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Biochemistry

फैटी एसिड 13सी Isotopologue profiling Invertebrate उपभोक्ताओं के पौष्टिकता कार्बन हस्तांतरण और लिपिड चयापचय में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है

Published: April 17, 2018 doi: 10.3791/57110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Ecology, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

Summary

फैटी एसिड पौष्टिकता मार्कर दृष्टिकोण, यानी, पूरे अणु के रूप में फैटी एसिड के आत्मसात और कोई या मामूली संशोधन के साथ उपभोक्ता ऊतक में स्थानांतरण, छोटे मिट्टी अकशेरूकीय के फैटी एसिड चयापचय में ज्ञान अंतराल द्वारा बाधा है । Isotopologue profiling पौष्टिकता बातचीत को फंसाए रखने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में प्रदान की जाती है ।

Abstract

फैटी एसिड (फास) खाद्य वेब पारिस्थितिकी में उपयोगी है क्योंकि वे आम तौर पर एक पूर्ण अणु के रूप में आत्मसात कर रहे है और मामूली या कोई संशोधन के साथ उपभोक्ता ऊतक में स्थानांतरित कर रहे हैं, विभिंन पौष्टिकता के स्तर के बीच आहार मार्ग की अनुमति । हालांकि, एफए पौष्टिकता मार्कर दृष्टिकोण अभी भी मिट्टी जीव के लिपिड चयापचय में सीमित ज्ञान के द्वारा बाधा है । इस अध्ययन में पूरी तरह से लेबल palmitic एसिड का इस्तेमाल किया (13C16:0, ९९ एटम%) फैटी एसिड चयापचय रास्ते में एक अनुरेखक के रूप में दो व्यापक मिट्टी Collembola, Protaphorura fimata और Heteromurus nitidus. आदेश में भाग्य और इस अग्रदूत के चयापचय संशोधनों की जांच करने के लिए, isotopologue रूपरेखा की एक विधि प्रस्तुत की है, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया जाता है एकल आयन की निगरानी का उपयोग कर । इसके अलावा, नदी के ऊपर प्रयोगशाला खिला प्रयोग, साथ ही निष्कर्षण और प्रमुख लिपिड भिन्न (तटस्थ लिपिड, फॉस्फोलिपिड) और संबंधित सूत्र और गणना के मिथाइल का वर्णन किया गया है । Isotopologue profiling फैटी एसिड में समग्र 13सी संवर्धन नहीं उपज करता है 13सी से व्युत्पंन के प्रणेता लेबल पर भी जनक आयन (यानी, एफए आणविक आयन के द्रव्यमान से अधिक isotopologues के पैटर्न का उत्पादन एक या एक से अधिक जन इकाइयों (एम+ 1, एम+ 2, एम3, आदि) द्वारा प्रत्येक लेबल एफए के एम+) । यह ज्ञान de नोवो संश्लेषण की तुलना में एक पूरी तरह से भस्म एफए के आहार मार्ग के अनुपात पर निष्कर्ष की अनुमति देता है. isotopologue profiling मिट्टी पशुओं में फैटी एसिड चयापचय के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में पौष्टिकता बातचीत को फंसाए रखने का सुझाव दिया है ।

Introduction

ऐसे मिट्टी के रूप में एक गुप्त निवास स्थान में, पौष्टिकता रिश्तों को पता मुश्किल है और आगे जीव के छोटे आकार द्वारा प्रतिबंधित कर रहे हैं । पिछले दशक जैव रासायनिक पारिस्थितिकी में प्रगति देखा है, विशेष रूप से क्षेत्र की स्थिति के तहत मिट्टी के जीव की खिला रणनीतियों को परिभाषित करने के लिए1,2,3में फैटी एसिड के प्रयोग में । यह तथ्य यह है कि संसाधनों से फैटी एसिड पूरे अणुओं के रूप में उपभोक्ता ऊतक में शामिल किया जा सकता है पर आधारित है, एक प्रक्रिया आहार रूटिंग4शब्द । फैटी एसिड के स्थानांतरण तीन पौष्टिकता स्तर पर सूचित किया गया है, यानी, कवक से सूत्रकृमि करने के लिए5Collembola । हाल ही में, शिकारी जीव6,7 माना जाता था और मिट्टी खाद्य जाले में पौष्टिकता मार्करों के रूप में फैटी एसिड पर पहली समीक्षाएं8,9प्रकाशित किया गया है ।

पौष्टिकता बातचीत पर अधिक विस्तृत जानकारी फैटी एसिड स्थिर आइसोटोप जांच (एफए-घूंट) द्वारा प्राप्त की है । आहार और उपभोक्ताओं में फैटी एसिड में 13सी/12सी अनुपात का निर्धारण द्विआधारी लिंक परमशॆवर और जुड़े कार्बन प्रवाह का अनुमान कर सकते हैं, और स्थलीय, ताजा पानी में कार्यरत है, और समुद्री खाद्य जाले10,11 ,12,13. मूल धारणा यह है कि आहार मार्ग फैटी एसिड एंजाइमी प्रक्रियाओं के अधीन नहीं हैं; इसलिए, उनके 13c संकेत, यानी, फैटी एसिड के 13c/12सी अनुपात, उपभोक्ता में आहार1में उस के समान है । हालांकि, खाद्य श्रृंखला के ऊपर 13सी हस्ताक्षर की एक क्रमिक कमी जलीय प्रणालियों में सूचित किया गया है, जिससे एफए के व्यापक आवेदन में बाधा पौष्टिकता अध्ययन14,15,16। इसके अलावा, स्थलीय खाद्य जाले में सबसे अकशेरूकीय में लिपिड चयापचय में ज्ञान अभी भी सीमित है ।

उपभोक्ताओं में लिपिड चयापचय रास्ते की समझ पौष्टिकता मार्कर फैटी एसिड के उपयोग के लिए भोजन वेब पारिस्थितिकी में मात्रात्मक कार्बन प्रवाह के निर्धारण के लिए साधन के रूप में आवश्यक है । मन में इस के साथ, 13सी-isotopologue रूपरेखा, जो सिद्धांत रूप में किसी भी जैविक प्रणाली17के कार्बन चयापचय की जांच के लिए लागू किया जा सकता है, एक आशाजनक तरीका है । एक 13सी-लेबल कार्बन सब्सट्रेट की शुरूआत के बाद, चयापचय नेटवर्क में 13सी के वितरण का पता लगाने के बाद से उपभोक्ता में उत्पंन चयापचय उत्पादों को एक विशिष्ट isotopologue वितरण दर्शाती है । यह मात्रात्मक नाभिकीय चयापचय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है18,19 या मास स्पेक्ट्रोमेट्री20,21, बाद अपने उच्च के कारण कम बायोमास के साथ जैविक नमूनों में इष्ट के साथ संवेदनशीलता.

