Summary
이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.
Abstract
잠재는 전통적으로 재조합 단백질 및 백신의 생산을 위해 사용 되었습니다. 그러나, 최근에, 잠재 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 유망한 벡터로 떠오르고 있다. 여기, 잠재 Sf9 세포의 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA (bacmid)의 과도 transfection에 의해 생산 됩니다. 원하는 볼륨을 얻을 때까지 잠재 이후에 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀에 확장 됩니다. 그것은 다음 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 표면에 뜨는 문화에서 정화. 바이러스 표면에 뜨는 잠재 봉투 당단백질에 대 한 상쾌한 덤플링의 선호도 때문에 잠재 입자를 바인딩하는 덤플링 열에 로드 됩니다. 열 오염 물질을 제거 하는 버퍼와 세척 하 고 높은 소금 버퍼 열에서 잠재는 eluted. eluate isotonic 소금 농도를 희석 하 고 잠재 입자는 더 ultracentrifugation를 사용 하 여 집중. 이 메서드를 사용 하 여 잠재 전염 성 입자의 25% 회복으로 최대 500-fold 집중 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 1 L 문화에서 생산 고는 잠재의 정화를 보여줍니다, 하지만 메서드 수 수 확장-최대 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 임상 등급 벡터를 생산 하기 위해 폐쇄 시스템 정지 문화.
Introduction
잠재는 lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9에서에서 백신 및 재조합 단백질의 생산을 위해 주로 사용 된다 재조합 Autographa californica multicapsid 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcMNPV)를 사용 하 여 곤충 세포 1 , 2 , 3 , 4. 최근에, 그것은 유전자 치료 응용 프로그램5에 대 한 유망한 벡터로 나오고. 광범위 한 호스트 및 조직 차 있는 굴곡 운동 것으로 알려져, 무부하 및 확산 세포 감염, 비 병원 성 이며 호스트 염색체4,,56으로 통합 하지 않습니다. 또한, 잠재 미래 임상 생산1처리 폐쇄 시스템에 대 한 확장 가능 하 혈 청 무료 서 스 펜 션 문화에서 생산 수 있습니다.
잠재 입자의 순수성은 세포 독성7,,89를 최소화 하면서 효과적인 변환 달성 하기 위한 중요 합니다. 잠재는 ultracentrifugation 또는 접선 교류 여과 (TFF)는 infectivity에 제한 된 영향에 의해 집중 될 수 있습니다. 그러나,이 절차는 뿐만 아니라 바이러스 입자를 집중 하지만 또한 세포 파편과 단백질 Sf9에서 문화, 독성 생체 외에서 (개인적인 관찰) 될 수 있는 염증 또는 사용 하는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 vivo에서. 이 문제를 방지, 바이러스 주식 집중 매우 사용 하는 경우에 특히 감염 잠재 정화 하 여 입자 오염에서 분리 해야 합니다.
여러 가지 방법은 정화 및 잠재 벡터10,,1112의 농도 대 한 보고 되었습니다. 사용 가능한 접근의 덤플링을 친화성 크로마토그래피 단백질12오염의 낮은 농도와 정화의 한 단계 높은 수준의 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 잠재13,14에 대 한 수용 체로 heparan 황산 염의 식별을 기반으로 합니다. 열 및 잠재의 바인딩 Sf9 셀 상쾌한 로드, 후 열 생리 (isotonic) 버퍼 언바운드 또는 바운드 느슨하게 오염 입자를 제거 하 세척 될 수 있다. 헤 파 린에 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에, 잠재 입자 삼투성 충격12비활성화를 방지 하기 위해 생리 (isotonic) 소금 농도를 즉시 희석 한 높은 소금 버퍼 eluted 수 있습니다. 또한,에 캡처 뿐만 아니라 잠재, 생산 및 차입 크로마토그래피 열에서 수행할 수 있습니다 현재 좋은 제조 관행 (cGMP)와 호환이 되는 폐쇄 시스템 프로세스를 사용 하 여.
