Summary
이 프로토콜 주변 혈액 및 혈 청/플라즈마 다운스트림 분석 단일 염기 다형성 (SNP) 평가 및 ELISA 분석 결과 등을 저장 하는 간단 하 고 유용한 방법을 설명 합니다.
Abstract
혈액 샘플 품질은 실시간 PCR 또는 ELISA 등 정확한 다운스트림 분석을 위해 중요 합니다. 생물 재료의 올바른 보관 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 결과 달성 하기 위해 출발점입니다. 모든 샘플 저장소 혈액 컬렉션에서 같은 방식으로 취급 한다. 수행을 분석에 따라 전체 혈액 및 혈 청 샘플 저장 되어야 한다-20 ° C 또는-80 ° C에서 사용까지. 혈액/혈 청 샘플을 피하기 위해 여러 동결-해 동 aliquoted 해야 합니다. 또 다른 중요 한 문제는 다른 한 실험실에서 운송 중 샘플 조건입니다. 드라이 아이스는 사용할 수 없습니다 또는 운송 몇 일 보다 더 오래 걸립니다, 대안 필요 합니다. 한 옵션 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하는 것입니다. 여기, 우리 혈액에 대 한 방법을 제안 및 활용 하는 혈 청 샘플 컬렉션 핏 자국 (DBS)을 건조 혈 청 반점 (DSS)를 건조. 우리는 실시간 PCR에 의해 몇몇 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 다운스트림 평가 위한 DBS에서 DNA를 추출 하는 절차를 개발 했다. 우리는 또한 DSS에서 eluted 단백질에서 시작 하는 ELISA 분석 결과 최적화. 이 메서드는 다른 ELISA 분석 실험 또는 단백질을 평가 하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
암 바이오 마커를 연구의 주요 목표는 새로운 생물 학적 진단, 예측 환자의 예 후 및 환자는 특정 치료에 응답 여부를 확인 하기 위해 사용할 수 있는 매개 변수 id입니다. 이 연구 분야는 혁신적인 암 치료의 발견에 대 한 기본 이며 맞춤형된 치료에 중요 한 역할.
바이오 마커 식별 및 유효성 검사의 각 단계 동안 수행 하는 절차는 안정적이 고 재현 되어야 합니다. 변환 연구의 성공 위한 초석 혈액 및 혈 청 등 생물 샘플의 올바른 스토리지입니다. 이것은 분자 생물학 실험 또는 단백질 분석 실험을 수행 하는 데 사용할 수 있는 고품질 생물 학적 자료를 얻기 향한 첫 번째 단계입니다.
강력한 데이터를 얻기 위해 충분 한 환자를 모집 하 되 연구 필요는 합니다. 모든 학회-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 또는 드라이 아이스에 다른 국제 센터에 샘플을 보낼 수 있습니다. 혈액 컬렉션에 대 한 필터 종이 사용 하 여 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 간단한 방법 이며 샘플1,2의 즉시 동결을 요구 하지 않는다. 종이, 건조 하룻밤 왼쪽 및 실내 온도1,2에서 최대 14 일 동안 저장 후에 한 방울의 혈액 또는 혈 청을 발견하실 수 있습니다. 이 연구원은 다른 실험실에 샘플을 보낼 시간을 제공 합니다. 말린된 피를 사용 하 여 명소 (DBS) 그리고 말린된 혈 청 반점 (DSS) 따라서 선진국과 개도국에서 기관 간의 협력을 단순화 수 있습니다.
