Summary
Neste protocolo, baculovirus é produzido pelo transfection transiente de baculovirus plasmídeo em células Sf9 e amplificado em uma cultura de suspensão livre de soro. O sobrenadante é purificado por cromatografia de afinidade de heparina e mais concentrado por ultracentrifugação. Este protocolo é útil para a produção e purificação de baculovirus para aplicação de terapia de gene.
Abstract
Baculovirus tem sido tradicionalmente usada para a produção de proteínas recombinantes e vacina. No entanto, mais recentemente, baculovirus está emergindo como um vetor promissor para aplicação de terapia de gene. Aqui, baculovirus é produzido por transfecção transiente o baculovirus do ADN do plasmídeo (bacmid) numa cultura de Sf9 células aderente. Baculovirus posteriormente é expandido em Sf9 células em uma cultura livre de soro suspensão até obter o volume desejado. Em seguida é purificado da cultura sobrenadante usando cromatografia de afinidade de heparina. Sobrenadante de vírus é carregado na coluna de heparina, que se liga a partículas de baculovirus no sobrenadante devido a afinidade de heparina para baculovirus envelop glicoproteína. A coluna é lavada com um buffer para remover contaminantes e baculovirus é eluída da coluna com um buffer de elevado-sal. O eluato é diluído a uma concentração de sal isotônica e baculovirus partículas estão mais concentradas usando ultracentrifugação. Usando esse método, baculovirus pode ser concentrado até 500-fold com uma recuperação de 25% de partículas infecciosas. Embora o protocolo descrito aqui demonstra a produção e purificação do baculovirus de culturas até 1 L, o método pode ser dimensionado-se em uma cultura fechada-sistema de suspensão para produzir um vetor de grau clínico para aplicação de terapia de gene.
Introduction
Baculoviridae é usado principalmente para a produção de proteínas recombinantes e vacinas em lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de insetos usando recombinante Autographa californica vírus de poliedrose nuclear multicapsid (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mais recentemente, está emergindo como um vetor promissor para gene terapia aplicação5. Ele é conhecido por ter um amplo acolhimento e tecido tropismo, infecta células quiescentes e proliferação, é não-patogênicas e não integrar o anfitrião cromossoma4,5,6. Além disso, baculovirus pode ser produzida em cultura de suspensão isento de soro que é escalável e permite o sistema fechado de processamento para produção futura Clínica1.
A pureza de baculovirus partículas é importante para a realização eficaz transdução minimizando a citotoxicidade7,8,9. Baculovirus pode ser concentrados por ultracentrifugação ou filtragem de fluxo tangencial (TFF) com impacto limitado na sua infecciosidade. No entanto, estes procedimentos não só concentrar partículas de vírus mas também restos celulares e proteínas de Sf9 cultura, que pode ser tóxico em vitro (observação pessoal) e podem induzir a inflamação ou uma resposta imune quando usado na vivo. Para evitar isso, especialmente quando usando altamente concentradas ações de vírus, baculovirus infecciosas precisa ser purificado e separado da contaminação de partículas.
Vários métodos têm sido relatados para a purificação e concentração de baculovirus vetores10,11,12. As abordagens disponíveis, cromatografia de afinidade de heparina permite um nível elevado de etapa única de purificação com a baixa concentração de proteínas12a contaminar. O método baseia-se na identificação do sulfato de heparan como receptor para baculovirus13,14. Depois de carregar Sf9 sobrenadante de célula na coluna e vinculação de baculovirus, a coluna pode ser lavada com buffer (isotônico) fisiológico para remover as partículas contaminantes frouxamente acopladas ou não acopladas. Desde que a ligação a heparina é reversível, baculovirus partículas podem ser eluídas com um buffer de sal elevado, o que dilui-se imediatamente a concentração de sal (isotônica) fisiológica para evitar inativação por choque osmótica12. Além disso, a produção de baculovirus, bem como captura na e eluição da coluna de cromatografia, pode ser realizada usando um processo do sistema fechado que é compatível com o atual boas práticas de fabricação (cGMP).
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a manufatura, purificação e concentração de baculovirus infecciosas usando centrifugação e cromatografia de afinidade. Brevemente, produzimos baculovirus por transfecção de células Sf9 com um plasmídeo baculovirus em cultura aderente e expandir ainda mais o baculovirus infecciosas na cultura de suspensão livre de soro. Podemos purificar baculovirus usando cromatografia de afinidade de heparina e usar ultracentrifugação como etapa final para altamente concentrado do vetor para a aplicação de terapia de gene.
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Protocol
Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o protocolo.
1. purificação de Baculovirus plasmídeo
- Crescer a cultura bacteriana contendo baculoviral Plasmideo DNA (bacmid)14 em 200 mL de caldo LB com antibióticos; canamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), para 16 h a 37 ° C, em um cenário de agitador orbital a 300 rpm.
- Purificar o bacmid DNA da cultura bacteriana usando lise alcalina padrão protocolo15e dissolver o bacmid em tampão TE.
2. produção de Baculovirus
- Células de cultura Sf9 em uma incubadora de agitador orbital a 135 rpm e 28 ° C, em um frasco de Erlenmeyer contendo meio de cultura livre de soro inseto1,2,3de policarbonato.
Nota: Se Sf9 células são descongeladas de estoque congelado, deixe pelo menos duas semanas para as células para recuperar e digite a fase exponencial de crescimento. - Conte as células de Sf9 colhidas na fase exponencial de crescimento com um hemocytometer após coloração com azul de Tripan. 1 x 106 células viáveis Sf9 por alvéolo em uma placa de cultura de tecidos tratados 6-poços em 2 mL do meio da semente. Permitir que a célula anexar por 1h a 28 ° C em uma incubadora.
- Substitua o meio de crescimento com 1 mL de meio de cultura de livre de soro unsupplemented Grace inseto.
- Transfect o bacmid de DNA nas células Sf9 usando o reagente de Transfeccao de células de inseto.
- Mix 8 µ l célula inseto reagente de transfeccao com 100 µ l de meio de inseto da Grace.
- Diluir 2 µ g de bacmid DNA em 100 µ l de meio unsupplemented de insetos e misture suavemente pela utilização do vortex.
- Combinar o DNA diluído com o reagente de Transfeccao de célula inseto diluídos e misture delicadamente. Incube durante 15 a 30 min à temperatura ambiente.
- Adicione a mistura de DNA-lipídico gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C em uma incubadora para aproximadamente 5h.
- Retire a mistura de transfecção de células e lavar as células com 2 mL de PBS.
- Adicionar 2 mL de meio de cultura de inseto e continuar a cultura a 28 ° C em uma incubadora, sem alterar a mídia.
Nota: Se o bacmid contém uma proteína fluorescente, sua expressão pode ser detectado em transfeccao pós de células 48 h. Baculoviridae é produzido por células transfectadas de Sf9 e secretada para o meio de cultura que posteriormente infecta as células untransfected. A população de toda a célula torna-se infectado com baculovirus em 5 dias e mostra sinais de infecção viral, também chamado de efeito citopático. Estes incluem o diâmetro maior célula, vacúolos/grânulos no citoplasma, cessação do crescimento celular e células mortas ou lisadas estão presentes na cultura de pilha. No entanto, se a eficiência da transfecção ou infecção não é o ideal, a cultura não pode apresentar um efeito citopático óbvio. O efeito citopático pode ser visualizado com um microscópio de fase invertido na ampliação de X 200-400. Célula de Baculovirus infectado pode ser detectada pela coloração com de anticorpo anti-gp6411. - Colheita de baculovirus sobrenadante 5 dias depois transfection e rótulo como o estoque de vírus1 P.
- Armazene o baculovirus sobrenadante, que é sensível à luz, no escuro, com 0,5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Armazenar a 4 ° C para o curto prazo (até 90 dias) ou a-80 ° C para o longo prazo.
- Semente 6 × 106 Sf9 células em uma placa de cultura de tecidos tratados 10 cm em 10 mL de meio de cultura de insetos. Adicione 1 mL do sobrenadante inicial baculovirus (P1) para as células.
- Colheita de baculovirus sobrenadante (P2) em 5 pós-infecção dia deth .
- 50 mL de Sf9 células (3 x 106 células/mL) na cultura de suspensão em meio de cultura inseto em um policarbonato 250 mL frasco Erlenmeyer e coloque o frasco em uma incubadora de agitador orbital de semente. Adicionar 2 mL de caldo de2 P para as células e agitar a 135 rpm, mantendo uma temperatura constante de 28 ° C.
Nota: Três ou quatro dias após a infecção, toda a população de células Sf9 mostrará o efeito citopático, que é uma indicação de baculovirus sendo o título de alta produção. - Sequencialmente, amplificar os sobrenadantes de baculovirus até o volume desejado é obtido (P.3, P4,...), aumentando 10 a 50-fold volume de cultura de células em cada infecção subsequente.
Nota: P3 é o 3rd redondo de infecção em qual 500 mL para 1 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 10 a 20 mL de P2 baculovirus sobrenadante; P4 é 4th redondo de infecção em que 5 a 10 L de Sf9 cultura celular pode estar infectada com 100 a 200 mL do sobrenadante de baculovirus P3 e assim por diante. Normalmente, as células Sf9 são semeadas em 3 × 106 células/mL em meios de cultura livre de soro inseto. - Centrifugue o baculovirus sobrenadante a 1.000 x g durante 30 min a 4 ° C para remover restos celulares e tratar o baculovirus sobrenadante com nuclease de 50 unidades/mL (250 unidades / µ l de estoque) por 2 h a 37 ° C para digerir o genoma de DNA e RNA. Filtre os sobrenadantes através de uma unidade de filtração 0,45 μm.
3. preparação do sistema de cromatografia
- Preparar o sistema de cromatografia enxaguando sequencialmente as amostra e buffer de linhas cada com água estéril, 1 N de hidróxido de sódio, água e lavar o tampão (20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.0) a uma taxa de fluxo linear de 50 mL/min.
- Preparar uma coluna µm de heparina 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume de coluna (CV)) executando sequencialmente coluna limpeza Reserva (5 CV estéril 20 mM de fosfato de sódio tampão contendo 2 M de cloreto de sódio, pH 7.0) e o tampão de lavagem 5 CV em uma taxa de fluxo linear de 7 mL/min.
4. purificação de Baculovirus Vector
- Configure o sistema de cromatografia da seguinte forma:
- Use o exemplo de porta de entrada para carregar o baculovirus sobrenadante de carregamento.
- Use a porta de entrada do tampão A1 para carregar o tampão de lavagem. Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de lavagem e coloque a linha de tampão de lavagem no frasco.
- Use a porta de entrada do tampão A2 para carregar o buffer de eluição (20 mM de fosfato de sódio com 1,5 M de cloreto de sódio, pH 8.0). Prepare uma garrafa pelo menos 500 mL de tampão de eluição e coloque a linha do tampão de eluição para a garrafa.
- Inserir diversos tubos de 50ml cónico o coletor de fração para coletar a coluna passagem baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o baculovirus eluted.
- Equilibrar a coluna de heparina com cinco volumes de coluna de 7,9 mL (CVs) de tampão de lavagem (40 mL) em uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min.
- Carrega 250 mL do sobrenadante para a coluna de heparina usando a bomba de amostra (porta de amostra de entrada) do sistema de cromatografia em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min de baculovirus.
- Executar 10 CVs (80 mL) de tampão de lavagem através da coluna de heparina em uma taxa de fluxo linear de 2,0 mL/min até a curva de absorção ultravioleta (UV) (280 nm) retornou à linha de base e torna-se estável.
- Eluir as baculovirus partículas da coluna 7,9 mL de heparina com 5 CVs (40 mL) de tampão de eluição, a uma taxa de fluxo linear de 4,0 mL/min. relógio para um pico de eluição afiada de proteína no cromatograma, quando as partículas de baculovirus dissociam a coluna de heparina.
- Pós-eluição, imediatamente, diluir o sobrenadante de baculovirus eluted usando 10-fold 20 mM de tampão de fosfato de sódio em água para evitar a inativação de partículas de baculovirus de choque osmótica durante a subsequente centrifugação.
- Loja de 100 µ l de cada uma das frações, incluindo a coluna de passagem recolhidos durante o carregamento de baculovirus sobrenadante, o tampão de lavagem e o eluato. Infectar estas frações de baculovirus para HT1080 para avaliar o processo de purificação (ver secção 6).
- Limpe a coluna com coluna limpar o buffer e o tampão de lavagem. Finalmente, lavar a coluna com 5 CV estéril 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 7,0 mL/min e armazenar a 4 ° C.
- Limpar o sistema de cromatografia com água, 1 N de hidróxido de sódio, novamente com água e 20% de etanol em água a uma taxa de fluxo linear de 50,0 mL/min e armazenar o sistema em 20% de etanol.
5. concentração de Baculovirus
- Pre-esterilize tubos de centrífuga usando uma autoclave. Adicione um volume igual de baculovirus sobrenadante para cada tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos. Medir o peso do tubo por um equilíbrio e ajustar o peso do conteúdo dos tubos se com PBS estéril.
- Cada um dos tubos se coloque em oposição balde do rotor SW 32 Ti.
- Executar o se a 80.000 g × para 90 min a 4 ° C.
- Abra os tubos se numa vizinhança de cultura de tecidos e assepticamente, aspirar o líquido sem retirar a pelota de baculovirus.
- Resuspenda o pellet de cada tubo pipetando vigorosamente acima e para baixo com 200 µ l de PBS contendo 0,5% (w/vol) BSA.
- Transferir o baculovirus concentrado para cryovials (50 a 100 µ l por frasco) e armazenar a-80 ° C.
6. titulação de Baculovirus
- O dia antes da infecção, conte as células de HT1080 usando um hemocytometer após coloração de células com Trypan azul. Semente de 1 x 105 HT1080 células por poço em uma placa de 6 em 2 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Sementes vários poços adicionais para ser capaz de determinar o número exato de células presentes no momento da infecção. Cultura de células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
Nota: Células HT1080 são utilizadas para a titulação como eles expressam um maior nível de sulfato de heparan em comparação com as outras células linhas16. Uma vez que as células HT1080 são aderentes, titulação é mais simples e menos demorado em comparação com usando a titulação Sf9-baseado tradicional. - No dia de infecção, determine o número de células por poço pela contagem de células de poços. Infectar as células, adicionando o baculovirus original diluída que tinha foram retiradas antes da purificação da coluna e com amostras da coluna de passagem, lavagem e frações de eluição. Para cada amostra, determine a diluição e volume empiricamente com base em partículas infecciosas baculovirus e infectar a cada poço em triplicado.
- Dois dias após a infecção, analise as células para a expressão do gene de interesse. As células podem ser analisadas utilizando um citômetro de fluxo se expressam uma proteína fluorescente (por exemplo, GFP)17.
- Calcular a concentração (unidade infecciosa por mL) baseada no número de células presentes no momento da infecção, o factor de diluição e porcentagens de proteína fluorescente nas células usando a fórmula: (número de células durante a porcentagem de infecção × de proteína fluorescente factor de diluição × células positivas) / volume de baculovirus no mL.
Nota: Por exemplo, se o número total de células por bem no momento da infecção é 1.2 × 105, a porcentagem de proteína fluorescente é de 5%, o factor de diluição é 100 e o volume de baculovirus diluídos adicionado é de 10 µ l, o título é 6 × 107 unidades infecciosas (IU) /mL.
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Representative Results
O protocolo apresentado é em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem o transfection transiente de Sf9 células com bacmid DNA para produzir baculovirus em cultura aderente em uma placa, a subsequente amplificação em cultura de suspensão isento de soro, tratamento de nuclease e clarificação por centrifugação e filtração, e a purificação usando a cromatografia de afinidade de heparina seguido de concentração com ultracentrifugação.
