Summary
介绍了一种小鼠胰岛外移植的方法。分离的胰岛与水凝胶混合, 混合物放入糖尿病小鼠的小袋中。然后对血糖进行监测, 并进行免疫组织化学分析。
Abstract
胰岛移植已被提出为1型糖尿病的潜在治疗方法。最近令人信服的证据表明, 血管内胰岛输注远不理想, 因此, 动量正在重新成为胰岛移植的潜在有价值的部位。这个实验需要隔离高质量的胰岛和植入胰岛的糖尿病患者。移植到动量需要手术步骤, 可以更好地显示视觉。在此, 将介绍此过程的详细步骤。本文介绍了将分离的胰岛与水凝胶混合后再将其放入糖尿病小鼠的小袋中的两种方法。不同的条件下使用不同的水凝胶。对糖尿病小鼠共症胰岛患者的血糖水平进行了长达35天的监测。一些动物在14天后被牺牲进行免疫组织化学分析。这种临床移植前的方法可以作为初步数据, 导致转化为临床移植。
Introduction
根据国际糖尿病联合会 (idf) 的数据, 糖尿病目前影响到3.82亿人, 预计到 2035将增加到5.92亿人。在异基因和异基因胰岛移植中, 全身免疫抑制治疗是必要的。如果没有免疫抑制, 免疫排斥是移植物丢失的主要原因2。由于即时血液介导的炎症反应 (ibmir)3,4, 也存在移植胰岛丢失的重大问题。然而, 即使在没有免疫反应的情况下, 如在联合或自动移植模型中, 通过门静脉移植到肝脏的胰岛细胞也会因为炎症和/或血液不好等不利的环境条件而丢失提供较低的氧合和/或营养成分5,6。因此, 为了确保长期的代谢功能, 更高的胰岛数量是必要的, 以补偿最初的细胞丢失, 减少雕刻 7.
为了优化胰岛雕刻, 一些替代解剖位点已经进行了实验和临床研究, 有希望, 但不是明确的结果8。而一些替代部位提供了方便和安全的通道 (如皮肤、肾囊、胃黏膜下和眼睛前房) 或更宽的表面, 用于较大的胰岛肿块 (如腹腔)、生存和生理移植小岛的代谢表现仍然有限, 仍然是一个令人关切的问题。目前正在寻找一个更适合胰岛雕刻的地点。
在胰岛移植的早期发展中, 它是许多解剖部位之一, 并被证明是一个成功的小岛环境10,11,12, 13, 14岁然而, 在动物模型6中, 静脉内胰岛输液成为临床选择, 部分原因是手术相对简单, 早期成功.另外, 在一定程度上, 与这个网站相关的底片, 特别是大量的早期胰岛丢失, 在实验胰岛移植的早期随着领域的成熟而不太被理解和约束。最近有令人信服的证据表明, 血管内胰岛输注远不理想, 因此, 动量正在重新成为细胞移植的潜在有价值的部位。
动量 (以主动袋的形式) 比肝脏提供相对优势 15,16。它是良好的血管化和易于访问。它允许回收移植 (如有必要) 和/或活检。与肝脏相比, 胰岛经历的缺血期减少, 可以接受相对较大的胰岛质量, 这是不可能的, 在那里门静脉压力的上升会引起并发症。
在研究中测试的程序中使用了一个联合小鼠移植模型, 使用 c57bl6 雄性小鼠, 体重 20-25 g. 胰岛受者只需注射一次链霉素, 剂量为250mg/kg ip。如果小鼠的血糖水平在注射后超过 24 mmomol.48 小时, 并且在至少5天的时间内保持在该水平以上, 则糖尿病的诱导可以被认为是成功的。
按照先前公布的方法, 采用了一些修改方法, 从年龄匹配的捐献者的胰腺中分离出了合基因胰岛。简而言之, 胶原酶被注射到胆囊而不是胆管。这样做是为了方便注射。胶原酶输注后, 进行孵育、组织破坏、密度梯度分离和人工采摘, 以获得纯胰岛。在 37°c t175 瓶中, 在移植前95% 的空气-5% co 2 中, 在 cmrl-1066 培养基中隔夜培养胰岛, 辅以10% 的热灭活胎牛血清 (fbs )。
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Protocol
本研究中使用的所有小鼠均从广东省医学动物中心获得。按照动物福利的原则, 由深圳第二人民医院伦理审查委员会批准使用动物。
1. 向奥门图姆的胰岛移植
注: 此协议需要2个人完成。
- 组装表1中列出的外科材料。用无菌材料 (如窗帘和一次性用品) 准备手术区域的无菌场, 并在整个手术过程中保持无菌状态。消毒所有手术器械。穿无菌长袍。
- 在立体显微镜下使用200μl 移液器尖端选择小岛。每只老鼠将获得每株 tansplant 450-500 个等值 (ieq)。对于每种动物, 放置足够的胰岛, 以便将其一次性移植到无菌 1.5 ml 的卡皮顶管中, 并提供100μl 的 cmrl-1066 培养基。
