Summary
Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.
Abstract
Trasplante de islotes pancreáticos se ha propuesto ser un potencial tratamiento para la diabetes tipo 1. Reciente evidencia convincente indica que infusión intravascular del islote está lejos de ser ideal y por lo tanto, el epiplón es reapareciendo como un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes pancreáticos. Este experimento requiere el aislamiento de islotes de alta calidad y la implantación de los islotes a los destinatarios diabéticos. Trasplante para el epiplón requiere pasos quirúrgicos que pueden demostrarse mejor visualmente. Aquí, se presentan los pasos detallados para este procedimiento. Aquí se describen dos métodos de mezcla de los islotes aislados con hidrogel antes de colocar la mezcla en la bolsa omental de ratones diabéticos. Diferentes hidrogeles se utilizan para las diferentes condiciones. Niveles de glucosa en sangre de los receptores de ratón diabético de syngeneic islotes en el epiplón fueron monitoreados durante 35 días. Algunos animales fueron sacrificados después de 14 días para realizar el análisis inmuno-histoquímico. Este enfoque preclínicos de trasplante puede utilizarse como datos preliminares previos a la traducción a un trasplante clínico.
Introduction
Según la Federación Internacional de Diabetes (FID), mellitus de la diabetes afecta actualmente a 382 millones de personas, con un aumento proyectado a 592 millones personas en 20351. En ambos trasplante allogeneic y xenogeneicos islote, terapia inmunosupresora sistémica es necesaria. Sin inmunosupresión, rechazo inmune es una causa importante de pérdida de injerto2. También es un problema importante de pérdida de islotes trasplantados debido a la sangre inmediata mediada por reacción inflamatoria (IBMIR)3,4. Sin embargo, incluso en la ausencia de una respuesta inmune como syngeneic o modelos de auto-trasplante, las células del islote transplantadas en el hígado vía la vena porta se pierden debido a inflamación o a condiciones ambientales desfavorables, tales como sangre pobre de la fuente con menor oxigenación y nutrientes5,6. Como resultado, para garantizar la función metabólica a largo plazo, son necesarios para compensar la pérdida celular inicial que reduce el engraftment7números más altos de la isla.
En un intento por optimizar el engraftment de islote, varios sitios anatómicos alternativos han sido investigados experimentalmente como clínicamente, con prometedores, aún no definitivo resultados8. Mientras que algunos de los sitios alternativos ofrecen un acceso fácil y seguro (e.g., piel, cápsula renal, submucosa gástrica y cámara anterior del ojo) o una superficie más amplia para grandes masas de islote (e.g., cavidad peritoneal), supervivencia y fisiológicas rendimiento metabólico de los islotes trasplantados son todavía limitado y siguen siendo una preocupación9. La búsqueda de un lugar más adecuado para el engraftment del islote está en curso.
El epiplón fue uno de los muchos sitios anatómicos que fueron investigados en el desarrollo temprano del trasplante de islotes pancreáticos y probó un ambiente exitoso para islotes10,11,12,13, 14. Sin embargo, infusión intraportal islote se convirtió en el clínico opción debido en parte a la relativa simplicidad del procedimiento y modelos de éxito temprano en animales6. También, en parte, los negativos asociados con este sitio, particularmente masiva pérdida temprana de la isla, fueron menos restringir comprendido y menos en los primeros días del trasplante de islotes experimental como el campo madurado. Más reciente evidencia convincente que indica que la infusión intravascular del islote está lejos de ideal, el epiplón es reapareciendo como un sitio potencialmente valioso para la célula.
El epiplón (bajo la forma de una bolsa omental) ofrece ventajas relativas sobre el hígado15,16. Es fácilmente accesible y bien vascularizado. Permite la recuperación del injerto (si es necesario) o biopsia. El período isquémico experimentado por los islotes es reducido en comparación con el hígado, y el epiplón puede aceptar relativamente las masas gran islote que no es posible intraportally, donde un aumento de la presión portal pueden causar complicaciones.
Se utilizó un modelo de ratón syngeneic de trasplante en el protocolo de prueba en el estudio, emplear ratones machos C57BL/6 entre 6-8 semanas de edad con un peso de 20 a 25 beneficiarios del islote de g. fueron despojados de diabéticos con una sola inyección del streptozotocin con una dosis de 250 mg/kg ip. La inducción de la diabetes puede considerarse exitoso si el nivel de glucosa de la sangre del ratón es mayor de 24 mmol/L 48 h después de la inyección y se mantiene por encima de ese nivel durante un mínimo de 5 días.
Syngeneic islotes fueron aislados de páncreas de donantes pareados por edad siguiendo métodos previamente publicados con algunas modificaciones. En Resumen, la colagenasa fue inyectado en la vejiga de rozadura en lugar de la vía biliar. Esto fue hecha como una mejora para facilitar la facilidad de inyección. Infusión de colagenasa fue seguido por incubación, interrupción de tejido, separación de gradiente de densidad y selección de mano para obtener puros islotes. Islotes fueron cultivados durante la noche en CMRL 1066 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en T175 frascos a 37 ° C, bajo 95% aire - 5% CO2 antes del trasplante.
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Protocol
Todos los ratones utilizados en este estudio se obtuvieron en el Animal Medical Center de Guangdong Provincia. El uso de los animales fue aprobado por Hospital de la ética informe Comité de Shenzhen segunda personas, conforme a los principios del bienestar animal.