사용의 용이성을 감안할 때, DBS 샘플링은 널리 이용 된다 분석 실험의 여러 종류에 serological 또는 유전 다운스트림 분석에 대 한. 예를 들어 과거에는, DBS 했다 자주 사용 에이즈 개발 도상국1,2,3,,45에 상영. 이 저장 방법의 또 다른 장점은 손가락-거 시기, 따라서 테스트 6,,78을 심사 하는 신생아에 대 한 그것의 사용에서 혈액 샘플을 수집할 수 있습니다. 쉬운 샘플 처리 및 전송은 특히 원격 사이트에서 수집 된 샘플에 대 한 DBS의 이점이 더 실험실 장비입니다. 이전 발행물에서 DBS와 DSS 백인, 아프리카 환자9시리즈에서 비타민 D와 비타민 D 의무적인 단백질 (DBP) 테스트를 사용 우리. 우리의 아프리카 동료 드라이 아이스를 얻을 수 있었다. 두 개의 소수 민족 인구 비타민 D 경로 차이 이해 하는 생물 학적 마커 비교, 우리는 추가 필터 종이 표준 조건 하에서 저장 된 샘플을 사용 하 여 프로시저 개선. DBS/DSS 절차를 최적화 한 후 우리는 DBP와 두 동료에 환자 혈 청의 비타민 D를 분석할 수 있었다. 우리는 또한 아프리카9DBS와 백인에 대 한 전체 혈액에서 DNA 추출 후 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp)의 수를 평가. 현재 프로토콜 고품질 혈액 샘플 ELISA 분석 실험 분자 생물학에서 배열 하는 다운스트림 분석의 종류를 영향을 주지 않고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 센터 시설 표준 저장 조건 없는 또는 사용 되 연구에서 생물 학적 자료를 관리 하는 것이 좋습니다. 다음 프로토콜 이러한 최적화 절차의 극치를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
말 초 혈액 및 혈 청 수집 하 고 건강 한 기증자와 환자는 연구에 참여를 서 면된 동의 준에서 저장 했다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. DBS에서 혈액 저장
-
혈액 샘플 컬렉션
- Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5.4 mg와 3 mL 튜브에 주변 혈액 샘플의 3 mL를 수집 합니다.
참고: 가능 한 한 빨리 DBS로 및 8 h 내 주변 혈액을 저장 합니다. - 보호기 카드의 하단 오른쪽 모서리에 환자 번호를 작성 합니다.
- 신중 하 게 혈액 5 mL 피 펫으로 resuspend.
- Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 5.4 mg와 3 mL 튜브에 주변 혈액 샘플의 3 mL를 수집 합니다.
-
DBS에 혈액
- 플라스틱 및 50-200 µ L 팁 보호기 카드 (자료 테이블)에 혈액 (50 µ L)의 한 자리를 전달.
- 1.2.1 단계를 반복 합니다. 총 3-5 핏 자국을 하십시오. 오래 된 팁 삭제 하 고 각 혈액에 대 한 새 aliquot.
- 오픈 비 흡수 성 표면에 직접적인 햇빛을 피하는 DBS는 수평 위치에 실 온에서 건조 하룻밤 둡니다. 보호기 카드의 표지 혈액 건조 촉진을 열어 둡니다.
참고: 어떤 미 립 자 공기 또는 먼지가 건조 단계에서 다운스트림 응용 프로그램 영향을 주지 않습니다. - 사용까지 방 습 제와 비닐 봉투에서 실내 온도에 카드를 저장 합니다.
2. DNA 추출 DNA 추출 킷 데이터 시트 (말린된 핏 자국에 대 한 단원)에 따라 DBS에서 시작
-
샘플 준비
- 카드에서 3 건된 핏 자국을 사용 합니다. 각 카드에서 말린된 혈액 명소 고 족집게로 카드에서 그들을 분리. 작은 조각 (약 1 m m의 직경)으로 분리 된 건된 핏 자국을 잘라.
- 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 작은 조각을 놓으십시오.
-
샘플 소화
- 세포의 용 해 버퍼 튜브 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 1의 180 µ L를 추가 합니다. 가수분해 공화국의 20 µ L을 추가 카드를 발견 하는 혈액과 1.5 mL 튜브에 pipetting 전에 성분 k 세포의 용 해 버퍼 1를 혼합 하지 마십시오. Vortexing에 의해 혼합.
- thermoincubator에 튜브를 배치 하 고 60 분 동안 56 ° C에서 품 어. 경우는 thermoincubator 갖춘 되지 않습니다 통, 소용돌이 샘플 마다 10-15 분 이상 10 s, 샘플의 온도 감소 하도록 하지 돌. 짧게 원심 관 뚜껑에서 방울을 제거 하.
-
세척 단계
- 200 µ L의 세포의 용 해 버퍼 2 (자료 테이블)와 10에 대 한 소용돌이 추가 s.
- Thermomixer 또는 온수 궤도 인큐베이터에 튜브를 놓고 10 분 동안 70 ° C에서 품 어. 경우는 thermoincubator 하지 통, 소용돌이 적어도 10 한 번 샘플 s, 샘플의 온도 감소 하도록 하지 돌.
- 2.3.1 단계를 반복 합니다. 1.5 mL 튜브에서 차입 열 (자료 테이블) lysate의 400 µ L를 전송. 1 분 동안 6000 x g 열 원심
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 차입 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.
- 6000 x g 1 분 동안에 500 µ L의 워시 버퍼 1 (자료 테이블) 및 원심 분리기를 추가 합니다.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.