Depois que descongelar, Sf9 células precisam pelo menos de duas semanas para se recuperar e entrar na fase exponencial de crescimento. Crescendo ativamente Sf9 células são transfected com bacmid DNA em cultura aderente. Dois dias depois de transfeccao, expressão da glicoproteína do envelope de baculovirus, gp64 é detectado e posteriormente, baculovirus produção iniciada11. Desde baculovirus é replicação competente, o número de células infectadas aumenta gradualmente devido a uma infecção progressiva das células com o recém-produzido baculovirus que é secretada para o meio de crescimento. Baculovirus contendo sobrenadantes de células são colhidos 5 dias depois do transfection quando a população de toda a célula tem de tornar-se infectado. Este vírus inicial sobrenadante é designado como passagem 1 (P1) ações. O estoque de1 P é usado para a infecção de uma cultura aderente recém semeada de Sf9 células numa placa maior. A população de toda a célula mostra sinais de infecção nos 5 dias que é chamado de efeito citopático (Figura 2). O sobrenadante da cultura de células aderentes a segunda é colhido e é designado como estoque de2 P. Baculovirus sobrenadante é ainda mais amplificado na cultura de suspensão Sf9 através de infecção em curso de recém adicionado Sf9 células num balão de agitador com meio de cultura celular de soro livre de insetos. No final de cada ciclo de infecção, a maioria das células mostram efeito citopático com diâmetro celular aumento de células mortas ou lisadas, que são sinais para a conclusão de baculovirus infecção. Estoque de Baculovirus sequencialmente é amplificado até o volume desejado é obtido (P.3, P4,...). O sobrenadante é separado das células Sf9 por centrifugação de baixa velocidade, tratada com uma nuclease para reduzir a viscosidade, filtrada através de uma membrana de 0,45 μm, antes de serem utilizados nas etapas subsequentes da purificação e concentração.
Para purificar o baculovirus, sobrenadante de células infectadas Sf9 é carregado em uma coluna de heparina. A coluna de heparina gradualmente se torna saturada com baculovirus fortemente acoplados e frouxamente ligado proteínas contaminantes. A coluna de heparina é lavada com tampão de lavagem para remover contaminantes até a curva de absorção ultravioleta (UV) (280 nm) retorna à linha de base e se torna estável, indicando a remoção dos materiais frouxamente acoplados e desacoplados da coluna. Por outro lado, partículas de Baculovirus vincular fortemente à coluna de heparina. Portanto, nenhuma quantidade significativa de vírus é detectada em tampão de lavagem da coluna. Partículas de baculovirus heparina-limite são eluídas com 1,5 M de cloreto de sódio em pH 8.0 e 10-fold diluído com buffer para atingir os isotonicity e evitar a inativação de vírus. Um pico afiado da proteína é observado durante a eluição que corresponde a fração de baculovirus (Figura 3). As condições otimizadas para carregamento de amostra, lavagem e eluição usado nesta recuperação cromatografia de protocolo rendimento mais de 50% de partículas de baculovirus infecciosas purificadas. Sobrenadantes diluídos são ainda mais concentrados até 500-fold com ultracentrifugação e formulados em PBS contendo 0,5% BSA, que produz um líquido 25% recuperação de11.
Figura 1 . Diagrama esquemático para a produção e purificação de baculovirus. Sf9 células são semeadas na placa tratada com cultura de células transfectada com bacmid DNA. Baculovirus sobrenadante é colhida e usada para infectar novas células Sf9 na cultura aderente. Células infectadas são propagadas posteriormente na cultura de suspensão livre de soro. Baculovirus sobrenadante é tratada com uma nuclease, centrifugada e filtrada. Baculoviridae é purificado por cromatografia em coluna de afinidade de heparina, diluído em tampão e concentrado assepticamente por ultracentrifugação. Finalmente, baculovirus sobrenadante é armazenado a-80 ° C. (A figura foi adaptada de Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther métodos Clin dev. 2016; 3: 16071 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Citopático efeitos de baculovirus infectava células Sf9. Baculovirus sobrenadante foi usado para infectar as células Sf9 em uma placa de cultura de tecidos tratada. Cinco dias depois da infecção, as células foram visualizadas com um microscópio de fase invertido. A) células não infectadas Sf9 como um controle. B) Baculovirus infectado Sf9 células mostrando o efeito citopático. As células são mostradas na ampliação de X 200. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . O número de baculovirus infecciosas em escoamento durante a cromatografia de afinidade de heparina. Títulos de Baculovirus foram estimados pela infecção de células HT1080. Amostras testadas foram incluindo o ensaio de coluna, lavagem e eluído. As amostras foram diluídas conforme necessário. A linha (diamantes escuros) mostra as unidades infecciosas totais (IU) de baculovirus em cada fração. O tamanho da fração da amostra de fluxo através da coluna e o tampão de lavagem foram 40 mL em cada tubo, e eluído foi 10 mL em cada tubo. (A figura foi adaptada de Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther métodos Clin dev. 2016; 3: 16071 com permissão.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve a produção de baculovirus no Sf9 células em cultura de suspensão e purificação de baculovirus usando uma cromatografia de afinidade de heparina. Os parâmetros usados neste protocolo maximizar o rendimento e minimizar a inactivação de baculovirus infecciosas. O protocolo fornecido aqui mostra que uma recuperação significativamente melhorada de baculovirus partículas em comparação com as recuperações alcançado por outros9.
