Summary
Nous présentons ici un test de perméabilité vasculaire de cerveau de souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion qui s’applique aux modèles animaux du dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique. Un hemi-cerveau est utilisé pour évaluer la perméabilité quantitativement et l’autre pour traceur visualisation/immunostaining. La procédure prend 5 à 6 h pour 10 souris.
Abstract
Barrière hémato - encéphalique (BHE) est une barrière spécialisée qui protège le microenvironnement de cerveau de toxines et d’agents pathogènes dans la circulation et maintient l’homéostasie du cerveau. Les sites principaux de la barrière sont des cellules endothéliales des capillaires cerveau dont la fonction barrière résulte des jonctions intercellulaires et transporteurs d’efflux exprimées sur la membrane plasmique. Cette fonction est régie par les péricytes et astrocytes qui forment ensemble l’unité neurovasculaire (UNV). Plusieurs maladies neurologiques telles que des accidents vasculaires cérébraux, la maladie d’Alzheimer (ma), les tumeurs cérébrales sont associées à une fonction altérée de BBB. Évaluation de la perméabilité BBB est donc essentielle pour évaluer la gravité de la maladie neurologique et le succès des stratégies de traitement employées.
Nous présentons ici un simple, pourtant test de perméabilité robustes qui ont été appliqués avec succès à plusieurs souris modèles génétiques et expérimentale. La méthode est très quantitative et objective par rapport à l’analyse de fluorescence du traceur par microscopie qui est couramment appliquée. Dans cette méthode, les souris sont injectés par voie intrapéritonéale avec un mélange de solution aqueuses traceurs fluorescents inertes suivie d’anesthésier les souris. La perfusion cardiaque des animaux est effectuée avant leur récolte de cerveau, des reins ou des autres organes. Organes sont homogénéisés et centrifugés suivie par mesure de la fluorescence du surnageant. Tirés de la ponction cardiaque juste avant la perfusion de sang sert pour le but de la normalisation dans le compartiment vasculaire. La fluorescence de tissu est normalisée à la fluorescence de sérum et poids humide pour obtenir un quantitatif indice de perméabilité de traceur. Pour une confirmation supplémentaire, hemi-cerveau controlatérale préservé pour immunohistochemistry peut être utilisé à traceurs fluorescence visualisation des fins.
Introduction
La barrière sang - encéphalique (BHE) se compose des cellules endothéliales microvasculaires (ECs) pris en charge par des péricytes étroitement associés (SCP), qui sont entourées dans la lame basale, et les astrocytes (ACs) qui enveloppent la membrane basale avec leurs embouts1 ,2. ECs interagissent avec plusieurs types de cellules qui soutiennent et régulent la fonction de barrière, principalement les ACs et les PC, et aussi les neurones et les cellules microgliales, qui ensemble constituent l’unité neurovasculaire (UNV). Le NVU est critique pour la fonction de la BHE, qui limite le transport des toxines véhiculées par le sang et les agents pathogènes de pénétrer dans le cerveau. Cette fonction est le résultat de la jonction serrée molécules tels que claudin-5, occludin, zonula occludens-1, qui se trouvent entre l’ECs et aussi grâce à l’action des transporteurs comme la p-glycoprotéine (P-gp) cet efflux de molécules qui entrent dans l’endothélium de nouveau dans le navire lumen1,2,3. Le BBB permet toutefois pour le transport de molécules essentielles comme les nutriments (glucose, fer, acides aminés) par des transporteurs spécifiques exprimés sur les membranes plasmiques de ce1,2,3. La couche d’EC est fortement polarisée en ce qui concerne la répartition des différents transporteurs entre la luminale (sang-face) et abluminal (cerveau face à membranes) pour permettre le transport spécifique et vectoriel fonction4,5 . Alors que la BHE est protectrice à l’égard de bien réguler le milieu de la CNS, c’est un défi majeur pour l’administration de médicaments CNS dans des maladies comme la maladie de Parkinson avec un BBB fonctionnel. Même dans les maladies neurologiques présentant une dysfonction BBB, on ne peut présumer que l’administration de médicaments du cerveau augmente autant que le dysfonctionnement de la barrière pourrait inclure des dégâts aux cibles transporteur spécifique par exemple comme dans la maladie d’Alzheimer (ma). Dans AD, plusieurs transporteurs de bêta-amyloïde comme LRP1, RAGE, P-gp sont connus pour être dysrégulation et donc cibler ces transporteurs pourrait être futile6,7,8. Le BBB est altérée chez plusieurs maladies neurologiques comme la méningite AVC, AD, sclérose en plaques- et du cerveau tumeurs9,10,11. Restaurer la fonction barrière est un élément crucial de la stratégie thérapeutique et son évaluation est donc critique.