여기, 우리는 제조, 정화, 및 전염 성 잠재 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 원심 분리의 농도 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 짧게, 우리 Sf9 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA와 세포의 transfection에 의해 잠재를 생산 하 고 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 전염 성 잠재 확장. 우리는 잠재 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 정화 하 고 마지막 단계로 서 ultracentrifugation를 사용 하 여 높은 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 벡터를 집중.
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Protocol
프로토콜 요약을 그림 1 을 참조 하십시오.
1입니다. 잠재 플라스 미드 DNA의 정화
- Baculoviral 플라스 미드 DNA (bacmid)14 파운드 항생제; 국물의 200 ml에서를 포함 하는 세균성 문화를 성장 대 (50 µ g/mL), 항생물질 (10 µ g/mL), 그리고 gentamycin (7 µ g/mL), 300 rpm에서 궤도 통 설정에서 37 ° C에서 16 h.
- 표준 알칼리 성 세포의 용 해 프로토콜15를 사용 하 여 세균성 문화에서 bacmid DNA를 정화 하 고 해산 테 버퍼에 bacmid.
2입니다. 잠재 생산
- 135 rpm와 폴 리 카보 네이트 혈 청-무료 곤충 배양1,2,3를 포함 하는 삼각 플라스 크에에서 28 ° C에서 궤도 흔드는 인큐베이터에 문화 Sf9 셀.
참고: Sf9 세포는 냉동된 재고에서 동 하는 경우 최소 2 주 회복 하 고 성장의 지 수 단계를 입력 셀에 대 한 수 있습니다. - Trypan 파랑 얼룩 후 한 hemocytometer 성장 지 수 단계에서 수확 Sf9 셀을 계산 합니다. 씨앗 1 x 106 가능한 Sf9 셀 중간의 2 개 mL 6 잘 조직 문화 취급 접시에 잘 당. 셀 인큐베이터에서 28 ° C에서 1 시간에 대 한 연결을 허용 합니다.
- 혈 청 무료 unsupplemented 그레이스의 곤충 문화 매체의 1 mL에 성장 매체를 바꿉니다.
- 곤충 세포 transfection 시 약을 사용 하 여 Sf9 세포로 DNA bacmid transfect
- 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L 혼합 8 µ L 곤충 세포 transfection 시
- Bacmid DNA unsupplemented 곤충 매체의 100 µ L로의 2 µ g을 희석 하 고 vortexing에 의해 부드럽게 혼합.
- 희석된 곤충 세포 transfection 시 약 희석된 DNA를 결합 하 고 부드럽게 혼합. 실 온에서 15 ~ 30 분 동안 품 어.
- 셀에 dropwise DNA 지질 혼합물을 추가 합니다. 약 5 h 인큐베이터에서 28 ° C에서 품 어.
- 셀에서 transfection 혼합물을 제거 하 고 세척 2 mL PBS의 셀.
- 곤충 문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 미디어를 변경 하지 않고 문화 인큐베이터에서 28 ° C에서 진행 합니다.
참고: 경우는 bacmid 형광 단백질을 포함, 그 식 셀 48 h 후 transfection에 검색할 수 있습니다. 잠재 transfected Sf9 세포에 의해 생산 이며 문화 매체는 이후 untransfected 세포를 감염으로 분 비 합니다. 전체 셀 인구 5 일에 잠재 감염 되 고 cytopathic 효과 라고도 하는 바이러스 성 감염의 흔적을 보여줍니다. 이러한 증가 세포 직경, 그들/과 립 세포질, 세포 성장 정지에 죽거나 lysed 세포는 세포 배양에 있습니다. 그러나, transfection 또는 감염 효율 최적 하지 않으면 문화는 분명 cytopathic 효과 표시 되지 않을 수 있습니다. Cytopathic 효과 200-400 X 배율에서 거꾸로 위상 현미경으로 구상 될 수 있다. 잠재 감염 셀 안티 gp64 항 체11얼룩에 의해 감지할 수 있습니다. - 수확 잠재 표면에 뜨는 5 일 후 transfection 그리고 라벨 P1 바이러스 재고.
