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Immunology and Infection

Bimolecular पूरित अपनत्व शुद्धि (BiCAP) द्वारा विदारक मल्टी प्रोटीन सिगनल कॉम्प्लेक्स

Published: June 15, 2018 doi: 10.3791/57109
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1,4, 5, 1,6,7
1The Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, 2Ubiquitin Signaling Group, Protein Signaling Program, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3RCSI Molecular Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 4Department of Epigenetics, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 5School of Medical Sciences, University of New South Wales, 6St Vincent's Hospital Clinical School, University of New South Wales, 7School of Medicine and Medical Science, University College Dublin

Summary

यह पांडुलिपि Bimolecular पूरकता संबध शुद्धिकरण (BiCAP) के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है । इस उपंयास विधि विशिष्ट अलगाव और किसी भी दो बातचीत प्रोटीन के बहाव proteomic लक्षण वर्णन की सुविधा है, जबकि संयुक्त राष्ट्र के परिसर में व्यक्तिगत प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी भागीदारों के साथ गठित परिसरों को छोड़कर ।

Abstract

प्रोटीन परिसरों के विधानसभा कई सेल संकेत मार्ग के विनियमन अंतर्निहित एक केंद्रीय तंत्र है । जैव चिकित्सा अनुसंधान का एक प्रमुख ध्यान केंद्रित है कि कैसे इन गतिशील प्रोटीन परिसरों के लिए एक विशिष्ट जैविक प्रतिक्रिया प्रत्यक्ष करने के लिए कई स्रोतों से संकेत एकीकृत अधिनियम, और कैसे यह कई रोग सेटिंग्स में विनियमित हो जाता है । इस प्रमुख जैव रासायनिक तंत्र के महत्व के बावजूद प्रयोगात्मक तकनीकों की कमी है जो इन बहु-आणविक सिगनल कॉम्प्लेक्सों के विशिष्ट और संवेदनशील deconvolution को सुगम कर सकती है ।

यहां इस कमी के माध्यम से एक प्रोटीन पूरक परख के संयोजन के माध्यम से संबोधित किया है एक अनुरूप-विशिष्ट nanobody, जो हम Bimolecular पूरक संबंध शुद्धि (BiCAP) का कार्यकाल है । इस उपंयास तकनीक विशिष्ट अलगाव और बहाव प्रोटीन बातचीत के किसी भी जोड़ी के proteomic लक्षण वर्णन की सुविधा, संयुक्त राष्ट्र के बहिष्कार-परिसर में व्यक्तिगत प्रोटीन और प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी भागीदारों के साथ गठित परिसरों ।

BiCAP तकनीक अनुप्रवाह प्रयोगात्मक परख की एक विस्तृत सरणी के लिए अनुकूल है, और इस तकनीक से afforded विशिष्टता के उच्च डिग्री प्रोटीन जटिल विधानसभा के यांत्रिकी में और अधिक सूक्ष्म जांच की अनुमति देता है से वर्तमान में प्रयोग संभव है मानक संबध शुद्धि तकनीक ।

Introduction

प्रोटीन जटिल विधानसभा कई संकेत मार्ग1,2की spatiotemporal विशिष्टता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है । जबकि इस विनियामक भूमिका की महत्वपूर्ण प्रकृति व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है, इन परिसरों को परिशीलन करने के लिए उपलब्ध प्रायोगिक तकनीकों का अभाव है । अधिकांश interactomics अध्ययन व्यक्तिगत प्रोटीन, या व्यक्तिगत जटिल घटकों के अनुक्रमिक संवर्धन के साथ बातचीत पर ध्यान केंद्रित । यहां हम एक विशिष्ट प्रोटीन डिमर के अलगाव के लिए एक तकनीक पेश करते हुए घटक प्रोटीन के व्यक्तिगत moieties को छोड़कर के रूप में अच्छी तरह से प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी भागीदारों के साथ गठित परिसरों3। हम इस तकनीक Bimolecular पूरक समानता शुद्धि (BiCAP) कहा जाता है, के रूप में यह एक पहले से विद्यमान प्रोटीन टुकड़ा पूरक परख, Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) का एक संयोजन है, एक के उपंयास के प्रयोग के साथ रचना-विशिष्ट रिकॉमबिनेंट nanobody की ओर GFP और उसके डेरिवेटिव ( सामग्री की तालिका देखें).