Devido ao tropismo gama e tecido de amplo acolhimento, vários estudos foram conduzidos no sistema nervoso central, fígado, olho, ovário, próstata e testículo com gene mediada por baculovirus entrega5,6,7,8 . Vetores de Baculovirus que contém genes terapêuticos, tais como genes suicidas, genes supressores de tumor e genes codificação antígenos do tumor-específicos foram realizados com êxito em pré-clínicos animal modelos18,19. Apesar de baculovirus pode transduce células humanas, só podem ser propagado em células de insetos e, em consequência, não representam um risco para destinatários humanos.
Baculoviridae é produzida em células de inseto por transfecção transiente de bacmid DNA. A qualidade do bacmid é fundamental para a produção de baculovirus alta-título. Normalmente, preparada na hora bacmid executa melhor do que aqueles são armazenados na geladeira por longo período de tempo. Crescendo ativamente Sf9 células são transfectadas com eficiência que produzem alta-título baculovirus. Durante a fase de amplificação, é importante otimizar a concentração de células em cultura a suspensão e o volume de baculovirus sobrenadante utilizado para infecção. Se a proporção de partículas de baculovirus para células não é o ideal, o rendimento de baculovirus pode ser menor do que o esperado (observação pessoal, MN).
Ao carregar o baculovirus sobrenadante para a coluna de heparina, é importante verificar a passagem de partículas de vírus que podem estar passando através da coluna. Se isso ocorrer, uma coluna de baixa velocidade de executar pode ser necessária ou menor volume de sobrenadante deve ser carregado na coluna. A maioria dos contaminantes presentes nos sobrenadantes de baculovirus é lavada fora durante a etapa de lavagem da execução de cromatografia. Nós avaliamos a pureza de baculovirus pela coloração prata de Dodecil sulfato de sódio (SDS)-estudos e descobriu que nosso baculoviruses purificados são de boa qualidade12gel de polyacrylamide gel para eletroforese (página) e elétron microscópico.
Temos cuidadosamente otimizado das condições de vinculação e descobriu que o meio de heparina POROS é superior a outros meios de heparina (por exemplo. HiTrap ou Capto heparina) em sua capacidade de capturar partículas de baculovirus (observação pessoal). A capacidade de heparina para vincular baculovirus em maior capacidade e velocidade de amostra é importante para minimizar o tempo de processamento a jusante para o processo de fabricação em grande escala. Além de baculovirus, médio de heparina também se liga outras proteínas contaminantes que têm uma afinidade com heparina. Maior parte da contaminação de baixo peso molecular pode ser eliminados, incluindo uma etapa de filtração (TFF) de fluxo tangencial a jusante da cromatografia de heparina executar. TFF também é usado como uma alternativa para centrifugação para concentrar o produto20.
Este protocolo pode ser usado para a purificação de outros vírus e proteínas que têm afinidade com heparina. No entanto, as modificações para a composição de tampão de lavagem e eluição e a taxa de fluxo podem ser necessárias.
Produção de proteínas recombinantes trabalha bem usando sobrenadantes de baculovirus impuro diretamente. Portanto, baculovirus bruto pode ser usado para a produção de proteínas recombinantes. No entanto, se baculoviruses são usados como um vetor para a transferência de genes na vivo , ou como uma vacina, etapas de purificação adicionais tais como a cromatografia, filtração de gel e/ou ultracentrifugação são necessárias para obter o baculovirus pura e concentrada partículas e minimizar impurezas e meios de cultura-derivado de células de produtor para evitar toxicidade, inflamação e uma resposta imune.
Em conclusão, descrevemos um protocolo simples para a produção e purificação de baculovirus que pode ser dimensionado-up para a produção de proteínas recombinantes, vacinas e vetores de terapia de gene.
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Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado em parte financiando o start-up de Cincinnati infantil Research Foundation (CCRF) M.N. e inovador núcleo Grant (ICG) apoiado pelo centro nacional para Ciências translacionais avançando do National Institutes of Health, sob Prêmio número UL1 TR001425. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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