हालांकि isotopologue profiling सफलतापूर्वक अमीनो एसिड के लिए लागू किया गया है और बैक्टीरियल रोगजनकों के कार्बन चयापचय में17,22,23, फैटी में इसके कार्यांवयन में प्रदान की अंतर्दृष्टि एसिड पीछे की ठंड है । एक स्थिर आइसोटोप के भाग्य पर पहले विस्तृत विश्लेषण प्रणेता फैटी एसिड लेबल, अपने आहार रूटिंग या β-ऑक्सीकरण के माध्यम से क्षरण, मिट्टी invertebrate उपभोक्ताओं में, हाल ही में Menzel एट अल द्वारा किया गया था । 24. यहां, 13सी लेबल फैटी एसिड के साथ शामिल करने के लिए methodological मूल बातें अक्सर मिट्टी अकशेरूकीय, Collembola में प्रमुख वंश के isotopologue विश्लेषण के बाद, प्रदान की जाती हैं । इन microarthropods एक अच्छा मॉडल समूह के रूप में वे मिट्टी खाद्य वेब के महत्वपूर्ण घटक फार्म और अच्छी तरह से अपने पौष्टिकता मार्कर फैटी एसिड8,25के लिए जांच कर रहे हैं ।

उपभोक्ताओं में लिपिड चयापचय रास्ते की समझ पौष्टिकता मार्कर फैटी एसिड के उपयोग के लिए भोजन वेब पारिस्थितिकी में मात्रात्मक कार्बन प्रवाह के निर्धारण के लिए साधन के रूप में आवश्यक है । वर्तमान प्रोटोकॉल डिजाइन प्रदान करता है और एक प्रयोगशाला खिला प्रयोग के लिए स्थापित है, और निष्कर्षण और प्रमुख लिपिड भिन्न (तटस्थ लिपिड, फॉस्फोलिपिड) Collembola से मिथाइल के लिए जैव रासायनिक प्रक्रियाओं. यह दर्शाता है कि कैसे फैटी एसिड की isotopologue संरचना मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया है और संबंधित सूत्र और गणना का वर्णन करता है । इस प्रक्रिया में परिणाम: (i) isotopologues के अनुपात के जनक आयन के द्रव्यमान से अधिक (यानी, फैटी एसिड आणविक आयन एम+) द्वारा एक या अधिक जन इकाइयों (एम+ 1, एम+ 2, एम+ 3, आदि) और (ii) समग्र 13 सी संवर्धन फैटी एसिड में से व्युत्पंन 13c लेबल प्रणेता । हालांकि Collembola के लिए इस्तेमाल किया, इस दृष्टिकोण आम तौर पर किसी भी अंय शिकारी के लिए लागू किया जा सकता है कि इन नियंत्रित शर्तों के तहत पर्याप्त मात्रा में culturable है एक सफल लेबल और बाद में सुनिश्चित करने के लिए आधार पर संपर्क शिकार सत्यापन.

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Protocol

वर्णित प्रोटोकॉल पशु नैतिकता की क्षमता के तहत गिर नहीं करता है । हालांकि, जब लोग वर्णित प्रोटोकॉल को उच्च पशुओं में रूपांतरित करते हैं, तो ध्यान रखें कि संस्थागत पशु नैतिकता समिति ने पशु हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया हो ।

1. पशुओं की खेती

नोट: सभी समझाया प्रयोगात्मक कदम अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल पर आधारित हैं26,27,28. प्रयोगशाला में होने वाले परीक्षण में आसानी से culturable जीवों की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है । यहां Collembola प्रजाति के Protaphorura fimata (Gisin, १९५२) और Hetermurus nitidus (टेंपलटन, १८३५) का उपयोग किया गया है । दोनों प्रजातियों के लिए उत्पादक प्रयोगशाला है बेकर खमीर के साथ खिलाया संस्कृतियों के रूप में बनाए रखने सरल हैं ।

  1. तंग फिटिंग ढक्कन (व्यास 7 सेमी, ऊंचाई ४.५ सेमी) के साथ प्लास्टिक microcosms में, सक्रिय चारकोल का एक मिश्रण जोड़ने, पेरिस के प्लास्टर, और आसुत जल एक अत्यधिक नम प्रजनन सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए (चित्र 1a) ।
    1. जब तैयारी microcosms मिश्रण पर्याप्त सब्सट्रेट, जैसे, एक बैच में 10 microcosms के लिए. मिश्रण पेरिस के प्लास्टर के 9 भागों (२२५ ग्राम) और सूखी सक्रिय चारकोल के 1 भाग (25 ग्राम) एक प्लास्टर पॉट में एक साथ, आसुत जल के 10 भागों के बारे में ध्यान से जोड़ें (२५० मिलीलीटर) और कमरे के तापमान पर क्रियाशीलता के बिना 5 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. एक मोटी सूप स्थिरता हासिल की है जब तक हवा के बुलबुले से बचने के लिए दक्षिणावर्त दिशा में मध्यम गति से एक प्रयोगशाला चंमच के साथ हिलाओ । के बारे में 1 सेमी की ऊंचाई को microcosms में तुरंत डालो ।
    3. बेंच पर कोमल दोहन और घूमता द्वारा प्लास्टर चिकना । ध्यान दें कि छेद (हवा बुलबुले के यादृच्छिक उत्पादों) और furrows (सक्रिय रूप से एक बाँझ रंग के साथ जोड़ा) उपजाऊ Collembola अंडे देना करने के लिए प्रोत्साहित कर सकते हैं । यह अध्ययन एक ही reproducible शर्तों होने के पक्ष में छेद और furrows से परहेज । हालांकि, प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए आंकड़ा 1b कुछ छेद प्रस्तुत करता है ।
    4. कमरे के तापमान पर लगभग 1-2 दिनों के लिए सुखाने की अनुमति दें; ६० डिग्री सेल्सियस पर मशीन 1-2 एच के लिए उस समय को कम कर सकते हैं ।
    5. गीला microcosms एक पिपेट के साथ नल का पानी जोड़कर उपयोग करने से पहले जब तक सब्सट्रेट थोड़ा नम है । नियमित रूप से आसुत जल जोड़ने के द्वारा सूक्ष्म जगत नम रखें के रूप में Collembola एक नरम छल्ली है और सुखाना के लिए अतिसंवेदनशील है ।
  2. एक सरल चूषण ट्यूब का उपयोग कर प्लास्टर बेस करने के लिए आसानी से Collembola हस्तांतरण, यानी, ट्यूब में पशुओं के चूषण को रोकने के लिए एक छोटे से जाल के साथ सज्जित एक पिपेट टिप के साथ 25 सेमी लंबे के बारे में एक लंबे समय से सिलिकॉन ट्यूब. वैकल्पिक रूप से, उंहें एक छोटे ब्रश के bristles पर पालन करने की अनुमति देकर पशुओं के हस्तांतरण ।
  3. स्थानांतरण (१.२ कदम देखें) 30 नए microcosms में हौसले से रचा Collembola और भोजन के रूप में दानेदार सूखी बेकर खमीर प्रदान (एक चाकू टिप के बारे में) (चित्र 1b); सप्ताह में कम से दो बार नवीनीकृत । तीन नमूना दिन प्रति स्वतंत्र प्रतिकृति योजना; इस अध्ययन के दिनों में 0-7 और 14. अंधेरे में 15 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । एक निरंतर तापमान को बनाए रखना आवश्यक है, के रूप में फैटी एसिड पशु चयापचय द्वारा बदल रहे है झिल्ली तरलता के लिए आवश्यकताओं को पूरा ।
  4. चार सप्ताह के लिए है बेकर खमीर के साथ Collembola फ़ीड जोखिम प्रयोगों शुरू करने से पहले एक समरूप 13c/फैटी एसिड में12सी संकेत और पैटर्न मिलता है । एक चूषण ट्यूब या एक ब्रश का उपयोग करने के लिए सभी अंडे (चित्रा 1C), मल छर्रों, और exuviae नियमित रूप से जानवरों के रूप में उन पर खिला सकता है जिससे उनके लिपिड प्रोफ़ाइल फेरबदल ।

Figure 1
चित्र 1: Collembola की खेती । (ए) प्रजनन सब्सट्रेट, प्लास्टर ऑफ पेरिस, सक्रिय चारकोल और आसुत जल के एक सूखे मिश्रण से भरा सूक्ष्म जगत । (ख) और (ग) एक Protaphorura fimata संस्कृति का प्रतिनिधि नमूना; सूखी है बेकर खमीर के छोटे सोने की डली खाद्य स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया और भी प्रजनन सब्सट्रेट में छेद के रूप में (काला तीर) (ख) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो अंडे (सफेद तीर) (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. लेबलिंग आहार, फसल, और नमूना हैंडलिंग

  1. लेबलिंग
    1. चार सप्ताह Collembola संस्कृतियों की स्थापना के बाद, 30 व्यक्तियों प्रत्येक जगह नए microcosms और गर्मी में 15 ° c अंधेरे में ।
    2. उंहें एक पूरी तरह से 13सी-लेबल palmitic एसिड (13C16 युक्त बेकर्स खमीर खिला द्वारा पल्स लेबल परिचय: 13सी-लेबल palmitic एसिड एक रंग के साथ बेकर खमीर के साथ एक अनुपात 0.5:1, जैसे, 5 जी में मिश्रण से 0, ९९ एटम%) 13 C16:0 और 10 जी सूखी बेकर खमीर । प्रत्येक सूक्ष्म जगत पर एक चाकू टिप के बारे में जगह है ।
    3. 6 घंटे के बाद, पूरी तरह से लेबल बेकर खमीर के साथ इस लेबल भोजन की जगह ।
  2. आगे की खेती
    1. प्रयोग के दौरान खमीर आहार हर तीन दिन नवीनीकृत और मात्रा क्या Collembola कि अवधि के भीतर भस्म हो जाएगा से अधिक जोड़ें । सबसे महत्वपूर्ण बात, एक चूषण ट्यूब या ब्रश का उपयोग करने के लिए Collembolan अंडे, मल छर्रों और नियमित रूप से exuviae को हटाने के लिए प्रदान की भोजन पर जानवरों द्वारा विशेष खिला सुनिश्चित करते हैं ।
  3. फसल
    1. नमूना microcosms विनाशकारी दैनिक 7 दिन तक । फिर 14 दिन पर, प्रत्येक नमूना समय पर तीन स्वतंत्र प्रतिकृति इकट्ठा; अलग नमूना समय संभव हो रहे हैं ।
    2. तैयार 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों Teflon लेपित पेंच टोपियां, प्रत्येक नमूने के लिए एक से सुसज्जित है । पहले से एक कांच के बनने वाले वॉशर में इन ट्यूबों साफ और बाद में पानी के साथ दो बार कुल्ला । अंत में, hydrophobic प्रदूषक के किसी भी निशान को हटाने के लिए दो बार क्लोरोफॉर्म (HPLC ग्रेड), भंवर मोटे तौर पर और विलायक त्याग के 2 मिलीलीटर जोड़कर धो लो ।
    3. नियंत्रण नमूनों के लिए (दिन 0), ३ ३० गैर उजागर Collembola से पूर्व संस्कृतियों के रूप में दिन 0 नमूने ले ।
    4. उजागर नमूनों के लिए (1 दिन और बाद), प्रत्येक मामले में दैनिक नमूनों के लिए ले ३ ३० मध्यवर्ती 13 सी के मिश्रण से तंग आ संस्कृतियों से Collembola उजागर-palmitic एसिड और बेकर खमीर लेबल ।
    5. रिकार्ड Collembola एक अल्ट्रा microbalance द्वारा ताजा वजन । उचित पैमाने पर एक निकासक या ब्रश का उपयोग कर पशुओं स्थानांतरण-पंस । स्केल-पंस में वजन के दौरान Collembola की आसान हैंडलिंग सुनिश्चित करने के लिए, शॉक-कूल जानवरों से पहले (-८० ° c 2 घंटे के लिए) । वैकल्पिक रूप से, 10 मिनट के लिए एक सह2 धारा सुरक्षित अचेत पशुओं कर सकते हैं ।
  4. सीधे पैमाने से डाल जानवरों वजनी बाद 10 मिलीलीटर ग्लास टेस्ट ट्यूब में ध्यान से पंस । मेथनॉल (HPLC ग्रेड) के 1 मिलीलीटर के साथ ट्यूबों भरें और विश्लेषण तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: इस कदम के बाद से, जैविक सॉल्वैंट्स शामिल कर रहे हैं के रूप में प्लास्टिक उपकरणों के साथ हैंडलिंग नमूना से बचने; इसके बजाय मशीन और पिपेट कि सॉल्वैंट्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कांच वाहिकाओं के लिए उपयुक्त हैं का उपयोग करें ।