एक ठेठ प्रोटीन टुकड़ा पूरक परख की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है "चारा" और "शिकार" प्रोटीन ऐसे luciferase4, β-galactosidase5, या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)6 के रूप में रिपोर्टर के टुकड़े विभाजित करने के लिए जुड़े ( चित्र 1a) । चारा और शिकार प्रोटीन की बातचीत के माध्यम से, विभाजित रिपोर्टर डोमेन के लिए एक कार्यात्मक संरचना में गुना प्रोत्साहित किया जाता है, चारा और शिकार प्रोटीन की बातचीत की अनुमति के लिए visualized या quantified । BiCAP इस तकनीक का एक संस्करण है कि GFP संस्करण वीनस के टुकड़ों का उपयोग किया से अनुकूलित किया गया था । फ्लोरोसेंट प्रोटीन पूरक परख एक लाइव सेल में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत visualizing के लिए एक लोकप्रिय तरीका है, लेकिन अब तक इस एक समारोह7तक ही सीमित किया गया है । BiCAP इस संबंध में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है, इस तकनीक के रूप में न केवल दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी अलगाव और परिणामस्वरूप प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के पूछताछ ।

Figure 1
चित्रा 1: BiCAP तकनीक के पीछे संरचनात्मक प्रमुख । (क) एक योजनाबद्ध bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक दिखा ' चारा ' और ' शिकार ' प्रोटीन के साथ टैग की गई मुख्य रूपरेखा के पीछे N-टर्मिनल V1 या C-पूर्ण लंबाई वीनस प्रोटीन के टर्मिनल V2 टुकड़े के साथ चिह्नित । (ख) GFP nanobody (हरा) और संयुक्त वीनस के बीच संपर्क अंतरफलक (सियान) का संरचनात्मक विश्लेषण, V1 (ग्रे) और V2 (नारंगी) टुकड़े की स्थिति (PDB प्रवेश 3OGO) दिखा । यह आंकड़ा republished fromCroucher एट अल.3 आळे से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

BiCAP तकनीक वीनस के दो गैर फ्लोरोसेंट टुकड़े का उपयोग करता है (V1 और V2 नाम) जो अपनत्व का एक कम डिग्री के साथ सहयोगी जब तक एक बातचीत उनके संलयन भागीदारों के बीच होता है । इस उदाहरण में, दो विभाजन डोमेन fluorophore (चित्र 1b)6के कार्यात्मक β-बैरल संरचना में reफ़ोल्ड । BiCAP के प्रमुख नवाचार रिकॉमबिनेंट GFP nanobody की शुरूआत से आता है, जो epitope के β-बैरल पर तीन आयामी GFP (और वीनस जैसे वेरिएंट) जो सही ढंग से संयुक्त और तह fluorophore पर ही मौजूद है पहचानता है ( चित्र 1b)8. महत्वपूर्ण, GFP nanobody व्यक्तिगत वीनस टुकड़ों में से किसी को बांध नहीं है । यह प्रोटीन dimers के अलगाव की सुविधा के बाद ही दो प्रोटीन अपने इच्छा के एक परिसर का गठन किया है, विधियों है कि रासायनिक प्रेरित, मजबूर बातचीत9का उपयोग करने से प्राप्त की तुलना में अधिक प्रतिनिधि परिणाम के लिए अग्रणी ।

BiCAP एक शक्तिशाली तकनीक है कि विशेष रूप से बहु-प्रोटीन परिसरों पर केंद्रित है, जो संभवतः बहाव अनुप्रयोगों के एक नंबर के साथ संयुक्त किया जा सकता है भूमिका की हमारी समझ की दानेदार में सुधार करने के लिए इन परिसरों संकेत में खेलने transduction . यह भी सीटू मेंप्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति देने की महत्वपूर्ण विशेषता शामिल है । तिथि करने के लिए, BiCAP रिसेप्टर tyrosine कळेनासे (RTK) dimers3के interactome का विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका के रूप में प्रदर्शित किया गया है, लेकिन इस विधि के अनुकूलन क्षमता का मतलब है कि यह लगभग किसी भी प्रोटीन संपर्क संदर्भ में अपनाया जा सकता है ।

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Protocol

1. प्लाज्मिड क्लोनिंग

नोट: V1 या V2 टैग के साथ प्लाज्मिड वैक्टर उत्पंन करने के लिए या तो N-टर्मिनस या सी-ब्याज की जीन के-टर्मिनस से जुड़े हुए, BiFC गंतव्य वैक्टर Addgene के साथ जमा किया गया है [N-टर्मिनल टैग: pDEST-V1-ओआरएफ (#73635), pDEST-V2-ओआरएफ (#73636) । C-टर्मिनल टैग: pDEST-ओआरएफ-V1 (#73637), pDEST-ओआरएफ-V2 (#73638)] । ब्याज की जीन/विशिष्ट पुनर्संयोजन में संगत प्रवेश वैक्टर क्लोनिंग (यानी, pDONR223 या pENTR221), बिना रुके codons, क्लोनिंग के साथ आगे बढ़ने के लिए की आवश्यकता होगी । कई संगत क्लोनों स्तनधारी जीनोम संग्रह (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) सहित विभिंन प्लाज्मिड संग्रह, के भीतर पहले से ही उपलब्ध हैं ।

  1. उपयुक्त BiFC गंतव्य वेक्टर की attR साइट्स के बीच रुचि के जीन सम्मिलित करने के लिए एक पुनर्संयोजनात्मक प्रतिक्रिया निष्पादित करें:
    1. एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में, जोड़ें १५० एनजी प्रविष्टि वेक्टर, १५० एनजी BiFC गंतव्य वेक्टर, और 8 µ एल ते बफर (पीएच ८.०) ।
    2. 2 µ एल recombinase एंजाइम मिश्रण जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । अच्छी तरह से मिश्रण और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
    3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे या 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए प्रतिक्रिया की मशीन ।
    4. 1 µ l Proteinase-K समाधान जोड़ने और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीनिंग द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो ।
  2. गर्मी शॉक सक्षम कोशिकाओं को बदलने ( सामग्री की तालिकादेखें) LR प्रतिक्रिया उत्पाद के साथ:
    नोट: किसी भी मूल तनाव इस बिंदु पर इस्तेमाल किया जा सकता है, जब तक यह Ccdb आंतीटोक्षिण है, जो डालने से युक्त plasmids के विशिष्ट चयन को रोकने के शामिल नहीं है ।
    1. बर्फ पर गल सक्षम कोशिकाओं और स्थानांतरण ५० कोशिकाओं के एक 14 मिलीलीटर में µ एल गोल तली हुई
    2. कोशिकाओं को प्रतिक्रिया उत्पाद के 1 µ एल जोड़ें और धीरे मिश्रण । बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    3. ४२ ° c पानी स्नान में हीट शॉक ४५ एस के लिए तुरंत बर्फ पर वापस 2 मिनट के लिए ।
    4. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ पौंड मीडिया और मशीन के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. प्लेट एम्पीसिलीन (१०० µ जी/एमएल) युक्त एक 10 सेमी आगर प्लेट पर परिवर्तन और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  3. BiFC प्लाज्मिड का शुद्धिकरण ।
    1. एक अलग कॉलोनी से प्लाज्मिड शुद्ध करने के लिए, पौंड मीडिया की एक बड़ी शंकु कुप्पी करने के लिए १०० मिलीलीटर जोड़ें और एम्पीसिलीन (१०० µ g/एमएल) जोड़ें । कई कॉलोनियों स्क्रीन करने के लिए, 14 मिलीलीटर गोल-तली हुई के लिए पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें ट्यूबों और एम्पीसिलीन (१०० µ g/एमएल) जोड़ें ।
    2. एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कर, आगर प्लेट से एक एकल कॉलोनी उठाओ. पौंड मीडिया में टीका लूप प्लेस और संक्षेप में मिश्रण ।
    3. एल्यूमीनियम पंनी के साथ शंकु कुप्पी के शीर्ष कवर और झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    4. एक मानक maxiprep या midiprep प्लाज्मिड डीएनए शोधन किट का उपयोग कर अभिकर्मक ग्रेड प्लाज्मिड डीएनए का उत्पादन ( सामग्री की तालिकादेखें)10. अवशोषण स्पेक्ट्रा द्वारा डीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें ।
      नोट: डीएनए एक A260/A280 अनुपात > 1.8 और एक A260/A230 अनुपात > 2.0 होना चाहिए । इस बिंदु पर, सम्मिलित करें और टैग की कुशल अभिव्यक्ति के लिए जाँच करने के लिए एकाधिक व्यक्तिगत कॉलोनियों स्क्रीन करने के लिए अनुशंसित है ।

2. सेल कल्चर और अभिकर्मक

नोट: BiFC वैक्टर के अभिकर्मक के लिए यह एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और अपेक्षाकृत समरूप अभिकर्मक । वैक्टर संभावना किसी भी मानक अभिकर्मक एजेंट के साथ संगत हो जाएगा, और अभिकर्मक शर्तों तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए । मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन करने के लिए, हम आमतौर पर 10 मुख्यमंत्री व्यंजन के भीतर संस्कृति कोशिकाओं, हालांकि यह भी आनुपातिक छोटे व्यंजन या कम सामग्री की आवश्यकता होती है कि प्रयोग के लिए प्लेटों के लिए नीचे बढ़ाया जा सकता है ।

  1. बीज १.० × 10 DMEM मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी डिश में6 HEK293T कोशिकाओं, 10% FBS और पेनिसिलिन/Streptomycin (1:100) के साथ पूरक ।
  2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ५०० µ एल अभिकर्मक बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) में प्रत्येक BiFC वेक्टर के २.५ µ जी पतला ।
  3. अभिकर्मक रिएजेंट के 10 µ l जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  4. 10 एस के लिए भंवर मिश्रण है, तो संक्षेप में केंद्रापसारक । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
  5. डीएनए अभिकर्मक मिश्रण को प्लेट में डालें, dropwise । BiFC फ्यूजन प्रोटीन के लिए समय की एक पर्याप्त लंबाई के लिए बातचीत करने के लिए और वीनस तह और fluorophore परिपक्वता के लिए, आम तौर पर ~ 8-24 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: वीनस के लिए चोटी उत्तेजना ५१५ एनएम है, और अपने चरम उत्सर्जन ५२८ एनएम है, हालांकि यह आसानी से एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की स्थापना का उपयोग कर GFP प्रतिदीप्ति कल्पना को देखा है ।

3. नमूना तैयारी

  1. कटाई lysates
    1. lysate संग्रह करने से पहले, सेल Lysis बफर तैयार [५० mm Tris-HCl (pH ७.४), १५० mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% (v/v) गैर ईओण डिटर्जेंट ( सामग्री की तालिकादेखें)] । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. तुरंत कटाई से पहले, को छेड़ो अवरोधक और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला के साथ सेल Lysis बफर के 10 मिलीलीटर पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें) । पूरक सेल Lysis बफर बर्फ पर रखें ।
    3. आइस-कोल्ड पंजाब में दो बार कोशिकाओं को धोएं । पंजाबियों को महाप्राण और 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पूरक सेल Lysis बफर जोड़ें । बर्फ पर पकवान प्लेस, यह सुनिश्चित करने बफर पूरी सतह क्षेत्र में फैला हुआ है ।
    4. लगभग 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन, तो एक सेल खुरचनी का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कोशिकाओं को परिमार्जन और एक पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १८,००० × जी में एकत्र lysate केंद्रापसारक और स्थानांतरण साफ ताजा microcentrifuge ट्यूबों में supernatant द्वारा सेलुलर मलबे निकालें ।
      नोट: इस बिंदु पर lysate तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, या पर संग्रहित-८० ° c । इसके साथ ही क्रूड lysate का aliquot रखने की भी सिफारिश की गई है ताकि अभिकर्मक की कार्यकुशलता और अपनत्व शुद्धि को मान्य किया जा सके.
  2. अपनत्व शुद्धि
    नोट: BiCAP आइसोलेशन चरण agarose मोतियों को संयुग्मित nanobody GFP का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें).
    1. 1 मिलीलीटर पंजाबियों में एक उपयुक्त मात्रा (20 µ एल प्रति नमूना + 10 µ l अतिरिक्त) धोने से agarose मोती तैयार करें । ३०० x जी पर मोती के केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
    2. प्रत्येक lysate नमूने के लिए 20 µ l जोड़ें ।
    3. अंत करने के लिए अंत रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूनों की मशीन ।
      नोट: इस बिंदु पर नमूने या तो एसडीएस-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता, या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है ।
  3. वेस्टर्न सोख्ता के लिए BiCAP eluant की तैयारी ।
    1. ३०० x जी पर मोती के केंद्रापसारक और धोने सेल Lysis बफर में तीन बार ।
    2. उचित पतला नमूना बफर के ५० µ एल में धोया मोती reसस्पेंड ( सामग्री की तालिकादेखें) और 2-3 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी ।
      नोट: इस तरीके से तैयार नमूनों में कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. प्रदर्शन एसडीएस-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता11 दोनों V1 टैग और V2 टैग के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें), साथ ही ब्याज की किसी भी अंय प्रोटीन ।
  4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए BiCAP eluant की तैयारी ।
    नोट: विश्लेषण के लिए लेबल से मुक्त मात्रात्मक (LFQ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री यह नमूनों में कम से quadruplicate तैयार करने के लिए सिफारिश की है मजबूत सांख्यिकीय शक्ति सुनिश्चित करने के लिए.
    1. ३०० x जी पर मोती केंद्रापसारक और धोने सेल Lysis बफर में छह बार डिटर्जेंट के बिना । यह दोनों अतिरिक्त प्रोटीन और भी डिटर्जेंट कि जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेंगे दूर करने के लिए आवश्यक है । अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें, या मोतियों की दुकान पर-८० ° c।
    2. Trypsinize मोतियों में ६० µ एल बफर 1 [2 एम यूरिया, ५० एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ७.५), 5 µ जी/एमएल trypsin] । मोती 27 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ८०० RPM में एक thermomixer मिलाते में पचाने के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. संक्षेप में मोती, तो इकट्ठा supernatant और microcentrifuge ट्यूबों को हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    4. 25 µ l बफर 2 [2 एम यूरिया, ५० mm Tris-एचसीएल (pH ७.५), 1 mm dithiothreitol] में मोतियों को धोएं, ताकि बाउंड प्रोटीन को कम कर सकें ।
    5. एक microcentrifuge ट्यूब में मोती और supernatant पूल । पाचन कमरे के तापमान पर रातोंरात होने की अनुमति दें ।
    6. Alkylate के 20 µ एल जोड़कर नमूनों को iodoacetamide (5 मिलीग्राम/एमएल ultrapure पानी में) प्रत्येक नमूने के लिए और 30 मिनट के लिए अंधेरे में गर्मी ।
    7. 1 µ एल trifluoroacetic एसिड (TFA) के साथ प्रत्येक नमूने के इलाज के द्वारा पाचन को बाधित । इस चरण में स्टेज ढोने के लिए तैयार होने वाले नमूनों को भी acidify जाएगा ।
    8. एक २०० µ एल micropipette टिप में 1 मिमी ठोस चरण निष्कर्षण C18 (Octadecyl) झिल्ली डिस्क ( सामग्री की तालिकादेखें) के 6 परतों स्टैकिंग द्वारा C18 चरण सुझावों का निर्माण । प्रत्येक नमूने के लिए एक टिप तैयार करें ।
    9. गीले चरण युक्तियां मेथनॉल के साथ, और equilibrate के साथ ५० µ l ०.१% (v/v) trifluoroacetic अम्ल (TFA), ८०% (v/v) acetonitrile.
    10. धो युक्तियां के साथ ५० µ l ०.१% (v/v) TFA ।
    11. चरण युक्तियों पर acidified पेप्टाइड्स लोड करें और फिर ०.१% (v/v) TFA, ८०% (v/v) acetonitrile दो चरणों में उपयोग elute ।
    12. एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग कर नमूने लुप्त हो जाना ।
    13. यदि आवश्यक हो, तो-८० ° c से कम पेप्टाइड्स की दुकान ।

४. मास स्पेक्ट्रोमेट्री.

  1. 5% फार्मिक एसिड, 2% acetonitrile (ultrapure पानी में) के 15 µ एल में नमूने reसस्पेंड ।
  2. ध्यान से एक nanoLC HPLC प्रणाली में एक नियंत्रण रेखा प्लेट और जगह पर 6 µ एल लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. १.९ µM C18 स्थिर चरण कणों के साथ एक 20 सेमी, ७५ µ एम इनर व्यास कॉलम पैक ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रत्येक कॉलम पर 5 µ एल पेप्टाइड लोड ।
  4. Elute २५० nL पर acetonitrile के रैखिक ढाल का उपयोग कर पेप्टाइड्स/मिन से अधिक १४० मिनट और nanoelectrospray द्वारा एक रैखिक जाल Quadropole में परिचय (LTQ) संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर nanoLC प्रणाली के लिए युग्मित.
  5. एक १४० मिनट के समय ढाल पर स्कैन प्रति शीर्ष 10 सबसे प्रचुर मात्रा में आयनों के लिए मिलकर एमएस डेटा इकट्ठा । डेटा संग्रह और BSA के साथ विनिमय के क्रम प्रत्येक नमूना के बीच चलाने के लिए अस्थायी पूर्वाग्रह को कम करने के लिए यादृच्छिक ।

5. विश्लेषण

  1. MaxQuant सॉफ्टवेयर संस्करण 1.2.7.4 भीतर डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग कर कच्चे एमएस डेटा प्रक्रिया और R सॉफ्टवेयर वातावरण3में पर्सेउस सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यप्रवाह के संशोधित संस्करण का उपयोग कर MaxQuant उत्पादन का विश्लेषण ।
    नोट: इस बिंदु से सांख्यिकीय विश्लेषण वर्कफ़्लो चित्रा 2में संक्षेप है । संक्षेप में, MaxQuant का उपयोग कर की पहचान की प्रोटीन की LFQ तीव्रता बदल रहे है और सामांय और imputation के बाद फ़िल्टर । डिमर जोड़े के प्रोटीन बातचीत एक वीनस नियंत्रण के साथ तुलना द्वारा की पहचान कर रहे हैं, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बांधने, छात्र टी परीक्षण और Benjamini-Hochberg सुधार के साथ कई तुलना के लिए बाहर करने के लिए । डेटा की गुणवत्ता व्यक्तिगत हिस्टोग्राम, एकाधिक प्रतीपगमन, और श्रेणीबद्ध clustering की तुलना द्वारा पुष्टि की है ।

Figure 2
चित्र 2: सांख्यिकीय विश्लेषण वर्कफ़्लो की बाह्यरेखा. सांख्यिकीय विश्लेषण पाइपलाइन कच्चे जन स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा MaxQuant का उपयोग संसाधित से पहचान प्रोटीन की LFQ तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया प्रवाह आरेख । हरे बक्से: फ़िल्टरिंग, नीले बक्से: परिवर्तन/normalising/स्केलिंग, भूरे बक्से: डेटा गुणवत्ता नियंत्रण, पीले बक्से: अर्द्ध मात्रात्मक अपवर्जन/तुलनात्मक विश्लेषण, ग्रे बक्से: सांख्यिकीय विश्लेषण । यह आंकड़ा republished fromCroucher एट अल.3 आळे से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

संयोजन क्लोनिंग के उपयोग के बाद V1 और V2 के BiFC pDEST plasmids, सह के साथ ब्याज के जीन टैग की अभिकर्मक दो प्रोटीन के एक बातचीत जोड़ी युक्त plasmids के बाद एक वीनस फ्लोरोसेंट संकेत की पीढ़ी में परिणाम होगा लगभग 8-24 घंटे । एक सकारात्मक संकेत के अभाव में यह संभव है कि प्रोटीन संपर्क सेल लाइन, एक कम अभिकर्मक दक्षता या कि BiFC टैग के उंमुखीकरण इष्टतम नहीं है के चुनाव के कारण होने वाली नहीं हो सकता है । इन परिदृश्यों में से प्रत्येक के लिए समस्या निवारण नीचे discussed है ।

हम पहले विभिंन प्रकार के प्रोटीन की एक संख्या के लिए एक सकारात्मक संपर्क मनाया ~ 16 घंटे के बाद सह HEK-293T कोशिकाओं के अभिकर्मक । इस प्लाज्मा झिल्ली में RTK ERBB2 के dimerisation शामिल है (3 एआंकड़ा) और Ubiquitin के E3 ligase UBR5 को बाध्यकारी, नाभिक के भीतर मुख्य रूप से होने वाली (3 ए आंकड़ा)12। इन प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के विशिष्ट उप सेलुलर स्थानीयकरण कल्पना करने की क्षमता, के रूप में पूरी लंबाई वीनस प्रोटीन (चित्रा 3ए) के पूरे सेल प्रतिदीप्ति के विरोध में, मौजूदा BiFC तकनीक का प्राथमिक कार्य है । हालांकि BiCAP तकनीक के प्रमुख नवाचार के लिए विशेष रूप से शुद्ध और इन बातचीत प्रोटीन की विशेषता है ।

Figure 3
चित्रा 3: BiCAP दृश्य और अलगाव का आदान प्रदान प्रोटीन की अनुमति देता है । (ए) फ्लोरोसेंट पूर्ण लंबाई वीनस प्रोटीन द्वारा उत्पादित संकेत के फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण, ERBB2 के बीच संपर्क-v1 और ERBB2-v2 और v1 के बीच बातचीत-UBR5 और v2-Ubiquitin के बाद अभिकर्मक HEK में-293T कक्षों. स्केल बार्स, 10 µm. (ख) HEK-293T कोशिकाओं को एक नियंत्रण पूर्ण लंबाई वीनस, प्लाज्मिड-v1, ERBB2-v2 या दोनों ERBB2-v1 और ERBB2-v2, ERBB2 immunoprecipitation और पश्चिमी GFP के साथ nanobody के बाद से युक्त के साथ transfected के साथ थे संकेत एंटीबॉडी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस विशिष्ट BiCAP प्रोटोकॉल द्वारा afforded शुद्धीकरण आसानी से एक नियंत्रण के अभिकर्मक के बाद मनाया जा सकता है पूर्ण लंबाई वीनस प्रोटीन युक्त प्लाज्मिड, व्यक्तिगत प्रतिनिधि V1 या V2 टैग प्रोटीन युक्त plasmids या इन दोनों plasmids के सह-अभिकर्मक (चित्र बी) । HEK-293T कोशिकाओं में इन plasmids के अभिकर्मक के बाद, और एक 16 एच की मशीन, V1 और V2 टैग एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी lysates के लिए कच्चे तेल की सोख्ता की तैयारी से पता चलता है कि प्रत्येक टैग प्रोटीन उपयुक्त नमूना के भीतर मौजूद है । हालांकि, GFP nanobody के साथ संबंध शुद्धि के बाद, केवल पूर्ण लंबाई वीनस नियंत्रण प्रोटीन और बातचीत V1 और V2 सह के भीतर प्रोटीन टैग अभिकर्मक नमूना (चित्र बी) का पता लगाया जा सकता है ।

प्रोटीन बातचीत के इस चयनात्मक शोधन बहाव तकनीक की एक संख्या के बाद किया जा सकता है । हमारे हाल के3 प्रकाशन में हम BiCAP कार्यप्रवाह का उपयोग करने के लिए जन-RTK ERBB2 के स्पेक्ट्रोमेट्री interactome विश्लेषण के रूप में या तो एक homodimer या heterodimer और EGFR के साथ एक ERBB3 (चित्रा 4) । हमारे डेटा विश्लेषण पाइपलाइन (चित्रा 2) का पालन करके और Cytoscape13 का उपयोग कर डेटा visualizing हम या तो सभी तीन ERBB2 dimers के साथ बातचीत की है कि प्रोटीन के विशिष्ट सबसेट की पहचान की है, या dimers, या एक व्यक्ति की एक जोड़ी के लिए विशिष्ट थे डिमर. इन बातचीत प्रोफाइल के करीब विश्लेषण हमें अनुकूलक प्रोटीन डिमर-विशिष्ट संकेत transduction घटनाओं, जो मानक सह immunoprecipitation दृष्टिकोण का उपयोग नहीं किया जाएगा विनियमन बाध्यकारी के उपंयास पैटर्न की पहचान करने की अनुमति दी ।

Figure 4
चित्रा 4: ERBB2-युक्त dimers की interactome विविधता का विश्लेषण । BiCAP के लिए इस्तेमाल किया रिसेप्टर प्रलोभन नारंगी में दिखाए जाते हैं, 10 सभी तीन रिसेप्टर dimers के interactome के लिए आम प्रोटीन के कोर समूह नीले रंग में दिखाया गया है. बातचीत प्रोटीन दो रिसेप्टर dimers करने के लिए आम हरे रंग में दिखाया गया है, और ग्रे में एक रिसेप्टर के लिए. यह आंकड़ा republished fromCroucher एट अल.3 आळे से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