- 6000 x g 1 분 동안에 500 µ L 워시 버퍼 2의 (테이블의 재료) 및 원심 분리기를 추가 합니다.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 열을 놓고 오래 된 하나를 삭제 합니다.
- 막 건조 3 분 20000 x g에서 원심.
-
차입 단계
- 새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 열을 놓고 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
- 막의 중심에 증류수의 장소 50 µ L. 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 원심에서 20000 x g 1 분 수집 튜브는 eluate를 막의 중심에 다시 넣습니다.
- 원심 분리기 튜브 20000 x g 에서 1 분에 대 한 폐기는 막.
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정 합니다.
- 사용까지-20 ° C에서의 저장소 DNA
참고: DBS에서 추출한 DNA 사용할 수 있습니다 SNP 평가 등 여러 가지 분석을 수행 하기 위해 실시간 PCR 또는 DNA 생어 시퀀싱에 의해.
3. 혈 청 스토리지 DSS에 대 한
-
혈액 샘플 컬렉션
- 7 mL EDTA 없이 7 mL 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다. 실 온에서 30 분 동안 응고 혈액 샘플을 둡니다.
- 보호기 카드의 하단 오른쪽 모서리에 환자 번호를 작성 합니다.
- 혈액 샘플을 실 온에서 15 분 동안 980 x g 에서 원심
참고: 가능 한 한 빨리 DSS로 및 8h 이내 혈 청을 저장 합니다. - 조심 스럽게는 상쾌한 튜브에서 제거 하 고 새로운 15 mL 튜브에 그것을 전송. 신중 하 게 혈액 5 mL 피 펫으로 resuspend.
-
DSS에서 야생 하는 혈 청
- 플라스틱 고 혈 청 (50 µ L) 보호기 카드에의 한 자리를 전송. 3-5 피 관광 명소의 총에이 단계를 반복 합니다.
참고: 각 자리에 혈 청의 정확히 50 µ L 플라스틱을 매우 주의 해야 합니다. 혈 청 하지 카드의 점선에서 넘어가 야 한다. - 하룻밤 실 온에서 건조 하는 DSS를 둡니다. 보호기 카드의 표지 혈액 건조 촉진을 열어 둡니다.
- 사용까지 방 습 제와 비닐 봉투에서 실내 온도에 카드를 저장 합니다. 저장은 14 일 이상,-20 ° c.에 카드를 저장
- 플라스틱 고 혈 청 (50 µ L) 보호기 카드에의 한 자리를 전송. 3-5 피 관광 명소의 총에이 단계를 반복 합니다.
4. ELISA 분석 결과 DSS에서 시작
-
DSS에서 단백질 elute
- 필요한 경우, 각 샘플에 대 한 DSS를 녹여. DSS (직경 약 1 m m) 작은 조각으로 잘라. PBS의 400 µ L 1.5 mL 튜브에 조각을 넣어.
- 4 ° c.에 하룻밤 샘플을 흔들어
참고: 낮은 강도에서 그들을 흔들어. PBS는 동요 하는 동안 튜브의 커버를 젖은 하지 한다.
- 적절 한 희석 후 ELISA 키트 지침에 따라 분 비 단백질/성장 요인 분석에 대 한 혈 청 샘플으로 단백질 eluate를 사용 합니다.
참고:이 절차 DBP 탐지9잘 작동합니다. 다른 ELISA 분석 실험에 대 한 최적화 단계를 필요할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 생물 학적 재료의 품질에 영향을 주지 않고 혈액 및 혈 청 실내 온도에서 저장 하 DBS 및 DSS 절차의 이용을 했다. 그림 1 단백질 카드 보호기 없이 혈액 및 혈액 수집 후의 예가 나와 있습니다. 확인 필터 종이에 저장 및 혈액을 elute 절차 샘플 품질 방해 하지 않습니다, 우리는 표준 저장 방법으로 비교를 수행 합니다. 우리는 프로토콜 섹션에서 보고 2 mL 튜브에 수집 또는 DBS로 저장 된 전 혈의 3 일치 샘플에서 DNA를 추출. 5 개의 Snp 실시간 PCR에 의해 분석 되었다. 데이터 일치 샘플에 대 한 얻은 100% 조화 된 했다.