- PBS에는 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 함께 어둠 속에서 빛에 민감한, 표면에 뜨는, 잠재를 저장 합니다. 또는 장기-80 ° C에서 90 일 단기 (최대) 4 ° C에서 저장 합니다.
- 곤충 문화 매체의 10 ml에서-10cm 조직 문화 취급 접시에 종자 6 × 106 Sf9 셀. 셀에 초기 잠재 표면에 뜨는 (P1) 1 mL를 추가 합니다.
- 잠재 표면에 뜨는 (P2) 5번째 하루 후 감염에서 수확.
- 50 mL 삼각 플라스 크를 폴 리 카보 네이트는 250 mL에 곤충 문화 매체에서 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀 (3 x 106 셀/mL)와 장소는 궤도 흔드는 인큐베이터에 플라스 크의 씨. 셀에 P2 재고의 2 개 mL를 추가 하 고 135 rpm에서 28 ° c.의 일정 한 온도 유지 하면서 흔들어
참고: 감염 후 3 ~ 4 일 전체 Sf9 세포 인구 cytopathic 효과, 높은 titer 잠재 생산의 표시를 보여줄 것 이다. - 순차적으로 증폭 하는 잠재 supernatants 원하는 볼륨 (P3P4,...) 얻을 때까지 각 후속 감염에 세포 배양의 50-fold 볼륨을 10 증가 시켜.
참고: P3 는 감염 1 l Sf9의 500 ml는 세포 배양 감염 된 수 있습니다 표면에 뜨는; P2 잠재의 10 ~ 20 mL의 라운드 3rd P4 에 5 ~ 10 L Sf9의 세포 배양의 P3 잠재 상쾌한, 100 ~ 200 mL와 함께 감염 될 수 있는 감염의 라운드 4번째 이다. 일반적으로, Sf9 세포 3 × 106 셀/mL 혈 청-무료 곤충 문화 미디어에서에서 시드 있습니다. - 1000 x g 세포 파편을 제거 하 여 소화 genomic DNA와 RNA를 37 ° C에서 2 h 50 단위/mL nuclease (250 단위 / µ L 재고)와 표면에 뜨는 잠재 치료 4 ° C에서 30 분 동안에 표면에 뜨는 잠재 원심 0.45 μ m 여과 장치를 통해 supernatants 필터링.
3입니다. 크로마토그래피 시스템의 준비
- 샘플 및 버퍼 라인 각 살 균 물, 1 N 수산화 나트륨, 물, 순차적으로 rinsing 하 여 크로마토그래피 시스템을 준비 하 고 50 mL/min의 선형 유량에 버퍼 (20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 150 m m 염화 나트륨, pH 7.0)을 세척.
- 버퍼 (5 이력서 살 균 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 2 M 염화 나트륨, pH 7.0)을 청소 하는 열을 순차적으로 실행 하 여 준비 하는 헤 파 린 50 µ m 열 (10 × 10 cm, 7.9 mL 열 볼륨 (CV)의) 그리고 7 mL/min의 선형 흐름 속도로 이력서 워시 버퍼를 5.
4입니다. 잠재 벡터의 정화
- 크로마토그래피 시스템을 다음과 같이 설정:
- 표면에 뜨는 잠재 로드 입구 포트 로드 하는 예제를 사용 합니다.
- 워시 버퍼를 로드 하기 위한 버퍼 입구 포트 a 1을 사용 합니다. 워시 버퍼의 적어도 500 mL 한 병 준비 고 워시 버퍼 라인 병 합니다.
- 버퍼 입구 포트 a 2를 사용 하 여 로드 차입 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 1.5 M 염화 나트륨, pH 8.0으로). 차입 버퍼의 적어도 500 mL 한 병을 준비 하 고 병으로 차입 버퍼 라인을 배치.
- 표면에 뜨는 열 통과 잠재를 수집 하는 분수 수집기, 워시 버퍼 및 eluted 잠재에 몇 50 mL 원뿔 튜브를 삽입 합니다.