3. पशु ऊतक और Methanolysis से लिपिड निष्कर्षण

  1. तीन ग्लास टेस्ट ट्यूबों तैयार (Teflon लेपित पेंच टोपियां के साथ सुसज्जित) प्रति बैच केवल रिक्त मूल्यों के रूप में मेथनॉल के 1 मिलीलीटर युक्त । महत्वपूर्ण बात, जोड़ें या किसी भी विलायक केवल ग्लास पिपेट या क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल कुल्ला विलायक प्रतिरोधी मशीन द्वारा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया हस्तांतरण ।
  2. लिपिड निष्कर्षण प्रक्रिया की शुरुआत में, वाष्पीकरण द्वारा भंडारण (या रिक्त) के लिए लागू मेथनॉल को कम; एक कॉंपैक्ट benchtop रोटेशन वैक्यूम संकेंद्रक (आरवीसी) एक वैक्यूम पंप और एक ठंडे जाल से सुसज्जित की सिफारिश की है । आरवीसी में खुला ट्यूबों हस्तांतरण और ५० डिग्री सेल्सियस और २०० hPa के वैक्यूम दबाव 20 मिनट के लिए पर शुष्क जब तक लुप्त हो जाना ।
  3. एक चरण निष्कर्षण विलायक के 5 मिलीलीटर जोड़ें (क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/0.05 एम फॉस्फेट बफर 1:2: 0.8, पीएच ७.४) (रिक्तियों सहित) प्रत्येक नमूने के लिए और रात भर मिलाते हुए कमरे के तापमान पर Collembolan लिपिड निकालने (~ २०० rpm) ।
  4. नए ट्यूबों के लिए विलायक हस्तांतरण और निष्कर्षण विलायक के एक अतिरिक्त २.५ मिलीलीटर के साथ 3 एच के लिए झटकों से फिर से निकालने के नमूने । उसके बाद, दोनों चरणों से अर्क गठबंधन; ग् पाश्चर पिपेट के उपयोग की सिफारिश की गई है । क्लोरोफॉर्म और आसुत जल की ०.८ मिलीलीटर की ०.८ मिलीलीटर जोड़ें, तो मिश्रण और 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर २,००० ग्राम में केंद्रापसारक । अंत में, नमूने जलीय और क्लोरोफॉर्म चरणों की जुदाई के लिए 5 मिनट के लिए खड़े करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. फैटी एसिड पैटर्न विश्लेषण के लिए, Collembola के कुल सेलुलर लिपिड तटस्थ लिपिड, glycolipid, और फॉस्फोलिपिड भागों में विभाजित ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, एक सिलिका अम्ल स्तंभ (०.५ g silicic एसिड के साथ वाणिज्यिक कॉलम, मेष आकार 100-200 µm, सामग्री की तालिकादेखें) क्लोरोफॉर्म (कंडीशनिंग) के 1 मिलीलीटर जोड़कर तैयार करें. इस प्रक्रिया को गति देने के लिए, आमतौर पर ठोस चरण निष्कर्षण के लिए क्रोमैटोग्राफी में प्रयुक्त के रूप में एक वैक्यूम ब्लॉक पर स्तंभों माउंट । नायलॉन सुई का उपयोग न करें; ट्यूबों के ऊपर स्टेनलेस स्टील का प्रयोग करें ।
    2. क्लोरोफॉर्म के लिए उपयोग किया जाता है के बाद स्तंभ के माध्यम से दिया गया है एक व्यक्तिगत स्तंभ के लिए प्रत्येक नमूने के पूर्ण लोअर क्लोरोफॉर्म चरण स्थानांतरण । इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, ऊपरी जलीय चरण पहले से निकाला जा सकता है । कांच के पाश्चर पिपेट का उपयोग करें, तथापि, ध्यान रखें कि कॉलम बाहर सूखी नहीं है ।
    3. क्रमिक elute लिपिड अंशों के साथ क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर (तटस्थ लिपिड फैटी एसिड सहित, NLFAs), एसीटोन के 10 मिलीलीटर (glycolipids-इस परियोजना में विश्लेषण नहीं) और मेथनॉल के 5 मिलीलीटर (फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड, PLFAs सहित). व्यक्तिगत कांच वाहिकाओं में प्रत्येक अंश लीजिए ।
    4. निष्कर्षण के अंत में, एक आरवीसी में वाष्पीकरण के माध्यम से क्लोरोफॉर्म (NLFAs) और मेथनॉल (PLFAs) को कम करें । आरवीसी के लिए खुला ट्यूबों हस्तांतरण और शुष्क, ~ ६० डिग्री सेल्सियस और 24 hPa के एक निर्वात पर ९० मिनट तक लुप्त हो जाना ।
  6. saponification शुरू (NLFA और PLFA अंशों) वेल्च से प्रोटोकॉल का पालन (१९९१)29 सोडियम हीड्राकसीड के 1 मिलीलीटर के अलावा-मेथनॉल समाधान (सोडियम हीड्राकसीड के ४५ ग्राम, मेथनॉल के १५० मिलीलीटर, और आसुत जल के १५० मिलीलीटर) और मशीन १०० पर एक पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए ° c । 2 मिनट के लिए बर्फीले पानी में नमूना ठंडा है, तो नमूने बेंच पर वापस रख दिया और कमरे के तापमान पर काम जारी है ।
  7. रिक्तियों सहित प्रत्येक नमूने के लिए आंतरिक मानक जोड़ें । एक फैटी एसिड प्रयोगात्मक जीवों में आम नहीं चुनें; इसके अलावा एक संतृप्त फैटी एसिड का उपयोग करने के लिए दरार से नुकसान को कम करने और मध्यवर्ती श्रृंखला लंबाई के साथ एक अणु का चयन करें । कई प्रयोजनों के लिए, अजीब गिने nonadecanoic एसिड (19:0) अच्छी तरह से काम करता है । तो, isooctane में एक ०.७४ mM समाधान के 30 µ एल जोड़ें । सटीक मात्रा बहुत महत्वपूर्ण है-सुनिश्चित करें कि अग्रिम में एक microbalance के साथ अपने पिपेट की परिशुद्धता की जांच की है ।
  8. हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 2 मिलीलीटर जोड़ें-मेथनॉल (मेथनॉल के २७५ मिलीलीटर के साथ ६.० N हाइड्रोक्लोरिक एसिड की ३२५ मिलीलीटर मिश्रण), एक पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए ८० ° c पर मशीन और बर्फ पर तेजी से 2 मिनट के लिए ठंडा । यह कदम समय और तापमान संवेदनशील है; का प्रयोग करें ८० ± 1 ° c और 10 ± 1 min. कितने नमूनों के साथ जांच एक बार में पानी स्नान में जा सकते है ८० डिग्री सेल्सियस रखने के लिए ।
    नोट: फैटी एसिड में यह प्रक्रिया परिणाम मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि), यानी, फैटी एसिड analytes गैस क्रोमैटोग्राफी में वाष्पीकरण के लिए स्थिर ।
  9. अंत में, hexane/मिथाइल तृतीयक butyl ईथर (1:1) के १.२५ मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए धीरे से रॉक, तो 5 मिनट के लिए २,००० ग्राम में केंद्रापसारक । नीचे चरण निकालें और शीर्ष चरण प्रसिद्धि के शामिल रखना; प्रयोग ग् पाश्चर पिपेट । एक कपड़े धोने कदम के लिए जलीय सोडियम हीड्राकसीड (आसुत जल के ९०० मिलीलीटर में भंग NaOH के १०.८ ग्राम) के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. रॉक और फिर से केंद्रापसारक ।
  10. पूर्ण ऊपरी लिपिड युक्त चरण एक ग्लास पाश्चर पिपेट और एक गैस क्रोमैटोग्राफी नमूना शीशी एक Teflon पट से सुसज्जित करने के लिए स्थानांतरण का उपयोग कर लो । जलीय चरण के भी छोटे मात्रा सहित से बचें, यह GC माप के साथ समस्याओं का कारण होगा के रूप में. शीशी encapsulate और विश्लेषण तक-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।