ELISA 분석, 관련 우리 2 mL 튜브에 수집 된 혈 청의 8 샘플 저장 (그리고-80 ° C에서 즉시 저장) 및 DSS (-20 ° C에서 그리고 1 주 동안 실내 온도에 저장). 우리 eluted DSS에서 단백질 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 고 수행 ELISA 제조업체의 데이터 시트에 따르면 DBP 8 샘플에 대 한. 결과 표 1에 표시 됩니다. 2%에서 24%에 배열 했다 일치 샘플 사이의 편차 (CV)의 계수. 비 열 CV 9.6% 이었다입니다.
그림 1: 혈액 컬렉션 전후 DBS의 예. (A) 단백질 절약 카드. (B) 단백질 절약 카드 혈액 샘플링 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| DBP (µ g/mL) | |||
| 샘플 | 혈 청 (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
표 1: 일치 DSS 및 혈 청 샘플 DPB 수준. DBP 수준 ELISA 분석 결과 분석입니다. 이력서 2 획득 값 계산 변형 계수입니다. CV 백분율은 다음과 같이 계산 됩니다: ((DSS value-Serum value)/DSS 값) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 실험실 직원 또는 혈액 샘플의 정확한 처리를 위해 필요한 인프라 없는 경우 필터 종이에 혈액 및 혈 청을 저장 하기 위한 잠재력을 조사 합니다. 특히, 전체 혈액 또는 혈 청 표준 튜브 또는 손가락 찌 르 기에 의해 수집 된이 메서드를 사용 하 여 저장할 수 있습니다 그리고 혈액 컬렉션 직후-20 ° C 또는-80 ° C에서 샘플을 동결 필요가 없습니다. DBS/DSS/혈 무결성에 어떤 변화 없이 최대 14 일 동안 실내 온도에 유지 수 있습니다. 저장소에 대 한 중요 한 문제가 온도 보다 더 많은 생물 학적 재료의 특성에 영향을 미치는 수 분의 존재 이다. 방 습 제와 함께 비닐 봉지를 사용 하 여이 문제를 방지할 수 있습니다. 카드 비닐 봉지 안에 수 분이 저장 동안 문제가 된다. 미 립 자 공기/방울/먼지 또는 습기에서에서 발생 하는 문제 되지 야간 보육10동안 관찰 되었다. 우리는 이전 사용 필터 종이를 이탈리아와 아프리카 동료11생물 학적 마커 연구에 혈액 및 혈 청을 저장할. 우리는 DNA 추출 DBS에서 최적화 하 고 두 케이스 시리즈에 있는 Snp의 수를 분석. 우리는 또한 단백질 수준 평가에 관심이, 우리 ELISA 분석 실험을 수행 하려면 DSS에서 단백질을 elute 방법을 최적화. 애 란에 대 한 DSS에 혈 청 저장은 실험실 연구원 플라스틱 정확 하 게 모든 샘플에서 혈 청의 동일한 금액을 해야 하기 때문에 질적 분석에 대 한 전체 혈액 저장소 보다 더 섬세 한. Pipetting 정확 하지 않으면, 다운스트림 분석 손상 될 것 이다. DNA 추출 절차는 다른 분자 분석에 적용할 수 있습니다, 하는 동안 단백질 절차 조사 각 새로운 cytokine/분 비 요소에 대 한 일치 샘플에 최적화 되어야 합니다. DSS 매우 작은 조각으로 잘라 하 고 효율적인 단백질 차입 되도록 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 철저 하 게 PBS 가진 카드의 조각을 젖은 중요 하다. 이 혈액 차입 보다 더 섬세 한 단계 ELISA는 양적 평가 때문입니다.
최근 몇 년 동안,이 저장소 접근은 분자 생물학에서 단백질 분석12,13(로이 프로토콜에서 설명)에 이르기까지 서로 다른 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 특히, 보호기 카드에서 발견 하는 혈 청에서 시작 하는 대량 결과 되었습니다 좋은 품질 보고14, 높은 유연성과 방법의 신뢰성을 확인 합니다.
문학, 동의 우리의 결과 DB로 저장 하는 샘플의 유용성을 강조 하 고 표준 저장 방법에 대해이 절차의 안정성을 확인. 우리는 이전 결과 확인 하 고 우리의 저장 방법과 함께 그것을 사용 하 여 ELISA 분석 결과 최적화의 가능성을 밑줄. 단순, 덕분에 개발 도상국 암 연구에도 기여할 수 있다. 예를 들어 아프리카에 대 한 연구의 대부분은 아프리카계 미국인에 수행 됩니다, 거의 데이터 기본 아프리카9에 사용할 수 있습니다. DBS 사용 하 여가 간격을 도울 수 있었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 편집에 Gráinne Tierney를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
