक्तता, सूजन, और एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने के लिए निर्माता सेल और संस्कृति मीडिया-प्राप्त अशुद्धियों को कम ।

अंत में, हम उत्पादन और baculovirus जो किया जा सकता है के शोधन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया है विनिर्माण रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, टीके के लिए, और जीन थेरेपी वैक्टर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

इस काम के भाग में सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन (CCRF) से M.N. और अभिनव कोर ग्रांट (ICG) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुवाद विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित शुरू से धन का समर्थन किया है पुरस्कार संख्या UL1 TR001425. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Akta Avant 150 GE Healthcare 28976337 Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column ThermoFisher Scientific 4333414 Heparin column
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Non-catalog item Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube Beckman-Coulter 326823 Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator  ThermoFisher Scientific Non-catalog item Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238071 Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks ThermoFisher Scientific 238072 Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41) Olympus Non-catalog item Cell monitoring and counting 
Table top centrifuge ThermoFisher Scientific 75253839/433607 For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube ThermoFisher Scientific 14-959-49A For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate ThermoFisher Scientific 07-200-80 Tissue culture treated plate
10-cm plate ThermoFisher Scientific 08-772E Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF EMD-Millipore SCHVU05RE Filtration unit
Kanamycin ThermoFisher Scientific 15160-054
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit ThermoFisher Scientific 10360-014 Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell ThermoFisher Scientific 12331-013 Competent cell for bacmid
TE buffer In-house Non-catalog item 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit ThermoFisher Scientific K2100-06 For bacmid purification
Sf9 Cells ThermoFisher Scientific 11496-015 Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium ThermoFisher Scientific 11605-094 Transfection medium
PBS ThermoFisher Scientific 20012227 Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media GE Healthcare SH30278.02 Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA In-house Non-catalog item Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II  ThermoFisher Scientific 10362 Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4737 Stabilizes Baculovirus
Cryovial Thomas Scientific 1222C24 For storage of Baculovirus
HT1080 cell line ATCC CCL-121 Fibroblast cell line
DMEM Sigma-Aldrich D6429 Growth media for cell lines
Wash buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer In-house Non-catalog item 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water In-house Non-catalog item For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 1.09137 For Akta Avant cleaning
Ethanol Sigma-Aldrich E7073 For Akta Avant cleaning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).

Tags

जेनेटिक्स अंक १३४ Baculovirus Sf9 कोशिकाएँ bacmid क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण हेपरिन स्तम्भ ultracentrifuge.
जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C. … More

Nasimuzzaman, M., van der Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. J. Vis. Exp. (134), e57019, doi:10.3791/57019 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter