Summary
En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.
Abstract
Baculovirus se ha utilizado tradicionalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas. Sin embargo, más recientemente, baculovirus se perfila como un prometedor vector para el uso de la terapia génica. Aquí, el baculovirus es producido por transitorios de la transfección del plásmido baculovirus ADN (bacmid) en una cultura adherente de células Sf9. Baculovirus se amplía posteriormente en células Sf9 en una cultura de suspensión libre de suero hasta obtener el volumen deseado. Luego se purifica de la cultura de sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sobrenadante el virus es cargado en la columna de heparina que se une partículas de baculovirus en el sobrenadante debido a la afinidad de la heparina por baculovirus envuelven glicoproteína. La columna se lava con un buffer para eliminar los contaminantes y baculovirus es eluida de la columna con un amortiguador de sal. El eluido se diluye a una concentración isotónica de sal y baculovirus partículas están más concentrados mediante ultracentrifugación. Usando este método, baculovirus puede ser concentrado hasta 500-fold con una recuperación del 25% de partículas infecciosas. Aunque el protocolo descrito aquí muestra la producción y purificación de los baculovirus de culturas hasta 1 L, el método puede ser escalado-para arriba en una cultura de suspensión de sistema cerrado para producir un vector de tipo clínico para uso de la terapia génica.
Introduction
Baculovirus se utiliza principalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas en lepidópteros Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de los insectos mediante el uso de recombinante virus de poliedrosis nuclear multicapsid de Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. más recientemente, se perfila como un prometedor vector gene terapia aplicación5. Es conocido por tener un amplio tropismo tejido y host, infecta las células quiescentes y proliferación, es no patógena y no integrar en el anfitrión cromosomas4,5,6. Además, se pueden producir baculovirus en cultura de suspensión libre de suero que es escalable y permite para sistema cerrado de procesamiento para la producción futura clínica1.
La pureza de las partículas de los baculovirus es importante para el logro de transducción eficaz minimizando la citotoxicidad7,8,9. Baculovirus puede concentrarse por ultracentrifugación o filtración de flujo tangencial (TFF) con impacto limitado en su infectividad. Sin embargo, estos procedimientos no sólo concentran las partículas del virus sino también detritos celulares y proteínas de Sf9 de la cultura, que pueden ser tóxicos en vitro (observación personal) y pueden inducir inflamación o respuesta inmune cuando se usa en vivo. Para evitar esto, sobre todo cuando uso altamente concentrado acciones de virus, baculovirus infecciosas debe ser purificado y separado de las partículas de contaminantes.
Varios métodos se han divulgado para la purificación y concentración de vectores de baculovirus10,11,12. De los métodos disponibles, cromatografía de afinidad de heparina permite un solo paso alto nivel de purificación con la baja concentración de contaminantes proteínas12. El método se basa en la identificación del sulfato del heparan como receptor de baculovirus13,14. Después de cargar el sobrenadante de células Sf9 sobre la columna y la vinculación de baculovirus, se puede lavar la columna con tampón fisiológico (isotónica) para eliminar partículas contaminantes ligeramente consolidadas o no consolidadas. Puesto que la Unión a la heparina es reversible, partículas de baculovirus pueden eluidas con un tampón salino alto, que se diluye inmediatamente a la concentración de sal (bebidas isotónica) fisiológica para evitar la inactivación por choque osmótico12. Por otra parte, la producción de baculovirus, así como captura en y la elución de la columna de cromatografía, se puede realizar mediante un proceso de sistema cerrado que es compatible con las actuales buenas prácticas de manufactura (cGMP).
Presentamos un protocolo detallado para la fabricación, purificación y concentración de baculovirus infecciosas mediante centrifugación y cromatografía de afinidad. Brevemente, producimos baculovirus por transfección de células Sf9 con un ADN de plásmido de baculovirus en cultura adherente y ampliar el baculovirus infecciosa en cultivo de suspensión libre de suero. Purificar el baculovirus mediante cromatografía de afinidad de heparina y usar ultracentrifugación como paso final para altamente concentrado el vector para el uso de la terapia génica.
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Protocol
Vea la figura 1 para una ilustración que resume el protocolo.
1. purificación de ADN de plásmido de Baculovirus
- Crece cultivo bacteriano que contiene baculovirales plásmido ADN (bacmid)14 en 200 mL de LB caldo con antibióticos; kanamicina (50 μg/mL), tetraciclina (10 μg/mL) y gentamicina (7 μg/mL), de 16 h a 37 ° C en un entorno de Agitador orbital a 300 rpm.
- Purificar el bacmid ADN de la cultura bacteriana con lisis alcalina estándar protocolo15y disolver el bacmid en solución tampón TE.
2. producción de Baculovirus
- Células Sf9 en cultivo en un Incubador agitador orbital 135 rpm y 28 ° C en un matraz Erlenmeyer que contenga medio de cultivo libre de suero insectos1,2,3de policarbonato.
Nota: Si las células Sf9 son descongeladas en stock congelado, deje al menos dos semanas para que las células para recuperarse y entrar en la fase exponencial de crecimiento. - Contar las células Sf9 cosechadas en fase exponencial de crecimiento con un hemocitómetro después de la tinción con azul de tripano. Semilla 1 x 106 Sf9 células viables por pozo en una placa de cultivo de tejidos tratados 6 bien en 2 mL de medio. Permite a la célula unir por 1 h a 28 ° C en una incubadora.
- Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL insectos de suero sin suplemento Grace medio de cultivo.
- Transfectar bacmid ADN en las células Sf9 con el reactivo de transfección de células de insecto.
- Mezcla 8 μl célula insectos transfección de reactivo con 100 μl de medio de insecto de gracia.
- Diluir 2 μg de bacmid ADN en 100 μl de medio sin suplemento de insectos y mezcle suavemente con un vórtex.
- Combinar el ADN diluido con el reactivo de transfección de células de insecto diluido y mezclar suavemente. Incubar durante 15 a 30 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla de ADN de lípidos gota a gota en las células. Incubar a 28 ° C en una incubadora durante aproximadamente 5 horas.
- Retire la mezcla de la transfección de las células y lavan las células con 2 mL de PBS.
- Añadir 2 mL de medio de cultivo de insectos y continuar a la cultura a 28 ° C en una incubadora sin cambiar los medios de comunicación.
Nota: Si el bacmid contiene una proteína fluorescente, su expresión se puede detectar en la transfección de células 48 h. Baculovirus es producida por células Sf9 transfected y secretan en el medio de cultivo que posteriormente infecta a las células untransfected. La población de toda la célula se infecta con baculovirus en 5 días y muestra signos de infección viral, también llamado efecto citopático. Estos incluyen diámetro creciente de la célula, las vacuolas/gránulos en el citoplasma, cesación del crecimiento celular y las células muertas o sometidas a lisis están presentes en cultivo celular. Sin embargo, si la eficiencia de la transfección o infección no es óptima, la cultura no puede mostrar un evidente efecto citopático. El efecto citopático puede visualizarse con un microscopio invertido de fase con aumentos de 200-400. Baculovirus infectadas células pueden detectarse mediante tinción con anticuerpos de anti-gp6411. - La cosecha baculovirus sobrenadante 5 días después de transfección y la etiqueta como la acción de virus P1 .
- Guarde el sobrenadante, baculovirus que es sensible a la luz, en la oscuridad con 0.5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Almacenar a 4 ° C para el corto plazo (hasta 90 días) o a-80 ° C a largo plazo.
- Semillas 6 × 106 Sf9 células en una placa de cultivo de tejidos tratados 10 cm en 10 mL de medio de cultivo de insectos. Añadir 1 mL de sobrenadante de baculovirus inicial (P1) a las células.
- Sobrenadante de baculovirus (P2) en post-infección 5 demayo día de la cosecha.
- Semilla de 50 mL de células Sf9 (3 x 106 células/mL) en cultivo de suspensión en medio de cultivo insectos en un policarbonato de 250 mL matraz Erlenmeyer y coloque el frasco en un Incubador agitador orbital. Añadir 2 mL de stock de2 P a las células y agitar a 135 rpm manteniendo una temperatura constante de 28 ° C.
Nota: Tres o cuatro días después de la infección, toda la población de células Sf9 mostrará efecto citopático, que es una indicación de la producción del alto-título baculovirus. - Ampliar secuencialmente los sobrenadantes de baculovirus hasta obtener el volumen deseado (P3, P4,...) mediante el aumento de 10 a 50-fold volumen de cultivo de células en cada infección subsecuente.
Nota: P3 es el 3rd ronda de infección en que 500 mL a 1 L de Sf9 cultivos celulares pueden ser infectados con 10 a 20 mL de P2 baculovirus sobrenadante; P4 es 4th alrededor de la infección en que 5 a 10 L de Sf9 cultivos celulares pueden ser infectados con 100 a 200 mL de sobrenadante de baculovirus P3 y así sucesivamente. Por lo general, se siembran las células Sf9 en 3 × 106 células/mL en medios de cultivo libre de suero insectos. - Centrifugar el sobrenadante a 1.000 x g durante 30 min a 4 ° C para eliminar los residuos celulares y tratar el baculovirus sobrenadante con 50 nucleasa unidades/mL (250 unidades/μl de caldo) por 2 h a 37 ° C para digerir el ADN y el ARN genómico de baculovirus. Filtrar el sobrenadante a través de una unidad de filtración de 0.45 μm.
3. preparación del sistema de cromatografía de
- Preparar el sistema de cromatografía de enjuague secuencialmente las muestra y tampón líneas cada uno con 1 N hidróxido de sodio en agua estéril, agua y lavar tampón (tampón de fosfato de sodio 20 mM que contienen cloruro de sodio 150 mM, pH 7.0) a una velocidad de flujo lineal de 50 mL/min.
- Preparar una columna de μm de heparina 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volumen (CV) de la columna) ejecutando secuencialmente columna limpieza de tampón (5 CV estéril 20 mM sodio fosfato buffer que contiene cloruro de sodio del de 2 M, pH 7.0) y tampón de lavado de 5 CV a un flujo lineal de 7 mL/min.
4. purificación del Vector de Baculovirus
- Configurar el sistema de cromatografía como sigue:
- Utilizar la muestra de carga del puerto de entrada para cargar el baculovirus sobrenadante.
- Utilizar el puerto de entrada de buffer A1 para cargar el tampón de lavado. Preparar una botella con al menos 500 mL de tampón de lavado y colocar la línea de tampón de lavado en la botella.
- Utilice el puerto de entrada de buffer A2 para cargar el buffer de elución (20 mM fosfato de sodio con cloruro de sodio de 1,5 M, pH 8.0). Preparar una botella con al menos 500 mL de tampón de elución y colocar la línea de tampón de elución en la botella.
- Inserte varios tubos cónicos de 50 mL en el colector de fracciones para recoger la columna paso baculovirus sobrenadante, el tampón de lavado y el baculovirus eluídas.
- Equilibrar la columna de heparina con cinco volúmenes de columna de 7,9 mL (CVs) de tampón de lavado (40 mL) a un flujo lineal de 7.0 mL/min.
- Carga de 250 mL de sobrenadante a la columna de heparina utilizando la bomba de la muestra (puerto de entrada de la muestra) del sistema de cromatografía a un flujo lineal de 2,0 mL/min de baculovirus.
- Ejecutar 10 CVs (80 mL) de tampón de lavado a través de la columna de la heparina en un flujo lineal de 2,0 mL/min hasta la curva de absorbancia (UV) ultravioleta (280 nm) ha vuelto a la línea de base y se convierte en estable.
- Eluir las partículas de baculovirus de la columna de 7,9 mL heparina con 5 CVs (40 mL) de tampón de elución a un flujo lineal de 4,0 mL/min de reloj para un pico agudo de elución de la proteína en el cromatograma cuando las partículas de baculovirus disocian de la columna de la heparina.
- La elución, diluir inmediatamente el sobrenadante de baculovirus eluídas 10 veces usando 20 mM de tampón fosfato de sodio en agua para evitar la inactivación de baculovirus partículas de choque osmótico durante la centrifugación posterior.
- Almacenar 100 μl de cada una de las fracciones, incluyendo la columna paso recogido durante la carga del sobrenadante de baculovirus, el tampón de lavado y el efluente. Infectar a estas fracciones de baculovirus a HT1080 para evaluar el proceso de purificación (véase sección 6).
- Limpiar la columna con tampón y tampón de lavado de limpieza de la columna. Por último, enjuagar la columna con 5 CV estéril 20% de etanol en agua a una velocidad de flujo lineal de 7.0 mL/min y almacenar a 4 ° C.
- Limpiar el sistema de cromatografía con agua, hidróxido de sodio 1 N, otra vez con agua y 20% de etanol en agua a una velocidad de flujo lineal de 50,0 mL/min y almacenar el sistema en 20% de etanol.
5. concentración de Baculovirus
- Pre esterilizar con autoclave los tubos de centrífuga. Añadir un volumen igual de sobrenadante de baculovirus en cada tubos de ultracentrífuga en una campana de cultivo de tejidos. Medir el peso del tubo por un equilibrio y ajuste el peso del contenido de los tubos de la ultracentrífuga con PBS estéril.
- Coloque cada uno de los tubos de la ultracentrífuga oponerse a cubo del rotor SW 32 Ti.
- Corren la ultracentrífuga de 80.000 g × 90 min a 4 ° C.
- Abrir los tubos de la ultracentrífuga en una campana de cultivo de tejidos y aspirar asépticamente el líquido sin la eliminación de la pelotilla de baculovirus.
- Resuspender el precipitado de cada tubo mediante pipeteo vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con 200 μL de PBS con 0,5% BSA (w/vol).
- Transferir el baculovirus concentrado para crioviales (50 a 100 μl por vial) y almacenar a-80 ° C.
6. valoración de Baculovirus
- El día antes de la infección, contar las células HT1080 usando un hemocitómetro después de la tinción las células con Trypan blue. 1 x 105 HT1080 células por pocillo en una placa de 6 pozos en 2 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) de la semilla. Semillas varios pozos adicionales para poder determinar el número exacto de células presentes en el momento de la infección. Cultura de las células en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
Nota: Las células HT1080 se utilizan para la valoración como expresan un mayor nivel de heparán sulfato en comparación con la otra célula líneas16. Puesto que las células HT1080 son adherentes, titulación es más simple y menos desperdiciador de tiempo en comparación con usando la tradicional valoración basada en Sf9. - En el día de la infección, determinar el número de células por pocillo contando las células de los pozos. Infectar a las células mediante la adición de los baculovirus original diluida que había sido destinado antes de purificación de la columna y con muestras de la columna fluir-por, lavado y elución fracciones. Para cada muestra, determinar la dilución y el volumen basado empíricamente en las partículas infecciosas de baculovirus e infectar a cada pocillo por triplicado.
- Dos días después de la infección, analizar las células para la expresión del gen de interés. Las células pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo si expresan una proteína fluorescente (e.g. GFP)17.
- Calcular los títulos (unidad de infecciosa por mL) basados en el número de células presentes en el momento de la infección, el factor de dilución y porcentajes de proteínas fluorescentes en las células usando la fórmula: (número de células durante el porcentaje de infección × de proteína fluorescente factor de dilución de las células positivas x) / volumen de baculovirus en mL.
Nota: Por ejemplo, si el número total de células por pocillo en el momento de la infección es de 1,2 × 105, el porcentaje de proteína fluorescente es 5%, el factor de dilución es 100 y el volumen de baculovirus diluida añadir es de 10 μl, el título es 6 x 107 unidades infecciosas (IU) / ml.
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Representative Results
El protocolo presentado es en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen los transitorios de la transfección de células Sf9 con bacmid ADN para producir baculovirus en cultura adherente en una placa, la amplificación posterior en cultura de suspensión libre de suero, nucleasa tratamiento y clarificación por centrifugación y filtración, y la purificación mediante la cromatografía de afinidad de heparina seguida por concentración con ultracentrifugación.
Después de descongelar, Sf9 células necesitan al menos dos semanas para recuperarse y entrar en la fase exponencial de crecimiento. Creciendo activamente Sf9 células son transfectados con bacmid ADN en cultura adherente. Dos días después de la transfección, expresión de las glicoproteínas de la envoltura del baculovirus, gp64 es detectado y posteriormente, producción de baculovirus es iniciado11. Baculovirus es replicación competente, el número de células infectadas aumenta gradualmente debido a una infección progresiva de las células con el baculovirus nuevamente producido que es secretada al medio de crecimiento. Baculovirus que contiene sobrenadantes de células son cosechadas 5 días después de la transfección ha infectado la población de toda la célula. Este virus inicial sobrenadante es designado como paso 1 acción (P1). El stock de1 P se utiliza para la infección subsecuente de una cultura adherente recién sembrada de células Sf9 en una placa grande. La población de toda la célula muestra señales de infección en 5 días que se llama efecto citopático (figura 2). El sobrenadante de cultivo celular adherente segundo se cosecha y se señala como P2 . Sobrenadante de baculovirus se amplifica más en Sf9 cultura de suspensión a través de continua infección de recién añadidas células Sf9 en un matraz de coctelera con medio de cultivo celular sin suero insectos. Al final de cada ciclo de infección, la mayoría de las células muestran efecto citopático con un mayor diámetro celular y las células muertas o sometidas a lisis, que son señales para la terminación de la infección de baculovirus. Stock de baculovirus se amplifica secuencialmente hasta obtener el volumen deseado (P3, P4,...). El sobrenadante se separa de las células Sf9 por centrifugación a baja velocidad, tratado con una nucleasa para reducir viscosidad, filtrado a través de una membrana de 0.45 μm, antes de ser utilizados en los posteriores pasos de purificación y concentración.
Para purificar el baculovirus, sobrenadante de células infectadas Sf9 se carga sobre una columna de heparina. La columna de heparina poco a poco se satura con baculovirus fuertemente consolidados y libremente dependiente de proteínas contaminantes. La columna de heparina, se enjuaga con tampón de lavado para eliminar los contaminantes hasta la curva de absorbancia (UV) ultravioleta (280 nm) regresa a la línea de base y se convierte en estable, indicando que el retiro de los materiales y libremente de la columna. Partículas de baculovirus por otra parte fuertemente se unen a la columna de la heparina. Por lo tanto, no hay gran cantidad de virus se detecta en el tampón de lavado de columna. Baculovirus de heparina-limite las partículas se eluyen con 1.5 M de cloruro de sodio a pH 8.0 y diluido 10 veces con el tampón para alcanzar isotonicity y para prevenir la inactivación del virus. Se observa un pico agudo de proteína durante la elución, que corresponde a la fracción de baculovirus (figura 3). Las condiciones optimizadas para la carga de la muestra, lavado y elución utilizado en esta recuperación cromatografía protocolo rendimiento de más del 50% de partículas de baculovirus infecciosos purificados. Sobrenadantes diluidos son más concentradas hasta 500-fold con la ultracentrifugación y formulados en PBS con 0,5% BSA, que da un neto de recuperación 25%11.
Figura 1 . Diagrama esquemático de la producción y purificación de baculovirus. Se siembran las células SF9 en placa tratados con cultura células transfectada con bacmid ADN. Sobrenadante de baculovirus es cosechado y utilizado para infectar nuevas células Sf9 en cultura adherente. Las células infectadas se propagan posteriormente en la cultura de suspensión libre de suero. Sobrenadante de baculovirus es tratado con una nucleasa, centrifugado y filtrado. Baculovirus es purificado por cromatografía de columna de afinidad de heparina, diluido en buffer y concentrado aséptico por ultracentrifugación. Por último, baculovirus sobrenadante se guarda a-80 ° C. (La figura ha sido adaptada de Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther métodos Clin dev. 2016; 3: 16071 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Efectos citopáticos de baculovirus infectan las células Sf9. Baculovirus sobrenadante se utilizó para infectar las células Sf9 en una placa de cultivo de tejidos tratado. Cinco días después de la infección, las células se visualizaron con un microscopio de fase invertido. A) las células Sf9 no infectada como control. B) Baculovirus infectan las células Sf9 con efecto citopático. Las células muestran un aumento de 200 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . El número de baculovirus infecciosas a través de flujo durante la cromatografía de afinidad heparina. Títulos de baculovirus se estimaron por la infección de las células HT1080. Muestras analizadas fueron incluyendo el repaso de la columna, lavado y elución. Las muestras se diluyeron cuando sea necesario. La línea (diamantes oscuros) muestra el total de unidades infecciosa (IU) de baculovirus en cada fracción. El tamaño de la fracción de la columna a través de flujo muestra y tampón de lavado fueron 40 mL en cada tubo y eluído fue 10 mL en cada tubo. (La figura ha sido adaptada de Nasimuzzaman et al., 2016, Mol Ther métodos Clin dev. 2016; 3: 16071 con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo que presentamos describe la producción de baculovirus en células Sf9 en cultura de suspensión y purificación de baculovirus mediante una cromatografía de afinidad de heparina. Los parámetros utilizados en el presente Protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de baculovirus infecciosas. El protocolo que aquí se muestra que una recuperación significativamente mayor de partículas de baculovirus en comparación con recuperaciones alcanzada por otros9.
Debido al tropismo de tejido y gama amplia acogida, se realizaron varios estudios en el sistema nervioso central, hígado, ojo, ovario, próstata y testículos con baculovirus-mediated gene entrega5,6,7,8 . Vectores de baculovirus que contiene genes terapéuticos, genes suicidas, genes supresores de tumores y genes codificación antígenos tumorales se han realizado con éxito en preclínica animal modelos18,19. Aunque baculovirus puede transducir las células humanas, sólo puede ser propagado en células de los insectos y, en consecuencia, no suponer un riesgo para los receptores humanos.
Baculovirus se produce en células de los insectos por transitorios de la transfección de DNA de bacmid. La calidad de bacmid es fundamental para la producción de baculovirus alto-título. Por lo general, recién preparada bacmid realiza mejor que ésos se almacenan en el refrigerador durante largo periodo de tiempo. Creciendo activamente Sf9 células son transfectados eficientemente que producen alto-título baculovirus. Durante la fase de amplificación, es importante optimizar la concentración de células en la cultura de la suspensión y el volumen de sobrenadante de baculovirus usados para la infección. Si la proporción de partículas de baculovirus en células no es óptimo, la producción de baculovirus puede ser inferior a la esperada (observación personal, MN).
Al cargar el baculovirus sobrenadante a la columna de la heparina, es importante controlar el flujo a través de las partículas del virus que puede estar pasando por la columna. Si eso ocurre, una velocidad inferior de la columna puede ser necesario o menor volumen de sobrenadante debe ser cargado en la columna. La mayoría de los contaminantes presentes en los sobrenadantes de baculovirus se lava durante la etapa de lavado de la carrera de cromatografía. Evaluamos la pureza de baculovirus por tinción de plata de sodio dodecil sulfato (SDS)-gel de poliacrilamida gel electroforesis (PAGE) y microscopio electrónico estudio y encontró que el baculovirus purificadas son buena calidad12.
Cuidadosamente hemos optimizado las condiciones de Unión y encontró que la media de la heparina POROS es superior a otros medios de heparina (por ejemplo. La heparina HiTrap o Capto) en su capacidad de capturar partículas de baculovirus (observación personal). La capacidad de la heparina baculovirus a mayor velocidad de muestra y capacidad es importante para minimizar el tiempo de procesamiento de aguas abajo para el proceso de fabricación a gran escala. Además de baculovirus, medio de la heparina también une a otras proteínas contaminantes que tienen una afinidad por la heparina. La mayoría de la contaminación de bajo peso molecular puede eliminarse mediante la inclusión de un paso de filtración (TFF) tangencial del flujo aguas abajo de la cromatografía de heparina ejecutar. TFF también se utiliza como una alternativa a la centrifugación para concentrar el producto20.
Este protocolo se puede utilizar para la purificación de otros virus y las proteínas que tienen una afinidad por la heparina. Sin embargo, modificaciones en la composición de tampón de lavado y de elución y la tasa de flujo pueden ser necesarios.
Producción de proteína recombinante trabaja bien con sobrenadantes de baculovirus directamente. Por lo tanto, baculovirus crudo puede utilizarse para la producción de proteínas recombinantes. Sin embargo, si se utilizan baculovirus como vector para la transferencia de genes en vivo o como una vacuna, pasos de purificación adicionales como cromatografía de gel filtración, ultracentrifugación son necesarios para obtener puro y concentrado de baculovirus las partículas y reducir al mínimo las impurezas derivadas del celular y medios de cultivo productor para evitar toxicidad, inflamación y respuesta inmune.
En conclusión, hemos descrito un protocolo simple para la producción y purificación de baculovirus que puede ser escalado-para arriba para la fabricación de proteínas recombinantes, vacunas y vectores de terapia génica.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado en parte por la financiación de puesta en marcha de Fundación de investigación de niños de Cincinnati (CCPR) M.N. y el innovador núcleo Grant (ICG) apoyado por el centro nacional para avanzar las Ciencias traslacional de los institutos nacionales de salud en Premio número UL1 TR001425. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