4. जीसी-फिड द्वारा फैटी एसिड का ठहराव

  1. Collembola (जन्तु) लिपिड्स के NFLA और PLFA अंशों में प्रसिद्धियों की पहचान करने और उनकी मात्रा को पहचानने के लिए गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करें । लौ ionization डिटेक्टर (फिड) से सुसज्जित एक गैस chromatograph (जीसी) एक स्थापित और सिद्ध उपकरण है30.
  2. प्रसिद्धि की पहचान के लिए, एक प्रसिद्धि मानक में उन लोगों के लिए नमूने में चोटियों के प्रतिधारण समय की तुलना करें । इन प्रमुख प्रसिद्धि खाद्य उत्पादों और जीवों की एक किस्म को कवर के गुणात्मक या मात्रात्मक मानक मिश्रण कर रहे हैं ।
  3. जांच जीव समूह और प्रायोगिक आहार के लिए प्रतिनिधि फास शामिल प्रसिद्धि मानक मिश्रण को रोजगार । Collembola में, ये फैटी एसिड eukaryotes के लिए विशेषता है, जैसे, arachidonic एसिड (20:4 ω6) के रूप में लंबी श्रृंखला पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड होता है । जब आहार के रूप में खमीर रोजगार इन linoleic एसिड (18:2 ω6) के रूप में कवक मार्करों हैं । एक अच्छा विकल्प तथाकथित प्रसिद्धि मिश्रण है, पशु, कवक और संयंत्र सामग्री में लगातार ३७ विभिन्न फैटी एसिड शामिल, और बैक्टीरियल एसिड मिथाइल एस्टर (बमे) मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें).
  4. जीसी-फिड पर नमूनों को चलाने के लिए, साधन के संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ एक अनुक्रम की स्थापना की । निर्देशों के लिए, निर्माता के मैनुअल का संदर्भ लें । अनुक्रम बाहरी मानक मिश्रण (जैसे प्रसिद्धि और बमे मिश्रण) के साथ शुरू होता है, नमूनों के बाद. ध्यान दें कि वहां एक प्रतिधारण समय बदलाव है, यानी, प्रत्येक चलाने के साथ GC कॉलम से फैटी एसिड की रेफरेंस समय में एक मामूली देरी, जबकि नमूने चल रहा है! या तो एक मानक हर 10th नमूना अनुक्रम या उपयोग प्रतिधारण समय palmitic एसिड (16:0) के लिए लॉकिंग में चलाने शामिल हैं ।
  5. लिखत पर निर्भर GC सेटिंग्स ढल. निम्नलिखित कार्यक्रम एक उच्च प्रदर्शन (एचपी) केशिका कॉलम (25 एम एक्स ०.२ मिमी आईडी, फिल्म मोटाई ०.३३ µm के लिए सुझाव दिया है । सेट इंजेक्शन मात्रा 1 µ एल के लिए विभाजित मोड में और वाहक गैस के रूप में हाइड्रोजन का उपयोग करें । ५० डिग्री सेल्सियस (1 मिनट के लिए आयोजित) और 25 ° c min-1 से १७५ डिग्री सेल्सियस के बाद 3 डिग्री सेल्सियस-1 करने के लिए २३० ° c (५.७ मिनट के लिए आयोजित) द्वारा पीछा एक तापमान कार्यक्रम शुरू रोजगार ।
  6. nmol फैटी एसिड प्रति ग्राम ताजा (सूखी) प्रत्येक प्रसिद्धि के लिए निंनलिखित सूत्र का उपयोग कर संबंधित फैटी एसिड के लिए ज्ञात मात्रा को लागू करने के लिए फिड द्वारा प्राप्त प्रतिक्रिया का उपयोग जीवों के वजन की गणना:
    Equation 1
    एकप्रसिद्धि: नमूना में संबंधित प्रसिद्धि के पीक क्षेत्र
    मेगावाटएफएम: µ जी में संबंधित प्रसिद्धि के आणविक वजन µmol/
    CIS: µ g में आंतरिक मानक की एकाग्रता
    AIS: आंतरिक मानक का पीक क्षेत्र
    एमकर्नल: ताजा (सूखी) जी में संबंधित Collembola नमूना के वजन
    १०००: µmol से nmol के लिए रूपांतरण कारक
    cBW: nmol में संगत रिक्त मानों के माध्य में संबंधित प्रसिद्धि की एकाग्रता

5. 13सी विश्लेषण द्वारा Isotopologue profile

  1. एक GC एक मास चयनात्मक डिटेक्टर के साथ मिलकर प्रणाली का प्रयोग करें (एमएस) isotopologue दृढ़ संकल्प के लिए एक इलेक्ट्रॉन ionization (ेि) स्रोत के साथ आपूर्ति की ।
    1. एक ध्रुवीय केशिका स्तंभ (उदा, DB 23, CP-एसआईएल ८८) का उपयोग करें, क्योंकि यह आगे भी दोहरे बांड के एक ही नंबर के साथ unसंतृप्त फैटी एसिड की जुदाई की अनुमति देता है । GC कॉलम का चुनाव परिणामों के लिए महत्वपूर्ण के रूप में यह फैटी एसिड में अणु आयन का अच्छा प्रतिनिधित्व निर्धारित करता है ।
    2. एक DB के लिए 23 कॉलम (६० एम एक्स ०.२५ मिमी आईडी, फिल्म मोटाई ०.१५ µm), १३० डिग्री सेल्सियस पर ओवन तापमान शुरू और ६.५ डिग्री सेल्सियस से वृद्धि/ २०३ ° c के लिए 3 ° c/मिनट की वृद्धि के साथ पालन करें और १.९ मिनट के लिए पकड़ के लिए ४० ° c/मिनट की वृद्धि के साथ पालन २३० ° c और पकड़ ८.३ मिनट के लिए सेट स्थानांतरण लाइन तापमान २८० डिग्री सेल्सियस के लिए । फिर, साधन के लिए जीसी विधि समायोजित करें ।
    3. सभी फैटी एसिड के लिए प्रसिद्धि के ज्ञात मात्रा में शामिल मात्रात्मक मानकों का प्रयोग करें 13सी शामिल करने के लिए जांच की जानी चाहिए । इन मानकों को चलाने के प्रत्येक नमूना अनुक्रम के प्रारंभ और अंत में रखें । इन मानकों से ब्याज की फैटी एसिड की अवधारण बार ले लो ।
    4. प्रयोगों से नमूनों को हमेशा अनलेबल किए गए नमूनों से शुरू करने और उसके बाद की गई जांचों को मापने । नमूना सांद्रता के लिए उपयुक्त एक विभाजन अनुपात लागू करें, उदा. 1:12.5. यदि साधन के लिए उपलब्ध है, तो प्रत्येक नमूने को शेष analytes से स्तंभ साफ़ करने के लिए चलाने के बाद हीलियम के साथ एक backflush लागू करें ।
    5. यदि SIM प्राप्ति स्थानांतरण से पीड़ित नहीं है और reproducible analyte अवधारण समय है, तो GC-MS विधि करने के लिए अवधारण समय लॉकिंग लागू करें ।
  2. GC/द्वारा फैटी एसिड की आणविक आयन में 13सी शामिल करने का निर्धारण-एमएस चयनित आयन निगरानी (सिम) साधन के मोड का उपयोग कर. सिम मोड में आपरेशन पूर्ण स्कैन मोड के सापेक्ष वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ विशिष्ट analytes का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।
    1. पहले क्या मौजूद है और फिर उचित आयनों पर सिम चलाने के लिए देखने के लिए एक प्रारंभिक स्कैन चलाएं । एम/जेड स्कैन विंडोज (सिम समूहों) का चयन करके ब्याज की आणविक जनता में डेटा प्राप्त संबंधित फैटी एसिड के क्रोमेटोग्राफिक पीक समय शामिल । सामांयतया, analyte और समय विंडो प्रति दो से चार आयनों की निगरानी ।
    2. आदेश में संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, बड़े पैमाने पर स्कैन दर को समायोजित करने और समय (प्रत्येक मास में देख बिताया बार) निवास । सबसे अच्छी गुणवत्ता डेटा सबसे कम संभव गति से प्राप्त कर रहे हैं, और सिम में एक आम तौर पर नियम analyte चोटी पर 8 से 12 स्कैन है । साधन सेटिंग्स के लिए एक प्रॉक्सी 9 ms, 6 एस के एक चक्र के समय और १७५ ms cyle-1के एक स्कैन समय के प्रति मास एक औसत निवास समय है.
    3. आणविक आयन (एम+) संबंधित फैटी एसिड का पता लगाने और उसके सभी isotopologues (एम+ 1, एम+ 2 और आगे). उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणाम देखें.
    4. प्रत्येक आयन टुकड़ा की बहुतायत रिकॉर्ड (isotopologue) । ध्यान दें कि अणु आयन की बहुतायत और उसके isotopologues अपेक्षाकृत कम है और ठहराव की गुणवत्ता एमएस सिस्टम के प्रदर्शन पर बहुत निर्भर करता है । एक बड़ा नमूना अनुक्रम (प्रयोग) शुरू करने से पहले एक धुन चलाने के लिए और अगर आवश्यक आयन स्रोत साफ ।
      नोट: सबसे पहले, इन आंकड़ों के भस्म अग्रदूत (यहां 16:0) द्वारा प्रत्येक फैटी एसिड के समग्र 13सी संवर्धनों उपज ।
    5. पौष्टिकता कार्बन प्रवाह आवंटित करने के लिए उनके अगोचर समकक्षों से लेबल फैटी एसिड की आइसोटोप संरचना के अनुपात का उपयोग करें । ६.१ चरण में एटम% सूत्र का प्रयोग करें लेबल कार्बन के प्रतिशत की गणना करने के लिए (एटम प्रतिशत, एटम%) संबंधित फैटी एसिड में । लेबल के बीच Collembola के फैटी एसिड में 13सी के प्रतिशत की तुलना (1 दिन और बाद में) और unlabeld पशु (दिन 0) उपभोक्ता में आहार से 13सी के प्रवाह के लिए रिश्तेदार संकेत के रूप में ।
    6. फैटी एसिड श्रृंखला में 13सी निगमन की स्थिति निरुपित । isotopologues के वितरण के आधार पर पूरे के रूप में चिह्नित अनुरेखक फैटी एसिड की आहार मार्ग फंसाए (यहां 16:0) श्रृंखला बढ़ाव से लिपिड चयापचय द्वारा. जबकि पूरे मार्कर अणु के आत्मसात माता पिता आयन के लिए दूर isotopologues की बहुतायत बढ़ जाती है (एम+), उदाहरणके लिए, एम+ 15, एम+ 16, श्रृंखला के साथ बढ़ाव के उपयोग से 13सी बला c2 टुकड़े (13ग एसिटाइल-CoA) आणविक आयन के पास isotopologues अधिक लगातार मिलता है ।

6. 13सी संवर्धन की गणना

  1. isotopologues के वितरण के अनुसार, लेबल कार्बन के समग्र प्रतिशत की गणना (एटम% में) संबंधित फैटी एसिड में निंनलिखित संबंध का उपयोग: एटम% = (अनुपात 13C isotopologue शामिल) x (आवृत्ति संबंधित isotopologue)
    यह Kuppardt एट अल के बाद की गणना की है. 31 के रूप में:Equation 2
    जहां N फैटी एसिड में कार्बन परमाणुओं की संख्या है, जंमू 13सी आइसोटोप की संख्या है, एकएम + जे संबंधित isotopologue की बहुतायत है, और एकटी सभी isotopologues की कुल बहुतायत ।
  2. गणना के लिए, संबंधित एफए और सभी isotopologues (एम+ 1, एम+ 2, और इतना आगे), सिम द्वारा पता चला-एमएस विश्लेषण के आणविक आयन (एम+) के पीक क्षेत्र मूल्यों राशि, और १००% सापेक्ष बहुतायत के लिए सेट । प्रत्येक पता लगाया isotopologue के भाग की गणना आसानी से तीन के नियम का पालन करके है ।
  3. गैर-बला दिवस 0 नियंत्रण मूल्य (प्राकृतिक 13सी पृष्ठभूमि) को अंतिम डेटा प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन बाहरी 13सी-लेबल करने के लिए ही वापस पता लगाया है ।

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Representative Results

Collembola के ताजा वजन और लिपिड सामग्री
वर्णित प्रयोग के पाठ्यक्रम में, NLFAs और PLFAs में सामग्री समय के साथ काफी बदल नहीं किया, जबकि नमूनों का ताजा वजन थोड़ा बढ़ गया, लेकिन काफी नहीं24. दोनों मापदंडों Collembola नमूनों की शारीरिक फिटनेस का एक अच्छा स्तर संकेत मिलता है । फैटी एसिड और आइसोटोप विश्लेषण के लिए नमूना दिनों के लिए इसी प्रयोग भर में Collembola के ताजे वजन और लिपिड सामग्री की जांच करने के लिए जागरूक हो । ध्यान दें कि प्रयोगात्मक अवधि के दौरान वजन और/या लिपिड सामग्री की कमी का एक कम फिटनेस का संकेत परीक्षण जीव और व्युत्पंन डेटा काफी महत्व खो देते हैं ।

Isotopologue डिटेक्शन
isotopologue की रूपरेखा परियोजनाओं के विशेष महत्व व्यक्तिगत पता लगाने और दोनों आणविक आयन और एक विशिष्ट फैटी एसिड में सभी isotopologues के ठहराव में निहित है । उदाहरण के लिए, 16:0 के मामले में २७० से आयनों रेंज, यानी, आणविक आयन एम+ (सी कंकाल मुख्य रूप से 12सी परमाणुओं से बना) २८६ करने के लिए (isotopologue M+ 16 -कार्बन श्रृंखला पूरी तरह से भारी 13सी के साथ प्रतिस्थापित) । चित्रा 2a शुद्ध 16:0, palmitic एसिड की एक सिम एमएस स्पेक्ट्रम प्रस्तुत करता है । इस यौगिक में १३सी की प्राकृतिक प्रचुरता आणविक आयन (एम+) के अलावा एम+ १ और एम+ २ isotopologues की उपस्थिति से detectable हो जाती है. तुलना करके, चित्रा बी 1 पूरी तरह से लेबल palmitic एसिड (९९ एटम% 13सी) इस अध्ययन में इस्तेमाल की spectrogram से पता चलता है । यहां, आयन एम के एकमात्र घटना+ 16 इस सिंथेटिक लेबल यौगिक की उच्च शुद्धता को दर्शाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: शुद्ध के प्रतिनिधि सिम स्कैन (एक) unलेबल और (ख) पूरी तरह से palmitic एसिड लेबल. नोट में आणविक आयन (m+) के अलावा m+ 1 और m+ 2 isotopologues की प्राकृतिक बहुतायत लेबल्ड सी 16:0 (ए) लेकिन पूरी तरह से लेबल फैटी एसिड में एम+ 16 isotopologue की अनंय उपस्थिति (९९ एटम % 13C) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बढ़ाव/बनाम de नोवो संश्लेषण
परीक्षण जीवों, लिपिड निष्कर्षण और derivatization फसल कटाई के बाद, उत्पन्न प्रसिद्धि GC और सिम एमएस द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं । isotopologue profiling डेटा की परीक्षा के द्वारा, एक अब पूरे लेबल मार्कर फैटी एसिड की de नोवो संश्लेषण और संतृप्ति/बढ़ाव की घटनाओं के बीच भेद कर सकते हैं । पूर्व जगह ले सकते हैं, कम से आंशिक रूप से, 13सी एसिटाइल पर आधारित-बीटा-ऑक्सीकरण के माध्यम से लेबल अग्रदूत के क्षरण के उत्पाद के रूप में CoA । चित्रा 3 लेबलिंग के बाद पहली नमूना दिन पर एच nitidus के PLFA अंश में चार प्रमुख फैटी एसिड से व्युत्पंन सिम स्कैन के प्रतिनिधि उदाहरण से पता चलता है । palmitic एसिड में लेबल मार्कर अणु के आत्मसात एम+ 16 -isotopologue की बहुतायत से दिखाई देता है, के रूप में यह पूरी तरह से लेबल फैटी एसिड का प्रतिनिधित्व करता है (3 ए-16:0) । इसके अलावा, 16:0 के संतृप्ति (चित्र बी -16:1 ω7) या बढ़ाव प्लस संतृप्ति (चित्रा 3 सी-18:1 ω9, चित्रा 3d -20:4 ω6) सौंपा जा सकता है. इस प्रकार, एम+ 16, उदा एम+ 17 और एम+ 18 की तुलना में बड़ा isotopologues का पता लगाना 13c2-अंशों के उपयोग द्वारा बला के प्रणेता 16:0 के श्रृंखला बढ़ाव को प्रदर्शित करता है. De नोवो 13सी एसिटाइल-फैटी एसिड की CoA पर आधारित संश्लेषण संकेत दिया है अगर isotopologues आणविक आयन के करीब, यानी, एम+ 1 से एम+ 2 के लिए काफी अधिक से अधिक लगातार प्राप्त नियंत्रण में प्रतिनिधित्व दिन 0 नमूना ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि सिम (चयनित आयन निगरानी) Heteromurus nitidus के फैटी एसिड में टुकड़ा आयनों के स्कैन (PLFA अंश, लेबलिंग के बाद 1 दिन). (A) Palmitic अम्ल (16:0) (B) Palmitoleic अम्ल (16:1 ω7) (C) ओलिक अम्ल (18:1 ω9), और (D) Arachidonic अम्ल (20:4 ω6). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसके अलावा इस illustrating, चित्रा 4 पांच सबसे भारी फैटी एसिड लेबल के प्रारंभिक isotopologue पैटर्न की तुलना (दोनों PLFAs और NLFAs में विश्लेषण); तुलना दिन 0 और दिन 1 पर Collembola प्रजातियों P. fimata से डेटा रहे हैं । 1 दिन पर, C16 और C18 में 13सी संकेत लगभग पूरी तरह से एम+ 16अणु आयन की घटना पर आधारित था, पूरी तरह से 13सी 16:0 लेबल से जिसके परिणामस्वरूप, भोजन के लिए पूरक । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, 18:0 और 18:1 ω9 के एम+ 18 के देखा निशान 13सी एसिटाइल के एक छोटे से हिस्से की शुरूआत का सुझाव-16:0 से 18:0 के लिए श्रृंखला बढ़ाव के माध्यम से CoA । 18:1 ω9 के लिए यह PLFA गुट में अधिक स्पष्ट था. इस तरह के 13सी एसिटाइल-CoA 13सी 16:0 अणुओं लेबल के β-ऑक्सीकरण से निकला है । के निगमन 13सी एसिटाइल-CoA भी श्रृंखला लंबाई C18 से बढ़ाव कदम में C20 के लिए हुई, के रूप में ω6 नमूनों की 20:4 PLFA द्वारा सौंपा । जिससे, एम+ 16 और एम+ 18 में 13सी संवर्धन 14 दिन तक समय के साथ काफी बढ़ गया (चित्रा 4) । इसके अलावा, इस PLFA के एम+ 2 14 दिन में 20:4 ω6 वृद्धि हुई जब 0 या 1 दिन की तुलना में । अलग isotopologues में यह 13ग आवंटन इंगित करता है कि 20:4 ω6 के गठन के साथ डी नोवो संश्लेषण पर एसिटाइल-CoA के साथ 13सी या प्राकृतिक 13सी बहुतायत पर लेबल का समावेश के साथ आधारित है और पूरे 13C16 के बढ़ाव/: 0 अग्रदूत अणु । इसके विपरीत, स्पष्ट रूप से लेबल 20:4 ω6 NLFA अंश में प्रकट नहीं हुआ (आरेख 4) ।