注: 胰岛可以在移植当天进行隔离, 但最好在前一天进行隔离, 以便恢复隔离过程。 - 将顶部的管与小岛放在冰上, 直到准备移植。
- 将基底膜基质水凝胶从-20°c 的冷冻机中取出后, 将其解冻并保持在冰上。水凝胶在4°c 至10°c 时是液态的, 在较高的温度下凝固。
- 称重和标记所有糖尿病受体小鼠。腹腔注射 60 mg/kg 戊巴比妥钠。通过使用脚趾夹紧来测试麻醉的深度。如果动物对夹紧有反应, 再给 10 mg/kg 的戊巴比妥钠。如果没有撤销反射, 手术的麻醉水平是正确的。
- 用70% 乙醇擦拭腹部的手术部位。用剃须刀片将头发从现场刮掉, 并用碘油消毒该部位。在麻醉下对眼睛涂上兽医软膏, 以防止干燥。
- 使用眼用剪刀打开腹部沿腹部中线的切口为4至5厘米. 将肠道向左移动, 用盐水浸透的纱布覆盖, 以防止手术过程中过度脱水。
- 使用棉签充分暴露胃的视野, 并定位动量 (位于胃下方)。使用两对细钳来扩张膜。注意防止损坏撕裂。
- 在这一点上, 水凝胶被完全解冻了。将管与小岛一起旋转 30秒, 以 200 x 克的速度旋转, 并取出上清液。吸吸50μl 的水凝胶, 将其添加到含有小岛的管中, 并轻轻地重新悬浮混合物, 避免气泡的形成。在手术过程中, 把管子放在冰上。
- 使用两对钳子拿起动量的边缘, 轻轻地提高它, 形成胃壁和肠道之间的凹槽, 可以容纳小体积的液体与胰岛移植。
- 让第二人协助的程序, 并吸气重新悬浮的胰岛水凝胶混合物 (整个内容的管) 与200μl 移液器尖端, 将内容传递到凹槽。
- 通过轻轻提升或降低孔的边缘, 确保混合物处于良好的凹槽中。在水凝胶凝固前3分钟内完成混合物的定位, 以影响体温。在水凝胶集合后, 折叠动量覆盖接枝。
注: 当水凝胶凝固时, 动量会粘附在周围的胃壁上。 - 水凝胶完全凝固后, 用棉签将肠道重新定位回腹腔, 注意不要接触移植部位。
- 将20μl 头孢菌素 (5 ~ 10 毫克) 添加到腹腔, 以防止感染, 然后使用4-0 缝合关闭腹部。
- 将鼠标返回到其保持架, 并为每个鼠标收件人重复所有步骤。保持老鼠的温暖和视觉监测, 直到他们完全恢复足够的意识, 以保持胸骨的清醒。将老鼠与其他动物分开, 直到它们完全恢复。
- 在一周的手术后预防中, 每天注入50μl 的头孢唑啉钠 (0.05 mg/ml)。在伤口夹置之前, 局部在切口部位涂抹1-3 滴0.25% 的布皮维卡因。通过腹腔内 (ip) 路线 Buprenorphine(0.03 无菌0.9% 盐水, 0.05-10 mg kg) 进行管理。
- 在移植后每天使用一次血糖仪测量尾静脉血液样本中的非空腹血糖水平。当移植到动量时, 胰岛移植可能有延迟的功能, 2-3周内没有达到完全正常的血糖水平。
- 对于组织学, 在移植后的实验结束时, 从小鼠身上取出骨髓移植。根据组织学协议修复组织。移植物可以进行分析, 用于免疫染色或免疫荧光研究。
2. 向骨髓移植的替代方法
注: 在室温下使用的另一种纤维蛋白凝血酶水凝胶可替代基底膜基质水凝胶。它由2个组分组成, 一种是纤维蛋白封口蛋白溶液 (50 u/ml 凝血酶和 10 mg/ml 纤维蛋白原)。当组件混合时, 它们形成一个凝块, 将小岛固定在适当的位置。
- 在室温下使用纤维蛋白-丁丁水凝胶化合物。与步骤1.2 中一样, 每只小鼠每次移植将获得450-500 个胰岛等价物 (ieq)。将胰岛放置在无菌 1.5 ml 的快照顶管中, 并采用100μl 的 cmrl-1066 培养基。在移植之前, 将胰岛吸入无菌的 pe50 管中, 长度为10厘米, 然后轻轻离心 (在 200 x g 处的 30秒), 形成一个松散的颗粒。
- 准备上述动物 (步骤 1.5-1.8), 并展开动量。将水凝胶组分 (各 10μl/) 混合, 放在动量上。(图 3d)
- 立即将小岛从油管中排出到水凝胶上。水凝胶在小岛周围形成血块。(图 3 e)
- 将动量折叠在水凝胶和胰岛上形成一个袋子。(图 3 f)继续执行步骤1.13 至1.13。
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Representative Results