BiCAP विशिष्ट प्रोटीन dimers अलग करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, जबकि व्यक्तिगत घटकों को छोड़कर और उनके प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी भागीदारों3। BiCAP एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन पूरक परख के अनुकूलन पर आधारित है BiFC6बुलाया । BiFC और निकटता बंधाव परख सहित मौजूदा तरीके, बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है कल्पना और जीवित कोशिकाओं7में प्रोटीन बातचीत यों तो, लेकिन अलग और निस्र्पक से गठित dimers का एक प्रभावी साधन प्रदान नहीं किया इन बातचीत ।

प्रोटीन पूरकता आधारित समानता शोधन तकनीक भी विकसित करने के लिए जारी रखा है । Schopp एट अल. हाल ही में प्रोटीन डिमर निकटता BioID14का उपयोग लेबलिंग के लिए एक प्रणाली का वर्णन किया । बायोटिन ligase बिरा के विभाजित टुकड़े दो बातचीत प्रोटीन से इनकार करते हुए, वे प्रोटीन miRNA मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने में शामिल परिसरों युक्त Ago2 के संवर्धन का निर्देश दिया । भाजित-BioID BioID की निकटता रेंज के भीतर प्रोटीन के चयनात्मक संवर्धन के लिए अनुमति देने में BiCAP पूरक, जहां BiCAP सीधे जटिल इंटरैक्टर्स समृद्ध करता है ।

BiCAP तकनीक की सफलता BiFC वैक्टर के कुशल अभिकर्मक पर निर्भर करती है । जब हम नियमित रूप से HEK293T कक्षों को एक मज़बूत और आसान-से-transfect सेल लाइन के रूप में उपयोग करते हैं, तो इस सेल लाइन का उपयोग संभावित सेल-विशिष्ट इंटरैक्शन भागीदारों की पहचान को बाधा कर सकता है । इसलिए हम अनुशंसा करते है कि सेल लाइन के चुनाव सावधानी से प्रत्येक प्रयोग के लिए, विशेष रूप से एक विशिष्ट रोग ध्यान के साथ अध्ययन के लिए विचार किया जाएगा । इस के अलावा, अभिकर्मक स्थितियों का अनुकूलन भी प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटअप के लिए किया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल में उल्लिखित मूल्यों ERBB2 पर हमारे काम के साथ गठबंधन कर रहे है और स्तन कैंसर सेल लाइनों के भीतर अंतर्जात ERBB2 के स्तर अनुमानित करने पर तुले थे । यह समझदारी है, जब एक विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की जांच की शुरुआत है, कई दोनों के निर्माण के क्रम में अभिव्यक्ति का स्तर है कि एक शारीरिक या में मौजूद लोगों के साथ संगत को प्राप्त करने के लिए विभिंन परीक्षणों का उपयोग करने पैथो-शारीरिक सेटिंग ।

इस प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण तत्व नमूनों के लिए सही समय का निर्धारण है अभिकर्मक निंनलिखित काटा जा सकता है । जबकि प्रोटीन परिसरों के गठन आम तौर पर एक क्षणिक प्रक्रिया है, व्यक्तिगत घटकों के संयोजन और समय के साथ इकट्ठा करने के साथ, एक बहुत ही धीमी गति से पृथक्करण दर है जो प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है कि उनके फ्यूजन भागीदारों की है । व्यावहारिक संदर्भ में, इसका मतलब है कि एक यथोचित सख्त समय सीमा के बाद अभिकर्मक एक यथार्थवादी परिणाम उपज और अत्यधिक अधिक व्यक्त प्रोटीन समुच्चय के संचय को रोकने के लिए आवश्यक है । आम तौर पर, एक बार BiFC प्रतिदीप्ति एक मानक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देख रहा है (जैसे ~ 16 ErbB2 dimers के लिए घंटे), कोशिकाओं संचयन lysates या इमेजिंग के लिए तैयार किया जा सकता है, हालांकि यह एक विशिष्ट चारा के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है और शिकार प्रोटीन ।

हमारे हाल के प्रकाशन RTK dimers3अलग करने के लिए BiCAP की उपयोगिता का प्रदर्शन किया । इस प्रायोगिक सेटअप प्रोटीन बातचीत के लिए एक ज्ञात अभिविंयास का लाभ था, intracellular, सी में V1 और V2 टैग के प्रत्यक्ष संरेखण की अनुमति-प्रत्येक रिसेप्टर के टर्मिनल अंत । इन टैग के निकट संरेखण उनके फिर से तह के लिए आवश्यक है, और जब एक ज्ञात अभिविंयास यह एन के सभी वेरिएंट टर्मिनल और सी-टर्मिनल टैग फ्यूजन के लिए एक संयोजन है कि पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है बिना प्रोटीन बातचीत की जांच एक सकारात्मक BiFC संकेत में परिणाम होगा । यहां तक कि इस अनुकूलन कदम के शामिल किए जाने के साथ वहां अभी भी एक झूठी नकारात्मक की संभावना है अगर एक विशिष्ट प्रोटीन बातचीत के संरेखण पूरी तरह से टैग के बीच किसी भी बातचीत precludes ।

इसके विपरीत, देखभाल भी एक झूठी सकारात्मक बातचीत की घटना को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए । अब समय पर अंक (> 36 एच), हम पहले गैर के उद्भव कुछ प्रोटीन संपर्क जोड़े के साथ विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मनाया है । जहां संभव हो, गैर बातचीत नियंत्रण भी मनाया प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता को सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए और अभिकर्मक निंनलिखित विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त समय सीमा को सूचित करें ।

BiCAP एक उच्च अनुकूलनीय तकनीक है कि बातचीत प्रोटीन के लगभग किसी भी जोड़ी के लिए लागू है । इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए हमने जन स्पेक्ट्रोमेट्री के उपयोग के माध्यम से उत्पन्न interactome डाटा प्रस्तुत किया है. हालांकि, शुद्ध परिसरों किसी भी वांछित बहाव परख के साथ संगत होना चाहिए । उदाहरण के लिए, जबकि BiCAP प्रोटोकॉल में बातचीत प्रोटीन की शुद्धि की अनुमति देता है, यह भी प्रोटियोमिक् के साथ चिप-seq के बहाव के उपयोग के माध्यम से जीनोमिक आवेदन हो सकता है । इस सेटिंग में BiCAP के आवेदन विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों, जो भी भारी जटिल dimerisation पैटर्न के माध्यम से विनियमित है के लिए विस्तार के स्तर में वृद्धि प्रदान करेगा ।

BiCAP इसलिए प्रोटीन टुकड़ा पूरक परख, जो जैव रासायनिक और बहुत बढ़ा संकल्प के साथ जीनोमिक नेटवर्क के पूछताछ में सक्षम बनाता है की एक मजबूत अनुकूलन का प्रतिनिधित्व करता है । भविष्य में, अनुकूलन और BiCAP तकनीक के विस्तार जटिलता और प्रोटीन संकेतन नेटवर्क की प्लास्टिक की हमारी समझ में वृद्धि होगी, और उनके विकास, शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के विनियमन में पतले देखते भूमिका ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

डी. आर. सी. कैंसर संस्थान एनएसडब्ल्यू फेलो और डी. एन. एस पहले कैंसर संस्थान एनएसडब्ल्यू फेलो थे । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अनुसंधान निष्कर्षों कैंसर संस्थान एनएसडब्ल्यू द्वारा वित्त पोषित किया गया (13/FRL/1-02 और 09/CDF/2-39), NHMRC (परियोजना अनुदान GNT1052963), विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड (11/SIRG/B2157), एनएसडब्ल्यू कार्यालय विज्ञान और चिकित्सा अनुसंधान, अतिथि परिवार फेलोशिप आणि Mostyn कुटुंब फाउंडेशन. J.F.H. और R.S. एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार के प्राप्तकर्ता थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LR Clonase II Plus enzyme Thermo Fisher Scientific 12538120 Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors
Proteinase K, recombinant, PCR grade Thermo Fisher Scientific EO0491
14 mL round-bottomed polypropylene tube Corning 352059
Ampicillin Roche Diagnostics Australia 10835242001 Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water.
Miniprep kit Promega Corporation A1330
Maxiprep kit Life Technologies Australia K2100-07
DMEM Gibco 11995-073
FBS Life Technologies Australia 10099-141
Penicillin/Streptomycin Life Technologies Australia 15070-063
jetPRIME transfection buffer Polyplus 114-15
jetPRIME transfection reagent Polyplus 114-15
PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) Sigma-Aldrich 4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cell Scraper Sarstedt 83.1832
GFP-Trap_A Chromotek Gmbh gta-100 GFP nanobody coupled to agarose beads
N-terminal GFP monoclonal antibody  Covance MMS-118P Will detect the V1 tag within the BiFC vectors
C-terminal GFP monoclonal antibody Roche 11814460001 Will detect the V2 tag within the BiFC vectors
Sample buffer Invitrogen NP0008 Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol.
Sequencing grade modified trypsin Promega Corporation V5117h
LoBind microcentrifuge tubes Point of Care Diagnostics 0030 108 116
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149-5G Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water
Trifluoroacetic Acid - Sequanal Grade Thermo Fisher 10628494
3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) - 4.7 cm Thermo Fisher 14-386-2 To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.
C18 Stage Tips, 10 µL bed Thermo Fisher 87782
Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL Thermo Fisher FSBA117-50
1.9 μm C18 ReproSil particles Dr. Maisch GmbH r119.aq. Stationary phase particles
Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade  Thermo Fisher FSBA955-4
Easy-nLC HPLC  Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro Thermo Fisher
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Non-ionic detergent (100%)
DH5α cells Thermo Fisher Heat-shock-competent cells

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १३६ प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रोटियोमिक् Interactomics BiCAP सिग्नल Transduction Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता Nanobody
Bimolecular पूरित अपनत्व शुद्धि (BiCAP) द्वारा विदारक मल्टी प्रोटीन सिगनल कॉम्प्लेक्स
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