Figure 4
चित्रा 4: सिम द्वारा 13सी निगमन के Isotopologue पैटर्न (चयनित आयन निगरानी). प्रस्तुत कर रहे है आयनों एम के सापेक्ष भागों+ 1 के लिए एम3 और एम+ 16 से एम+ 20 के पांच सबसे भारी NLFAs और PLFAs लेबल से Protaphorura fimata, दिन पर अनुमानित 0 और 1 दिन । केवल 20:4 ω6 के लिए दिन में 14 डेटा इसके अलावा प्रस्तुत कर रहे हैं । P< 0.05 (संदर्भ के रूप में उपयोग किए गए दिन 0 डेटा के साथ Dunnett का परीक्षण) । यह आंकड़ा Menzel एट अल में प्रकाशित चित्रा 5 का पुनर्मुद्रण है । 24 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Isotopologue profile

फास में 13सी वितरण में मात्रात्मक पहलुओं का एक विस्तृत विश्लेषण खाद्य जाले में कार्बन विभाजन आवंटित करने के लिए अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी की जरूरत है । वर्तमान काम रेखा बातचीत के लिए आम एफए में 13सी अनुपात/isotopologue का आकलन करने के लिए कार्यरत है । इस विधि अच्छी तरह से तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा-एमएस) द्वारा एमिनो एसिड विश्लेषण के लिए स्थापित है और रोगजनक बैक्टीरिया17,23में कार्बन चयापचय की जांच के लिए लागू किया गया था । हाल ही में, isotopologue आगे Menzel एट अल द्वारा छोटे मिट्टी अकशेरूकीय में लिपिड के आहार अनुमार्गण अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया था । 24 के बाद से इस विधि से बाधा नहीं है " 13सी संकेत के" पर ले, यह इसलिए अत्यधिक एक विशिष्ट के साथ समृद्ध ऊतक के मूल्यांकन के लिए लाभप्रद है GC-c-IRMS३२की तुलना में.

इस दृष्टिकोण के साथ, जन-को-प्रभार (m/z) आणविक आयन में मूल्यों और इसके isotopologues को GC-MS द्वारा ेि और SIM मोड का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है । पूर्ण स्कैन की तुलना में, सिम में संवेदनशीलता के बारे में फैक्टर १००, जो भी GC-फिड ठहराव रेंज३३धारियां द्वारा बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा, एक निश्चित समय खिड़की में आयनों का एक निर्दिष्ट समूह के अधिग्रहण के द्वारा, analyte मज़बूती से मापा जाता है के बावजूद एक पृष्ठभूमि के सह eluting चोटियों30. Thurnhofer और पुनरीक्षक३४ साबित कर दिया कि सिम दोनों एफए पहचान और खाद्य नमूनों में ठहराव के लिए उपयुक्त है भी लिपिड उपलब्ध की कम मात्रा के साथ ।

जब 13सी isotopologue के लिए सिम का उपयोग करने के कम से दो methodological बाधाओं पर विचार किया जाना है । सबसे पहले, आणविक आयनों अपेक्षाकृत कम बहुतायत के होते है और उनके isotopologues भी कम हैं । एक गंदा आयन स्रोत के साथ, इन कम प्रचुर मात्रा में हो और एक परिणाम के रूप में सिम विधि केवल अर्द्ध मात्रात्मक३३होगा । दूसरे, एफए के एक या एक से अधिक कार्बन पदों पर 13सी की वृद्धि हुई घटना एसोसिएटेड कार्बन परमाणुओं के 13सी प्राकृतिक बहुतायत घट जाती है । लेबलिंग के साथ इन परिवर्तनों को गैर रेखीय, एक घटना कहा जाता है "तिरछा" प्राकृतिक बहुतायत है, जो संवर्धन के इन बड़े पैमाने पर20का अनुमान लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह तिरछा प्रभाव प्रसिद्धि मानकों के आधार पर सुधार मैट्रिक्स का उपयोग करके या तो के लिए जवाबदेह होना चाहिए (फर्नांडीज एट अल.) या प्राकृतिक नियंत्रण, यानी, लेबल के बिना प्रयोगात्मक जीवों से फास शामिल है । बाद वर्तमान में एक ही एफए की तुलना काम में किया गया (1 दिन और बाद में) और गैर बला Collembola (0 दिन) ।