- 5 7.9 mL 열 량 (CVs) 워시 버퍼 (40 mL) 7.0 mL/min의 선형 유량에서의 헤 파 린 열 equilibrate
- 크로마토그래피 시스템의 샘플 펌프 (입구 샘플 포트)를 사용 하 여 선형 흐름 속도 2.0 mL/min의 헤 파 린 열에 표면에 뜨는 잠재의 250 mL 로드.
- 자외선 (UV) 흡 광도 곡선까지 2.0 mL/min의 선형 흐름 율에 헤 파 린 열 통해 10 CVs (80 mL) 워시 버퍼의 실행 (280 nm) 기준으로 돌아왔다 고 안정 된다.
- 때 잠재 입자 덤플링 열에서 해리 4.0 mL/분 시계는 크로마에 단백질의 날카로운 차입 피크의 선형 유량에서 차입 버퍼의 5 CVs (40 mL) 7.9 mL 헤 파 린 열에서 잠재 입자 elute.
- -차입, 즉시 eluted 잠재 상쾌한 다음 원심 분리 동안 삼투성 충격에서 잠재 입자의 비활성화를 방지 하기 위해 물에 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼를 사용 하 여 10 배 희석.
- 분수의 각각의 100 µ L를 저장, 잠재 상쾌한, 워시 버퍼와는 eluate 로드 하는 동안 수집 열 흐름 통해 포함 한. HT1080 정화 과정 (참조 섹션 6) 평가 하에 이러한 잠재 분수를 감염.
- 버퍼와 워시 버퍼를 청소 하는 열과 열을 청소. 마지막으로, 7.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 5 이력서 살 균 20% 에탄올에 물과 열을 린스와 4 ° c.에 저장
- 물, 1 N 수산화 나트륨, 물로 다시와 50.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 물에 20% 에탄올 크로마토그래피 시스템을 청소 하 고 시스템 20% 에탄올에 저장.
5입니다. 잠재의 농도
- 전 압력솥을 사용 하 여 원심 분리기 튜브 소독. 조직 문화 후드에서 각 ultracentrifuge 튜브를 표면에 뜨는 잠재의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 균형에 의해 튜브 무게를 측정 하 고 메 마른 PBS 가진 ultracentrifuge 튜브의 내용의 무게를 조정 합니다.
- Ultracentrifuge 튜브의 각 양동이 남서 32 Ti로 터의 반대에 놓습니다.
- 80000 × g에서 실행 하는 ultracentrifuge 4 ° c.에 90 분
- 조직 문화 후드에서 ultracentrifuge 튜브를 열고 aseptically 잠재 펠 릿을 제거 하지 않고 액체를 발음 합니다.
- 적극적으로 200 µ L 0.5% (w/vol) BSA 포함 하는 PBS와 아래로 pipetting으로 각 튜브의 펠 릿을 resuspend.
- Cryovials (병 당 50 ~ 100 µ L) 집중된 잠재 전송 하 고-80 ° c.에 저장
6입니다. 잠재의 적정
- 감염, 전날 HT1080 세포 세포 Trypan 푸른 얼룩 후 한 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. 2 ml Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 종자 1 x 105 HT1080 세포. 감염의 시간에 세포의 정확한 수를 확인할 수 씨앗 몇 가지 추가적인 우물. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 세포 문화.
참고: HT1080 세포 그들은 표현 하는 다른 셀 라인16에 비해 heparan 황산 염의 더 높은 수준으로 적정 사용 됩니다. 때문에 HT1080 세포 부착, 적정은 간단 하 고 전통적인 Sf9 기반으로 적정을 사용 하 여에 비해 적은 시간이 소요. - 감염의 날, 우물에서 셀을 계산 하 여 잘 당 셀의 수를 결정 합니다. 희석된 원래 잠재 되어 따로 설정 했다 열 정화, 이전 및 샘플에서 열 흐름 통해, 세척, 차입 분수를 추가 하 여 세포를 감염. 각 샘플에 대 한 희석과 실험적으로 감염 잠재 입자에 따라 볼륨을 확인 하 고 3 중에 각 잘 감염.