胰腺的消化后状态如图 1a 所示。纯化的胰岛如图 1 b所示。小岛的二氧化氮染色和可行性测试如图 2所示。胰岛移植到动量的主要步骤如图 3所示。结果图4显示了接受者的血糖水平。移植物的组织学分析如图 5所示。
图 1: 胰腺消化和胰岛隔离.(a) 消化后的胰腺。注意悬浮液中的沙粒。(b) 隔离后小岛的光学显微镜图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 胰岛二硫酮染色和荧光活力染料.(a) 小岛被二硫酮染成红色。(b) 光学显微镜。(c) 碘化丙酯荧光红染色 (死细胞)。(d) 钙素-am 绿色染色 (活细胞)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在动量移植.(a) 接受者开腹手术后, 胃暴露, 并确定动量。 (b) 胰岛混合在水凝胶中, 慢慢地放置在口腔组织上。(c) 具有较高放大倍率的胰岛移植物。水凝胶是一种半凝固状态。(d) 替代方法。水凝胶被放置在没有小岛的动量上.(e) 小岛被放置在水凝胶的顶部。(f) 动量折叠在小岛周围。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 移植后血糖水平.接受者的非空腹血糖水平 (n = 7), 移植后35天。移植受者并不都收到同一批小岛, 因此在质量和功能上存在差异, 导致血糖水平大幅波动。
图 5: 组织学.移植切片 (移植后14天的移植物回收) 被 dapi (细胞核)、抗小鼠胰岛素抗体和血红素染色。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
胰岛移植到肝脏通过门静脉是最常用的方法, 在人类胰岛移植, 但仍然存在效率和安全问题, 如门静脉血栓形成和肝脂肪变性 17.最近的研究表明, 动量可能是肝脏的合适替代品, 但更多的研究需要在临床翻译12,14,18,19之前进行。
小鼠是一个合适的模型, 测试作为胰岛移植的地点。在鼠标中, 动量位于胃壁下, 一般折叠。然而, 小鼠的动量大小很小, 而且很有挑战性。为了将其用于移植, 有必要轻轻地将其展开到其完整的大小, 然后在胰岛/水凝胶混合物沉积后将其折叠起来。在较大的动物中, 口腔组织更广泛, 可以缝合, 以构建一个或多个小岛沉积在其中的袋子。小鼠的动量是脆弱的, 不容易接受缝合而不打破。出于这个原因, 水凝胶被用来使袋没有缝合。
在第一种方法 (步骤 1.1-1.18) 中, 所使用的水凝胶是基底膜基质, 由层压蛋白、胶原蛋白 iv 和生长因子组成。当它变暖到体温时, 它就会凝固。在第二种方法 (步骤 2.1-2.4) 中, 使用了由 50 uml 凝血酶和 10 mgml 纤维蛋白原组成的不同的水凝胶。两种不同的水凝胶被用来展示这项技术的多功能性。它可以根据许多情况加以调整, 并确立原则证明。对于临床应用, 无论是缝合袋还是临床级水凝胶, 该技术都可以与微创方法相结合 (例如, 内窥镜传递到动量)。为此, 需要使用更大的哺乳动物临床前模型进行更多的研究。
在我们以及其他研究中, 小鼠移植后血糖水平正常化的时间表明, 动量中的胰岛需要稍长的时间才能实现足够的胰岛素生产。正如研究报告所概述的那样, 再血管化效率似乎是一个重要因素。水凝胶的存在是否会影响胰岛血运重建的速度和性能, 这一点还有待确定。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作的一些作者得到了中国国家重点研发 & 项目 (2017YFC1103704)、深圳三明医学项目 (szsm2014122020)、深圳高级医疗学科建设基金 (20160163838) 的部分资助,深圳科技基金会 (JCJY20160229204849975, gjhz20170131712556, jcypy6042511010658), 深圳卫生与计划生育基金会 (szxj20170921)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
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