आहार रूटिंग और 13सी फ्लक्स

जबकि methodological में 13सी निर्धारण के लिए isotopologue profiling के लाभ स्पष्ट हैं, जीवों के vivo में चयापचय जैविक साधनों से रुकावट हो सकता है । Isotopic और चयापचय स्थिर राज्य को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है जब, जैसे, आहार के उपयोग या उपभोक्ताओं की शारीरिक स्थिति ज्ञात नहीं हैं, पूर्ण कार्बन प्रवाह प्राप्त करने में बाधा । हालांकि, आहार और उपभोक्ता में फास के 13सी isotopologues प्रोफाइल की तुलना करके, एफए आत्मसात और चयापचय रास्ते के सापेक्ष अनुपात प्राप्त किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण अपने आहार मार्ग अनुरेखण द्वारा अपने 13सी लेबल पर आधारित एक मार्कर एफए के विशिष्ट भाग्य का पालन करने की अनुमति देता है । एमएस-सिम का प्रदर्शन किया है कि मार्कर एफए मुख्य रूप से दोनों Collembola प्रजातियों में से NFLA भागों में कराई गई थी24का विश्लेषण । इसके अलावा, मार्कर एफए केवल मामूली या कोई संशोधनों के साथ तटस्थ लिपिड में संग्रहीत किया गया था । आहार के केवल बढ़ाव 13C16:0 करने के लिए 18:0 और monoenoic समकक्ष के लिए संतृप्ति का पता लगाया गया ( चित्रा 4देखें) । आयन एम की उपस्थिति+ 16 में C16 और C18 दिन की फास 1 नमूने की पुष्टि करता है कि इन फास पूरक पूरी तरह से palmitic एसिड लेबल के वंशज हैं. यह खोज पहले अध्ययन है कि उपभोक्ता और आहार केवल5,३५ के एफए पैटर्न पर आधारित थे और पता चलता है कि मार्कर फास उपभोक्ता ऊतक में पूरे अणुओं के रूप में शामिल कर रहे है (एक समीक्षा के लिए, Ruess देख और चेंबरलेन8).

इस बीच, PLFAs के isotopologue 13सी पैटर्न से पता चला है कि 13C20 में मनाया वृद्धि: 46 समय के साथ दोनों बढ़ाव के कारण है और साथ ही साथ बाद के साथ डी नोवो संश्लेषण लेबल पूरी तरह से भी शामिल 13 सी लेबल एसिटाइल-CoA के रूप में C20 में एम+ 18 आयन निशान की उपस्थिति द्वारा संकेत दिया और भी C18 ( चित्रा 4) देखें । चित्रा 5 पूरक 13C16:0 के भीतर PLFAs और मनाया Collembola प्रजातियों में से NLFAs के आहार रूटिंग संक्षेप । दिलचस्प है, केवल 13सी palmitic एसिड PLFAs के मजबूत परिवर्तन के अधीन है, जबकि NLFAs में चयापचय परिवर्तन केवल एक बढ़ाव और दो संतृप्ति कदम तक ही सीमित रह गया ।

Figure 5
चित्रा ५: उपभोक्ता लिपिड में पथ्य १३सी palmitic अम्ल का भाग्य. प्रवाह-चार्ट 13C16:0 जांच Collembola प्रजातियों में शामिल की प्रस्तावित भाग्य दिखाओ । तीर अलग मोटाई के साथ चयापचय कारोबार के विभिन्न स्तरों का प्रतीक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, एमएस द्वारा isotopologue रूपरेखा-सिम स्पष्ट रूप से पता चलता है कि एफए पौष्टिकता मार्कर के रूप में उपयोग खाद्य जाले की पारिस्थितिकी में एक मजबूत और विश्वसनीय तरीका है । हालांकि प्रयोगात्मक डिजाइन 13सी प्रवाह की सटीक ठहराव की अनुमति नहीं दी (उदाहरण के लिए, के रूप में एटम% 13सी पूरक एफए के) एफए चयापचय के रास्ते में अलग कदम के लिए, isotopologue profiling के लिए एक उपयोगी उपकरण है सभी पारिस्थितिक पौष्टिकता मार्करों के रूप में फैटी एसिड का उपयोग अध्ययन । भविष्य के लिए एक लक्ष्य के लिए बंद सूक्ष्म जगत प्रणालियों का उपयोग करके एक मात्रात्मक उपभोक्ता एफए कार्बन बजट प्राप्त है और खिला उपभोक्ताओं फैटी एसिड की लेबल के अग्रदूतों की मात्रा परिभाषित ।

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Acknowledgments

ड्यूश Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) द्वारा आर Menzel और एल Ruess की वित्तीय सहायता का आभार माना जाता है । आर Nehring आरयू 780/10-1 द्वारा वित्त पोषित किया गया । अंत में, हम अपनी पांडुलिपि को ठीक करने के लिए डॉ धुंधला Ruvimbo Maboreke के लिए बेहद आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neoLab-Round jars neoLab 2-1506 69 x 40 mm, 10 pacs/pack
Charcoal activated Carl Roth X865.1 p.a., powder, CAS No. 7440-44-0
Alabaster Dental RÖHRICH-GIPSE --- http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
Chloroform Carl Roth 7331.1 HPLC ≥ 99,9 %
Methanol Carl Roth P717.1 HPLC ≥ 99,9 %
Hexan Carl Roth 7339.1 HPLC ≥ 98 %
tert-Butyl methyl ether (MTBE) Carl Roth T175.1 HPLC ≥ 99,5 %
Aceton Carl Roth 7328.2 HPLC ≥ 99,9 %
NaOH Carl Roth 6771.1 p.a. ≥99 %, in pellets
di-Natriumhydrogenphosphat Carl Roth P030.1 p.a. ≥99 % , water free
Na-dihydrogenphosphat Dihydrat Carl Roth T879.1 p.a. ≥99 %
Hypochloric acid (6 N) VWR International 26,115,000 AVS TITRINORM vol. solution
Bond Elut (Columns) Agilent Tech. 14102037 HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK
Präparatengläser Duran Glasgerätebau Ochs 135215 Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket
Supelco 37 Component FAME Mix Sigma-Aldrich 47885-U Supelco 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard
FlowMesh Carl Roth 2796.1 Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing
Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix Sigma-Aldrich 47080-U Supelco 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard
Methyl nonadecanoate Sigma-Aldrich 74208 analytical standard ≥ 98.0 %
Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) Larodan Fine Chemicals 78-1600 GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %)
RVC 2-25 CDplus Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen Compact benchtop midi concentrator
Alpha 2-4 LDplus Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen Drying manifold
MZ 2C NT Vacuubrand GMBH Vacuum pump
Roto-Shake Genie Scientific Industries Combined rocking and rotating device
XP64 Micro Comparator Mettler Toledo Super high precision balance
GC-System 7890A Agilent Tech. Gas chromatograph
7000 GC/MS Triple Quad Agilent Tech. Triple Quad mass spectrometer
7683B Series Injector Agilent Tech. Sample injector
Heraeus Multifuge 3SR+ Thermo Scientific Centrifuge with 10 ml tube rotor

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References

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जैव रसायन अंक १३४ मास स्पेक्ट्रोमेट्री आणविक आयन Isotopologues फैटी एसिड 13सी-लेबलिंग कार्बन फ्लक्स मार्कर आहार मार्ग
फैटी एसिड <sup>13</sup>सी Isotopologue profiling Invertebrate उपभोक्ताओं के पौष्टिकता कार्बन हस्तांतरण और लिपिड चयापचय में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है
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Menzel, R., Nehring, R., Simsek, D., … More

Menzel, R., Nehring, R., Simsek, D., Ruess, L. Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers. J. Vis. Exp. (134), e57110, doi:10.3791/57110 (2018).

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