- 감염 후 2 일 관심사의 유전자의 표현에 대 한 셀을 분석 합니다. 셀 경우에 그들은 형광 성 단백질 (예: GFP)17익스프레스 교류 cytometer를 사용 하 여 분석할 수 있습니다.
- 계산 titers (전염 성 단위 mL 당) 감염, 희석 비율, 및 수식을 사용 하 여 셀에 형광 단백질의 백분율의 때에 존재 하는 셀의 수에 따라: (형광 단백질의 감염 × 비율 동안 셀 수 긍정적인 세포 × 희석 요인) / mL에 잠재의 볼륨.
참고: 예를 들어 감염 시 잘 당 세포의 총 수는 1.2 × 105, 형광 단백질의 비율 5%, 희석 비율 100, 이며 추가 희석된 잠재의 볼륨은 10 µ L는 titer 인지 6 × 107 전염 성 단위 (IU) /mL입니다.
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Representative Results
흐름 다이어그램 (그림 1)에서 제시 하는 프로토콜이입니다. 단계는 bacmid 생산 부착 문화 접시에, 혈 청 무료 정지 문화, nuclease 치료에 원심 분리와 여과, 정화 후속 증폭에 잠재 하는 DNA와 Sf9 세포의 과도 transfection를 포함 그리고 ultracentrifugation와 농도 정화 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 다음.
후 녹고, Sf9 세포 복구를 2 주 이상 필요 하 고 성장의 지 수 단계에 입력. 적극적으로 성장 하는 Sf9 세포 부착 문화에서 bacmid DNA와 페는. Transfection, 잠재 봉투 glycoproteins, 식 후 2 일 gp64 감지 되며 그 후, 잠재 생산 시작된11. 잠재 능력 복제 이기 때문에, 감염 된 세포의 수는 점차적으로 성장 매체로 은닉 되 새로 생산된 잠재 셀의 진보적인 감염 증가 합니다. 전체 세포 인구 감염 될 때 포함 하는 셀 supernatants 잠재 transfection 후 수확된 5 일 있습니다. 이 초기 바이러스 표면에 뜨는 1 (P1) 재고 통과로 지정 됩니다. P1 사진 더 큰 접시의 Sf9 세포의 새로 시드 부착 문화의 이후의 감염에 사용 됩니다. 전체 세포 인구 cytopathic 효과 (그림 2) 불리는 5 일에서 감염의 표시를 보여 줍니다. 두 번째 부착 세포 배양에서 상쾌한 수확 하 고 P2 주식으로 지정 됩니다. 잠재 상쾌한은 혈 청-무료 곤충 세포 배양 매체와 통 술병에 새롭게 추가 된 Sf9 세포의 지속적인 감염을 통해 Sf9 현 탁 액 문화에서 더 증폭 된다. 각 감염 주기의 끝에, 대부분 세포의 세포 직경 증가 및 잠재 감염의 완료에 대 한 징후가 죽거나 lysed 세포 cytopathic 효과 보여줍니다. 잠재 주식은 순차적으로 때까지 원하는 볼륨 (P3P4,...)은 증폭 된다. 상쾌한 저속 원심 분리, 점도, 이후 정화 및 농도 단계에 사용 되기 전에 0.45 μ 막 통해 필터링을 줄이기 위해 nuclease 치료 구분 Sf9 세포에서.