Dans ce travail, nous avons décrit une objective et quantitative protocole pour l’analyse de la perméabilité chez les rongeurs que nous avons appliqué avec succès à plusieurs lignées de souris les deux maladies expérimentales et transgéniques modèles10,12,13 ,,14. La méthode est basée sur une simple injection intrapéritonéale de traceurs fluorescents, suivie d’une perfusion des souris pour enlever les traceurs du compartiment vasculaire. Cerveau et autres organes sont prélevés post perfusion et évalués par un objectif de perméabilité et indice de perméabilité absolue fondée sur des mesures de fluorescence des homogénats de tissus dans un lecteur de plaque. Toutes les valeurs brutes de fluorescence ont été corrigés pour l’arrière-plan à l’aide d’homogénats de tissus ou de sérum provenant d’animaux d’imposture qui ne reçoivent pas tous traceur. Un grand normalisations sont incluses pour volume de sérum, sérum fluorescence et le poids des tissus, produisant ainsi des index de perméabilité qui est absolu et comparables entre les expériences et les types de tissus. Pour faciliter la comparaison entre les groupes, les valeurs d’index de perméabilité absolue peuvent se transformer facilement ratios que nous avions effectué précédemment12. Parallèlement, stockée hemi-cerveau et les reins pourraient être utilisés pour la visualisation du traceur par microscopie de fluorescence10. La microscopie de fluorescence classique pourrait être utile à obtenir une différence régionale perméabilité quoique encombrant en raison de la sélection subjective de coupes de tissus et d’images pour une analyse semi-quantitative. Les étapes détaillées sont présentées dans le protocole et les notes sont ajoutées, le cas échéant. Ceci fournit les informations nécessaires pour effectuer avec succès le test de perméabilité in vivo chez la souris qui peuvent être adaptés à d’autres petits animaux. Le test peut être appliqué à beaucoup de genres de traceurs permettant la charge et la taille fondé l’évaluation de la perméabilité par une combinaison de traceurs avec les spectres de fluorescence distinctes.
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Protocol
Tous les animaux ont été traités avec soin, minimisant la douleur ou l’inconfort lors de la procédure. Cette procédure suit les directives de protection des animaux de notre institution et a été approuvée par le Comité local (Regierungspraesidium Darmstadt, numéro d’homologation FK/1044).
Un schéma des étapes de travail pour l’analyse perméabilité in vivo chez la souris est illustré à la Figure 1. Les détails de chaque étape sont décrites ci-dessous.
1. animal de manutention
-
Préparation et administration des traceurs et anesthésiques
- Préparer les tubes étiquetés et moules pour incorporation au moins une journée avant le dosage de la perméabilité des tissus. Maintenir des conditions stériles dans tout le protocole en travaillant sous une hotte de laboratoire propre et en utilisant les outils nettoyés avec de l’éthanol à 80 %. Utiliser le mâle ou femelle sauvage (WT) ou souris de CD1 (GOF) pour le gain de fonction angiopoietin-2 (Ang-2) dans le groupe d’âge adult mature de 3 à 6 mois pour le protocole actuel. Effectuer un génotypage des souris comme décrit plus haut 10.
Remarque : 80 % d’alcool n’entraînera des instruments stériles mais réduira au minimum la contamination des échantillons préparés. - Diluer tous les traceurs dans du PBS stérile en stocks de 2 mM et stocker les aliquotes à l’abri de la lumière à-20 ° C.
- Choisissez des traceurs tels que (tétraméthyl Rhodamine) TMR et (isothiocyanate de fluorescéine) FITC avec les spectres d’excitation/émission distincts et qui sont lysine fixable entraînant une interférence minimale entre les colorants, microscopie à fluorescence (en utilisant le TMR ou FITC filtrer respectivement) et par fluorimétrie dans un lecteur de plaque pour le test de perméabilité.
Remarque : Dextran TMR 3 kD et dextran FITC 3 kD utilisés dans l’étude sont les deux lysine réparable et ainsi pourrait être également utilisées pour immunohistochemical analyse après fixation avec les aldéhydes afin d’étudier les différences régionales. - Traiter tous les animaux avec soin en suivant les directives de placement en institution. Injecter par voie intrapéritonéale chaque souris avec 100 µL de solution de traceur qui peut être augmentée jusqu'à 200 µL lorsqu’un traceur supplémentaire est associé à l’aide de 100 µL de chaque traceur dans un mélange 1:110,13. Injecter au moins un animal avec du PBS seul au lieu de traceurs pour servir de contrôle sham pour la soustraction du fond autofluorescence.
- 5 min après l’injection du traceur, anesthésier l’animal avec une injection de i.p de kétamine et de Xylazine (100 mg et 5 à 10 mg chez 0,9 % Solution Saline par corps kg poids respectivement 150 µL du cocktail par souris 25 g).
NOTE : Vet onguent ne était pas appliqué sur les yeux au cours de la procédure comme la période comprise entre animaux anesthésie et perfusion/sacrifice était brève (10 minutes) où aucun séchage des yeux n’était pas observée.
- Préparer les tubes étiquetés et moules pour incorporation au moins une journée avant le dosage de la perméabilité des tissus. Maintenir des conditions stériles dans tout le protocole en travaillant sous une hotte de laboratoire propre et en utilisant les outils nettoyés avec de l’éthanol à 80 %. Utiliser le mâle ou femelle sauvage (WT) ou souris de CD1 (GOF) pour le gain de fonction angiopoietin-2 (Ang-2) dans le groupe d’âge adult mature de 3 à 6 mois pour le protocole actuel. Effectuer un génotypage des souris comme décrit plus haut 10.
-
Perfusion sanguine collection et cardiaque
- Préparer les animaux pour la perfusion cardiaque 10 min après l’administration de l’anesthésie. Vérifier l’absence de réponse en secousse patte afin de s’assurer que l’animal atteint un plan chirurgical de l’anesthésie.
- Posez les animaux sur leur dos et appliquer l’éthanol à 80 % sur la peau de la zone abdominale. À l’aide de petits ciseaux, ouvrir la paroi abdominale avec une petite incision (2 cm) juste sous la cage thoracique. Séparer le foie de la membrane et couper lentement à travers le diaphragme, exposant ainsi la cavité pleurale 15.
- Couper la cage thoracique au niveau bilatéral et fixer le sternum coupé afin d’exposer le ventricule gauche. Insérer une aiguille à ailettes de calibre 21 connectée à un système de perfusion péristaltique dans la partie postérieure du ventricule gauche.
- Perforer l’oreillette droite et rapidement (moins de 10 s) recueillir 200-300 µL de sang libéré dans la cavité thoracique à l’aide de pointes de pipette de 1 mL (avec coupure de la fin) dans les tubes de prélèvement de sérum et placez-le sur la glace.
Remarque : Cette procédure de perfusion est sans survie. - Dès que le sang est prélevé, mettre en marche le système de perfusion (10-12 t/mn, 5 mL/min) et perfuse l’animal pendant 3 min à chaud (RT) 1 x PBS (libre de Ca2 + /ions Mg2 + ).
NOTE : PBS contenant Ca2 +/Mg2 + ions peuvent être utilisées pour une meilleure activité cardiaque durant la perfusion. Le montant total de PBS, utilisé pour la perfusion est de l’ordre de 15 à 20 mL. - Évaluer la qualité de la perfusion en notant la couleur du foie, reins, qui apparaissent blanc/pale après la perfusion.
NOTE : Rein ou perfusion hépatique n’indiquent pas nécessairement la perfusion cérébrale comme les artères (carotides vertébrale) atteignant le cerveau de l’aorte peut obtenir s’est rompu lors de la préparation à l’étape 3, en particulier pendant la ponction auriculaire.
2. tissu traitement
- Stockage et collection de l’orgue
- À la fin de la perfusion, confirmer la mort de l’animal par dislocation cervicale et récolte de cerveau et les reins. Vérifiez la perfusion du cerveau par la couleur des cerveaux (pas visible de sang dans les vaisseaux des méninges), afin d’exclure les animaux de l’analyse de la perméabilité lorsque la qualité de la perfusion n’est pas bonne. Le cerveau se divisent en 2 hemibrains à l’aide d’un scalpel (Figure 1).
- Disséquer avec un hemibrain d’un bistouri sans lobes olfactifs et cervelet et transférer le hemicerebrum dans un tube de 2 mL. Stocker les hemi-cervelet dans un tube supplémentaire si nécessaire pour l’évaluation de la perméabilité cérébelleux.
- Transférer un rein unique dans un autre tube 2 mL. Stocker les échantillons immédiatement sur la glace sèche.
- Intégrer nativement le rein restant et le hemi-cerveau (comprenant le cervelet et les lobes olfactifs) température de coupe optimale de tissu-tek (O.C.T) composé sur la glace sèche.
- En fin de compte, centrifuger les échantillons de sang stockés sur la glace dans les tubes de prélèvement de sérum à 10, 000 g, 10 min à 4 ° C. Transfert de surnageants de sérum pour tubes de 1,5 mL et placez-les dans le récipient de glace sèche.
- Tous les échantillons prélevés sur carboglace congélateur-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure de transfert.
Remarque : Il est important congeler les échantillons avant de procéder aux étapes homogénéisation comme l’homogénéisation des augmentations de l’efficacité après que la congélation décongélation.
- Homogénéisation et centrifugation
- Laisser décongeler sur glace hemi-cerveau et les reins congelés vers le bas à-80 ° C et peser les tubes contenant les organes. De ces poids, soustraire la valeur moyenne de plusieurs tubes vides (environ 20) pour obtenir le poids du tissu. Ajouter 300 µL et 200 µL de froid 1 X PBS pour les tubes contenant les reins et hemi-cerveau, respectivement.
Remarque : pour des montants inférieurs des tissus (comme hemi-cervelet, inférieures à 100 mg) pesant les tubes individuels est recommandé. - Homogénéiser chaque échantillon dans le tube eppendorf original avec un pilon de polytétrafluoroéthylène (PTFE) attaché à un agitateur électrique aérienne (1, 000 tr/min) en effectuant environ 15 accidents vasculaires cérébraux (1 AVC = 1 haut et 1 bas). Rincer le pilon avec PBS entre échantillons et sécher avant de passer à l’échantillon suivant.
Remarque : L’utilisation de détergents au cours de l’homogénéisation a été évitée en raison de l’interférence avec la fluorométrie. Cependant, traceur intracellulaire est également détectée dans le présent protocole que le tissu soit bien homogène, qui est plus efficace après un cycle de gel dégel. - Stocker les échantillons homogénéisés sur glace protégé de la lumière et la centrifugeuse tous ensemble en fin de compte à 15 000 g, 20 min, 4 ° C dans une centrifugeuse de table. Transfert de surnageants à un nouveaux tubes de 1,5 mL sur la glace pour fluorométrie immédiate ou à-80 ° C à analyser plus tard.
- Laisser décongeler sur glace hemi-cerveau et les reins congelés vers le bas à-80 ° C et peser les tubes contenant les organes. De ces poids, soustraire la valeur moyenne de plusieurs tubes vides (environ 20) pour obtenir le poids du tissu. Ajouter 300 µL et 200 µL de froid 1 X PBS pour les tubes contenant les reins et hemi-cerveau, respectivement.
- Quantification et mesure de la fluorescence
- Si gelé à la fin de l’étape précédente, dégel sur glace les sérum et le liquide surnageant des échantillons de tissus conservés à-80 ° c, protégeant de la lumière avec la feuille.
- Pipetter 50 µL de sérum dilué (30 µL 1 x PBS + 20 µL de sérum) ou les surnageants de tissu (tel quel) dans une plaque 384 puits noire. Inclure au moins un échantillon d’animal de simulacre de surnageants de sérum et de tissus pour soustraction de fond appropriée, comme cette toile de fond l’homogénat tissulaire est normalement plus élevé que celui de PBS utilisé comme diluant.
Remarque : Une moyenne de 3 animaux factice peut être utilisée pour l’autofluorescence bien qu’on observe une variabilité très peu dans les valeurs d’autofluorescence sham (données non présentées). La quantité de sérum utilisé peut être réduite en diluant il par PBS, qui peut également augmenter le rapport signal sur bruit pour les échantillons avec faible fluorescence tels que des échantillons de cerveau. Jusqu'à 10 µL de sérum a été testé avec 40 µL PBS dilution d’elle. Veillez à ce qu’aucune bulle n’est présents dans les puits. - Insérer la plaque 384 puits noire dans le lecteur et ouvrez un nouveau script de sélection de mesure de la fluorescence.
- La valeur du gain optimal et utilisez respectivement les valeurs d’excitation/émission (nm) de 550/580 ou 490/520 pour dyee TMR ou FITC et démarrer la mesure afin d’obtenir les unités de fluorescence brut (RFUs).
- Utiliser les unités de fluorescence brut (RFUs) du lecteur de plaque pour calculer l’indice de perméabilité (IP) après avoir soustrait les valeurs correspondantes de la farce.
- * Indice de perméabilité (mL/g) = (Poids de tissu tissu RFUs/g) / (sérum sérum RFUs/mL)
- Exemple de calcul de l’indice de perméabilité cérébrale (IP) de l’animal GOF1 (tableau 1) :
- GOF1 cerveau RFUs - SHAM cerveau RFUs = 154-22,5 = 131,5
- GOF1 sérum RFUs - sérum SHAM RFUs = 38305-27 = 38278
- Poids (g) du cerveau = 0,195
- Volume de sérum (ml) = 0,02
- Cerveau en indice de perméabilité (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0,352
Remarque : Les calculs d’indice de perméabilité donnent des valeurs absolues et comparables entre les expériences et les types de tissus. Ceux-ci peuvent toutefois être présentées sous forme de rapport pour faciliter la comparaison entre les 2 groupes de 12. Ceci peut être réalisé en divisant la PI de chaque animal dans les deux groupes avec la PI moyen du groupe témoin, la moyenne du groupe contrôle par 1 tout en conservant la variation animale inter dans le groupe témoin de conduite. Cette transformation fournit des valeurs pour le groupe expérimental (ou groupes) par rapport au groupe contrôle, la valeur 1.
- Visualisation d’immunofluorescence de traceur
- Couper les blocs de rein/hemi-cerveau intégrés nativement dans le tissu-tek composé (O.C.T) (étape 2.1) dans 10 µm sections sur un cryostat à-20 ° C et les sections à diapositives placées à température ambiante. Une fois que les sections sont séchées (environ 30 min), transfert diapositives au congélateur-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Le jour de la coloration, décongeler les diapositives à 37 ° C pendant 10 min et puis fixer les sections avec 4 % paraformaladehyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante, suivie d’un lavage rapide dans du PBS.
- Incuber les coupes dans le tampon perméabilisation/blocage de PBS stérile contenant 1 % de BSA et de 0,5 % Triton X-100 pH 7,5 pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les lames pendant 1,5 h à température ambiante avec l’anticorps primaire CD31 (0,5 mg/ml, clone MEC 13,3), dilué au 1/100 dans un tampon contenant du PBS stérile, 0,5 % de BSA, 0,25 % Triton X-100 (pH 7,2), suivie de trois lavages 5 min dans du PBS.
- Effectuer d’incubation anticorps secondaire dans le tampon ci-dessus pendant 1 h à température ambiante avec chaque espèce fluorescent étiquetée anticorps dilué 1/500 (2 mg/mL). Pour CD31, anti-rat chèvre Alexa 568 ou Alexa 488 peut être utilisé à une dilution de 1/500. Inclure le DAPI (300 µM) dans l’anticorps secondaire mélanger (1 / 1 000 de dilution de la crosse) pour souiller pour les noyaux.
- Monter les sections colorées avec polymount aqua et laisse la nuit pour la polymérisation dans l’obscurité à température ambiante.
- Acquisition d’images à l’aide d’une spectre d’imagerie confocale à balayage laser système de microscope. Analyser les images par logiciel d’elements NIS (version 4.3). Logiciel tel que Photoshop peut être utilisé pour la génération des figures de montage.
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Representative Results
Nous avons récemment démontré que les souris angiopoietin-2 (Ang-2) gain de fonction (GOF) ont la perméabilité vasculaire cérébrale plus élevée que les souris témoins dans des conditions de salubrité10. Chez les souris induite par l’accident vasculaire cérébral, il était aussi montre que les souris GOF avaient de plus grandes tailles d’infarctus et d’une plus grande perméabilité que la portée du contrôle. Ces résultats montrent un rôle crucial de l’Ang-2 perméabilité à la BHE. Le protocole a donc utilisé les souris GOF et comparés pour contrôler la même portée pour décrire le test de perméabilité en vivo . Toutefois, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel modèle de souris transgénique modèle maladie ou pharmacothérapie qui modifient la perméabilité BBB, comme nous l’avons fait précédemment 10,11,12,13.
Un temps de circulation court (15 min) pour l’analyse de la perméabilité est suggéré, comme plus longs circulation entraînera un plus grand dégagement du compartiment vasculaire, qui a été observée également dans les précédentes études16. La clairance des 3 kD FITC-dextran 2 h ()Figure 2 C, D) est beaucoup plus grande qu’à 15 min ()Figure 2 A, B) dans le rein, ainsi que dans le tissu cérébral. Dans le cerveau, il y a très peu de traceur extravasculaire en raison de la barrière hématoméningée intact chez ces souris adultes de WT (Figure B, D). En appliquant cette méthode, la perméabilité de traceur dans GOF Ang-2 avec la même portée WT a été comparée. Les résultats présentés sous forme de tableau (tableau 1) indiquent plue accumulation de traceur dans le cerveau de souris GOF par rapport aux souris WT. Cependant, la fluorescence de rein n’est pas altérée entre ces groupes. Immunofluorescence images confirment l’augmentation à traceurs extravasculaire chez les souris GOF ()Figure 3 B, D) par rapport aux souris WT ()Figure 3 A, C) où le traceur est limité au compartiment vasculaire.
Figure 1. Schéma du flux de travail pour l’essai in vivo perméabilité avec utilisant des traceurs fluorescents. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Clairance de traceur à court et à long temps de circulation. Afin d’établir le temps de circulation de traceur pour le test de perméabilité, un temps de circulation court de 15 min (A, B) a été comparée à un moment de circulation longue de 2 h (C, D) post injection de traceur. La durée de circulation de 2 h a conduit à de très faibles quantités d’accumulation du traceur dans le rein (C) où la perméabilité basale est élevée par rapport à un temps de circulation court 15 min (A) potentiellement en raison d’un très grand dégagement de FITC dextran-3 kD (vert canal) du compartiment vasculaire. Cet effet est encore plus dramatique dans le cerveau caractérisé par l’étroite barrière hémato - encéphalique (B, D). CD31 coloration (canal rouge) a confirmé la présence de bateaux dans la région d’intérêt. Des images représentatives provenant d’un animal seul hors 2 sauvage adulte CD1 souris injectées avec le traceur pour chaque point dans le temps et les animaux ont été sacrifiés sans perfusion afin de visualiser le traceur intravasculaire. La barre d’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Immunofluorescence souillant pour traceurs pour évaluer les changements de perméabilité de cerveau chez les souris GOF. A augmenté la perméabilité des 3 kD traceur TMR-dextran (en rouge) peut être visualisée dans GOF Ang-2 souris (B, D) par rapport à la même portée WT (A, C) dans la région du cortex. Chez les animaux de WT, le traceur est restreint aux navires (A, C), tandis qu’extravasculaire traceur peut être observée chez les souris GOF (flèches blanches en B, D). Coloration pour CD31 (en bleu) dans les images fusionnées (A-D) confirme la présence de bateaux. Figure montre des images représentatives de 2 WT et 2 souris GOF injecté à traceurs i.p et sacrifié 15 min après injection avec une perfusion. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| ID de l’animal | Poids (g) du cerveau | Poids (g) du rein | Volume de sérum (mL) | Sérum RFU | Rein RFU | Cerveau RFU | Perm. Indice (10 ^-3 ml/g) | |
| Rein | Cerveau | |||||||
| GOF 1 | 0,195 | 0,252 | 0,02 | 38305 | 31051 | 154 | 64,4 | 0,352 |
| GOF 2 | 0,177 | 0,249 | 0,02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0,278 |
| WT 1 | 0,167 | 0,301 | 0,02 | 40904 | 31591 | 64 | 51,2 | 0,122 |
| WT 2 | 0,146 | 0,294 | 0,02 | 39502 | 31768 | 70 | 54,8 | 0,164 |
| SHAM | 0,155 | 0,27 | 0,02 | 27 | 36 | 22,5 | NA | NA |
Tableau 1. Les calculs de la perméabilité des tissus. Indice de perméabilité pour Ang-2 gain de fonction (GOF) et des souris de même portée sauvage (WT), les calculs montrent clairement une plus grande (environ 2 fois) le cerveau perméabilité chez des souris GOF par rapport aux souris WT. La perméabilité rénale est cependant dans le même intervalle entre les 2 groupes. La perméabilité rénale basale est beaucoup plus grande par rapport au cerveau que prévu en raison de l’endothélium fenêtrée dans le rein qui ne constituent pas une barrière étanche.
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Discussion
Dysfonctionnement de la barrière hémato - encéphalique est associé à un certain nombre de troubles neurologiques, y compris les tumeurs cérébrales primaires et secondaires ou accident vasculaire cérébral. Rupture BBB est souvent associé avec oedème de CNS mortelles. L’élucidation des mécanismes moléculaires qui déclenchent l’ouverture ou la fermeture de la BHE est donc d’importance thérapeutique dans les troubles neurologiques et généralement étudié par les chercheurs. Cependant, méthodes pour étudier BBB perméabilité in vivo rapportées dans la littérature, sont souvent associées à des difficultés techniques qui dépendent de la quantification fastidieuse et subjective de fluorescence images17,18 , 19. en outre, certaines des méthodes comprennent l’imagerie de fluorescence de cerveau entier qui est fallacieux car il est plus révélateur de la perméabilité des vaisseaux superficiels de cerveau qui ne constituent pas une barrière étanche. Même quand quantification a été effectuée issu de l’absorbance de tissu de cerveau objective (p. ex. évaluation de perméabilité de bleu evans) les animaux ne sont souvent pas perfusés conduisant à une interprétation erronée en raison de la fraction sanguine importante. Poids du cerveau est une autre variable qui n’est souvent pas incluse dans les calculs de perméabilité, mais doit être comme le œdème résultant de la perméabilité vasculaire peut augmenter le poids et altérer la perméabilité nette. En outre, le sexe et les variations de poids de cerveau de l’animal à l’autre peuvent nuage des différences de perméabilité. Les traceurs radioactifs tels que le saccharose 14C et de la [3 H] inuline ont été appliqués avec succès pour l’indice de perméabilité cérébrale mais ne pas offre le large éventail de dimensions et charge la base enquête perméabilité comme à traceurs fluorescent étiquetés20.
Pour ces raisons, nous avons adopté une méthode simple, objective et quantitative dans l’estimation de la barrière hémato - encéphalique perméabilité in vivo chez la souris à l’aide de traceurs fluorescent étiquetés. Dextranes sont des polysaccharides hydrophiles caractérisés par leur poids moléculaire de modéré à élevé (3-200 kD) et peuvent être obtenus comme molécules chargées ou non chargées, basés sur le fluorophore conjugué. Jonctions serrées endothéliales forment par principalement les claudines (1, 3, 5 et 12) et occludin, ensemble, déterminer la taille paracellulaire et sélectivité de charge par la charge pore résidus présents sur leur première boucle extracellulaire (évaluée à21). Perméabilité à travers la barrière hémato - encéphalique en vivo est également tributaire de glycocalyx et la lame basale, deux structures qui se trouvent de chaque côté de la BBB22,23. Glycocalyx invertis présent est un gel comme structure formée par oligosaccharides chargés négativement (héparine sulfates) qui agit également comme une barrière aux macromolécules véhiculés par le sang comme l’albumine. Changements dans l’épaisseur de glycocalyx ou la composition sont également associés à des variations de perméabilité vasculaire que nous avons observé angiopoietin-2 gain de souris de fonction par rapport au type sauvage souris10. La membrane basale est par ailleurs présente sur le côté abluminal des cellules endothéliales comprenant les deux vasculaire la membrane basale faite par les cellules endothéliales et péricytes, tandis que le parenchyme membrane basale ou astrocytaires membrane basale faite par les astrocytes. Ces membranes basales sont aussi négativement chargés et ont donc aussi capacité de servir les barrières de l’accusation. À cet égard, dextrans conjugués offrent enquête de taille et de perméabilité axée sur l’accusation. Par exemple, TMR-dextran 3 kD est anionique tandis que TXR-dextran 3 kD est neutre, un de ces traceurs alliant une haute conjuguée dextran de poids moléculaire comme le dextran FITC 70 kD dans le même mélange injecté aux souris, on pourrait évaluer la perméabilité basée sur la taille. Nous profitons encore de la lysine-fixable nature des dextrans fluorescent-étiquetées pour explorer les différences régionales de perméabilité en standard par immunofluorescence souillant. Dextranes présentent également généralement faible immunogénicité et ainsi servent à traceurs bons. Lucifer jaune, cadavérine, fluorescéine-5-thiosemicarbazide (FTSC), figurent parmi les autres traceurs qui se trouvent dans la gamme de faible poids moléculaire (0,4 à 0,8 kD) et sont corrigeables.
Dans notre méthode, les traceurs ont été injectés par voie i.p suivie en perfusant les souris et obtenir la fluorescence des homogénats de cerveau normalisée selon le poids et la fluorescence de sérum. Il s’agit d’une méthode simple et pourtant très quantitative et objective car il n’y a pas de sélection des sections/images comme la quantification de la méthode immunofluorecence qui est classiquement utilisée. Nous utiliser qu’un seul hémi-cerveau pour l’essai de perméabilité et d’utiliser l’autre hemibrain pour l’immunofluorescence souillant en analysant les coupes sagittales fournissant des différences régionales chez le même animal. L’utilisation de chaque hémi-cerveau pour des mesures simultanées distinctes est l’un des principaux avantages dans notre protocole. Perméabilité d’autres organes comme les reins, foie, etc. sert aussi, un bon contrôle interne car la perméabilité basale est élevée dans ces organes. Pour comparer 2 groupes, il faudrait soustraire tout d’abord l’animal factice (qui n’a pas reçu l’injection du traceur) autofluorescence par tous les animaux dans les groupes et tous les tissus types (rein, cerveau et sérum) pour chaque traceur et continuez à normalisée calculs en comparant les 2 groupes. L’indice de perméabilité (PI) est présentée qui est obtenue en proportion du tissu à fluorescence de sérum normalisé au volume poids et sérum tissulaire. Nos calculs donnent une valeur absolue de la perméabilité de traceur qui peut être comparée entre les expériences et les types de tissus. Ces valeurs cependant, peuvent être facilement exprimées en ratios ou pour cent entre les 2 groupes comparés comme nous l’avons également fait déjà12. Ceci peut être réalisé en divisant la PI de chaque animal dans les deux groupes avec la PI moyenne de tous les animaux du groupe témoin. Cela conduirait le groupe de contrôle PI 1 pourtant garder l’erreur entre les animaux et pour le groupe expérimental de donner des valeurs par rapport à la moyenne de groupe de contrôle de 1.
L’injection de traceurs par i.p est plus facile, mais plus intensifs de coût par rapport à injection i.v., comme la quantité de traceur doit être augmentée. Nos données (non illustrées) à cet égard indiquent ce montant presque 2 fois plus élevé dans le traceur est tenu par injection i.p comparée à i.v. d’obtenir sérum similaire valeurs de fluorescence. Aussi, le temps de circulation est plus élevé sur itinéraire i.p comparée à i.v. en raison du temps pris pour l’absorption de traceur dans la circulation sanguine. À cet égard, sérique de fluorescence à 15 min après injection de i.p était comparables aux 5 min poste i.v. injection de traceurs dans la fourchette de poids moléculaire faible ou moyenne entre 0,4-4 kD (données non présentées). Nous suggérons un temps de circulation court car la perméabilité paracellulaire est linéaire et si considérable tissu fluorescence est détecté après perfusion après un temps de circulation court (15 min), il indique déjà un phénotype de perméabilité comme nous l’avons signalé dans notre précédentes publications10,12,13,14. Mais dans le même temps, on pourrait obtenir la fluorescence de sérum pour la normalisation. Au temps de circulation plus longs, dégagement de tissu est considérable, qui réduit considérablement la fluorescence de sérum et peut donc influer sur les valeurs de perméabilité normalisés au sérum. Alors que le temps de circulation en ce qui concerne la taille/charge du traceur doit être optimisé pour chaque scénario, nous suggérons un temps de circulation court comme point de départ. Ceci s’applique également aux solutés de poids moléculaire plus élevées tels que plasma fibrinogène (150-400 kD) et IgG dont caractéristiques de perméabilité sont contrairement à traceurs de dextran inerte en raison de leur très grande taille et une interaction spécifique avec les récepteurs cellulaires tels que Fc récepteurs qui changent leur demi-vie24. Dextranes en revanche n’ont pas n’importe quel système de transport spécifique à l’endothélium de niveau25 et comme les cellules endothéliales du cerveau ne subissent pas de pinocytose concentration significative due à très faibles niveaux de vésicule plasmalemme associé la protéine (PLVAP)26 , la principale voie de transport des dextrans est paracellulaire. Nous avons appliqué la méthode ci-dessus avec succès dans plusieurs scénarios, tels que la perméabilité chez des souris transgéniques par rapport au type sauvage et aussi évalué les variations de perméabilité chez les souris de type sauvage après intervention thérapeutique10, 12 , 13 , 14. en résumé, combiné avec la coloration à l’immunofluorescence, l’essai de perméabilité décrite ici est une simple et une méthode robuste pour évaluer la perméabilité des souris in vivo qui peuvent s’appliquer également à d’autres petits animaux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait remercier Sphingonet consortium financé par la Fondation Leduq pour soutenir ce travail. Ce travail a été également soutenu par le centre de recherche « différenciation vasculaire et remodelage » (CRC / Transregio23, projet C1) et par le 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc Programme GO-IN, n° 291776 financement. Nous reconnaissons encore Kathleen Sommer pour son aide technique sur des souris manutention et génotypage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
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