잠재 정화, 감염 된 Sf9 세포에서 상쾌한 덤플링 열에 로드 됩니다. 헤 파 린 열 점차 강력 하 게 바인딩된 잠재와 느슨하게 바인딩된 단백질 오염 물질 포화 된다. 헤 파 린 열은 자외선 (UV) 흡 광도 곡선까지 오염 물질을 제거 하는 워시 버퍼와 씻어 서 (280 nm) 기준선을 반환 하 고 나타내는 열에서 언바운드 및 바운드 느슨하게 재료의 제거, 안정 된다. 잠재 입자 다른 한편으로 강하게 덤플링 열에 바인딩합니다. 따라서, 바이러스의 상당한 양은 열 워시 버퍼에서 검색 됩니다. 헤 파 린 바인딩 잠재 입자는 eluted isotonicity를 달성 하 고 바이러스 비활성화 방지에 버퍼 pH 8.0과 10 배 희석에 염화 나트륨의 1.5 M. 단백질의 날카로운 피크 차입 잠재 분수 (그림 3)에 해당 하는 동안 관찰 됩니다. 샘플 로드, 세척, 및 순화 된 전염 성 잠재 입자의이 착 색 인쇄기 프로토콜 50% 이상 수확량 복구에 사용 되는 차입에 대 한 최적화 된 조건. 희석된 supernatants 추가 ultracentrifugation와 500-fold을 집중 하 고 0.5 %BSA 수율 그물 25% 복구11를 포함 하는 PBS에 공식화 했다.
그림 1 . 생산 및 잠재의 정화에 대 한 회로도. Sf9 셀 셀 문화 취급 접시 bacmid DNA와 페 시드 있습니다. 잠재 상쾌한 수확 이며 부착 문화에 새로운 Sf9 세포를 감염 하는 데 사용 합니다. 감염 된 세포는 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 이후에 전파 됩니다. 잠재 상쾌한은 nuclease 치료, centrifuged, 그리고 필터링. 잠재는 덤플링 친화성 크로마토그래피 열에 의해 순화, 버퍼, 희석 이며 aseptically ultracentrifugation에 의해 집중. 마지막으로, 표면에 뜨는 잠재-80 ° c.에 저장 됩니다. (그림 2016, Mol 거기 방법 Clin 개발. 2016; Nasimuzzaman 그 외 여러분에서 적응 되었습니다 3: 16071 허가.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 잠재의 cytopathic 효과 감염 Sf9 셀. 잠재 상쾌한 처리 조직 문화 접시의 Sf9 세포를 감염 시키는 사용 되었다. 감염 후 5 일 셀 거꾸로 위상 현미경으로 시각화 했다. A) 컨트롤으로 감염 되지 않은 Sf9 셀. B) 잠재 감염 Sf9 셀 cytopathic 효과 보여주는. 셀 200 배 확대에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 헤 파 린 친화성 크로마토그래피 중 흐름 통해 전염 성 잠재 수. 잠재 titers HT1080 세포의 감염에 의해 견적 되었다. 테스트 샘플 열 실행을 통해, 세척, 그리고 eluate 포함 했다. 필요에 따라 샘플 희석 했다. 선 (어두운 다이아몬드) 각 분수의 잠재의 총 감염 단위 (IU)를 보여줍니다. 열 흐름을 통해 샘플 및 워시 버퍼의 분수 크기 각 튜브에 40 mL 그리고 eluate 각 관에서 10 mL를 했다. (그림 2016, Mol 거기 방법 Clin 개발. 2016; Nasimuzzaman 그 외 여러분에서 적응 되었습니다 3: 16071 허가.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 Sf9 셀 서 스 펜 션 문화에 잠재의 생산과 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 잠재의 정화에 설명 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 매개 변수 수익률을 극대화 하 고 잠재 감염의 비활성화를 최소화 합니다. 여기에 제공 된 프로토콜 표시 복구에 비해 잠재 입자의 크게 향상 된 복구는9다른 사람에 의해 달성 됩니다.
때문에 광범위 한 호스트 범위와 조직 차 있는 굴곡 운동, 여러 연구는 중앙 신경 조직, 간, 눈, 난소, 전립선, 그리고 잠재 중재 유전자 배달5,6,7,8 고환에서 실시 되었다 . 자살 유전자, 종양 억제 유전자, 그리고 유전자 인코딩 종양 관련 항 원을 성공적으로 전 임상에서 실시 되었습니다 같은 치료 유전자를 포함 하는 잠재 벡터 동물 모델18,19. 잠재 인간 세포 transduce 수 있습니다, 하지만 그것은 곤충 세포에서 전파 될 수 고, 그 결과, 인간의 받는 사람에 게 위험을 일으키지 않는다는.
잠재는 bacmid DNA의 일시적인 transfection 여 곤충 세포에서 생산 됩니다. Bacmid의 품질이 높은 titer 잠재의 생산을 위한 중요 합니다. 일반적으로, 갓된 bacmid 그 시간의 긴 기간 동안 냉장고에 저장 된 보다 더 나은 수행 합니다. 적극적으로 성장 하는 Sf9 세포는 페 효율적으로 높은 titer 잠재 생산. 증폭 단계 동안 현 탁 액 문화에서 세포 농도 최적화 하는 것이 중요 하다 고 표면에 뜨는 잠재의 볼륨에 대 한 사용. 셀에 잠재 입자의 비율이 최적의 없으면 잠재의 수익률 예상된 (개인 관측, 미네소타) 보다 낮은 수 있습니다.
헤 파 린 열에 표면에 뜨는 잠재를 로드 하는 동안 그것은 열을 통해 전달 될 수 있습니다 바이러스 입자에 대 한 흐름을 통해 확인 하는 것이 중요. 경우, 낮은 열 속도 실행 해야 또는 작은 양의 상쾌한 열에 로드 해야 합니다. 잠재 supernatants에 오염 물질의 대부분은 크로마토그래피 실행의 세척 단계 동안 씻어. 우리 실버 착 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 잠재의 순수성 평가-polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 젤과 전자 현미경 연구 하 고 우리의 정화 baculoviruses 좋은 품질12을 발견.
우리는 바인딩 조건에 최적화 된 신중 하 게 있고 POROS 덤플링을 매체는 다른 헤 파 린 미디어 (예우수한 발견. HiTrap 또는 있다 헤 파 린) 잠재 입자 (개인적인 관찰) 캡처 하는 능력에서. 더 높은 샘플 속도 용량에 잠재 바인딩할 덤플링의 능력은 대규모 제조 공정에 대 한 다운스트림 처리 시간을 최소화 하는 것이 중요. 잠재, 게다가 덤플링을 매체는 또한 헤 파 린에 대 한 선호도 다른 오염 단백질을 바인딩합니다. 대부분 낮은 분자량 오염의 접선 교류 여과 (TFF) 단계 실행 덤플링 크로마토그래피의 하류를 포함 하 여 제거할 수 있습니다. TFF도 제품20집중을 원심 분리 하는 대신 사용 됩니다.
이 프로토콜은 다른 바이러스 및 헤 파 린에 대 한 선호도가지고 있는 단백질의 정화에 대 한 사용할 수 있습니다. 그러나, 세척 및 차입 버퍼 구성 및 흐름 율에 대 한 수정이 필요할 수 있습니다.
재조합 형 단백질 생산 잘 unpurified 잠재 supernatants 직접 사용 하 여 작동 합니다. 따라서, 원유 잠재 재조합 단백질 생산을 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, baculoviruses 또는 백신 유전자 이동 비보에 대 한 벡터로 사용 하는 경우 추가 정화 단계 착 색 인쇄기, 젤 여과 ultracentrifugation 등은 순수 하 고 집중 잠재를 얻기 위해 필요한 입자 고 독성, 염증과 면역 반응을 피하기 위해 프로듀서 세포 배양 유래 불순물을 최소화.
결론적으로, 우리는 생산 하 고 있는 수 수 수직 제조 재조합 단백질, 백신, 그리고 유전자 치료 벡터에 대 한 잠재의 정화에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 했습니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 시작 자금 신시내티 어린이 연구 재단 (CCRF)에서 M.N. 및 혁신적인 코어 그랜트 (ICG)에서 국립 보건원의 변환 과학 발전을 위한 국가 센터에 의해 지원에 의해 부분적으로 지원 보너스 번호 UL1 TR001425입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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