1. islote trasplante para el epiplón
Nota: Este protocolo requiere 2 personas para llevar a cabo.
- Ensamble de materiales quirúrgicos que se enumeran en la tabla 1. Preparar campo aséptico en área con material estéril, tales como cortinas y materiales desechables y mantener condiciones de asepsia en cirugía. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos. Usar batas estériles.
- Escoge los islotes usando una punta de pipeta de 200 μL bajo el estereomicroscopio. Cada ratón recibirá 450 – 500 islote equivalente (IEQ) por tansplant. Para cada animal, coloque suficiente islotes para un trasplante solo en un tubo de 1,5 mL estéril snap-top con 100 μl de medio CMRL 1066.
Nota: Islotes pueden ser aislados en el día del trasplante, pero es mejor aislarlos del día anterior para permitir la recuperación para el proceso de aislamiento. - Mantenga los tubos de la encajar a presión-tapa con islotes de hielo hasta el momento del trasplante.
- Descongelar el hidrogel de matriz de la membrana del sótano y mantenerlo en hielo después de haberlo sacado del congelador de-20 ° C. El hidrogel es líquido a 4 ° C a 10 ° C y se solidifica en temperaturas más altas.
- Pesar y etiquetar todos los ratones receptores diabéticos. Inyectar el pentobarbital sódico de 60 mg/kg por vía intraperitoneal. Prueba de la profundidad de la anestesia mediante la administración de un pellizco del dedo del pie. Dar un sodio de pentobarbital de 10 mg/kg adicionales si el animal reacciona a la pizca. Caso de no retirar el reflejo, el nivel de anestesia es correcto para la cirugía.
- Limpiar el sitio quirúrgico en el abdomen con etanol al 70%. Afeitarse el cabello desde el sitio con una hoja de razer y desinfectar la zona con yodoforo. Administrar veterinario ungüento para los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
- Utilice las tijeras oftálmicas para abrir el abdomen a lo largo de la línea media del abdomen con una incisión de 4 a 5 cm. mover los intestinos al lado izquierdo y cubrir con una gasa empapada solución salina para evitar la deshidratación excesiva durante el procedimiento de la cirugía.
- Usar hisopos de algodón totalmente exponer el campo visual del estómago y localizar el epiplón (ubicado debajo del estómago). Usar dos pares de Pinzas finas para dilatar el epiplón. Tenga cuidado para evitar que se desgarre.
- El hidrogel se descongele completamente en este punto. Girar el tubo con los islotes de 30 s a 200 x g y eliminar el sobrenadante. Aspire 50 μl del hidrogel, añada al tubo que contiene los islotes y agite la mezcla suavemente evitando la formación de burbujas. Mantener los tubos en hielo durante el procedimiento.
- Usar dos pares de pinzas para coger los bordes del epiplón y levantarlo suavemente para formar una ranura entre la pared gástrica y los intestinos que pueden alojar un volumen pequeño de líquido con el injerto del islote.
- Que la segunda persona ayuda en el procedimiento y aspirar la mezcla resuspendidos islote-hidrogel (todo el contenido del tubo) con una pipeta de 200 μL, entregar el contenido en la ranura.
- Asegúrese de que la mezcla está bien posicionada en la ranura suavemente levantando o bajando los bordes del epiplón. Completo de colocación de la mezcla en 3 minutos antes el hidrogel se solidifica como un efecto de la temperatura corporal. Después de establece el hidrogel, doblar el epiplón para cubrir el injerto.
Nota: el epiplón se adhiere a la pared gástrica circundante como el hidrogel se solidifica. - Después el hidrogel está completamente solidificado, utilizar bastoncillos de algodón para colocar de nuevo los intestinos hacia la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no para tocar el sitio de trasplante.
- Añadir 20 μl de cefalosporina (5 ~ 10 mg) en la cavidad abdominal para prevenir la infección, entonces utilice sutura 4-0 para cerrar el abdomen.
- Retomar el ratón de su jaula y repita todos los pasos para cada destinatario de ratón. Mantener los ratones caliente y observe hasta que recuperar completamente la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Mantener los ratones aparte de otros animales hasta que han recuperado plenamente.
- Inyectar 50 μl de Cefazolina sódica (0,05 mg/mL) cada día durante una semana como profilaxis después de la cirugía. Administrar Bupivicaine + buprenorfina, es decir, aplicar 1-3 gotas de 0.25% Bupivicaine en el sitio de incisión por vía tópica antes de la colocación de clips de la herida. Administrar Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) por vía la intraperitoneal (IP).
- Medir el nivel de glucosa en sangre no ayuno de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un medidor de glucosa en sangre una vez al día después del trasplante. Cuando trasplantar en el epiplón, el injerto de islote puede tienen una función de retraso y no llegar a un nivel de glucosa en sangre completamente normal durante 2 – 3 semanas.
- Histología, saque el injerto omental el ratón al final del experimento después del trasplante. Fijar el tejido según los protocolos histológicos. El injerto puede ser analizado para estudios immunostaining o inmunofluorescencia.
2. otro método para el trasplante al epiplón
Nota: Se puede sustituir un hidrogel de fibrina-trombina alternativo que se utiliza a temperatura ambiente para el hidrogel de matriz de la membrana del sótano. Consta de 2 componentes, una solución de proteína de sellador de fibrina (50 U/mL trombina y fibrinógeno 10 mg/mL). Cuando los componentes se mezclan, forman un coágulo que mantiene los islotes en su lugar.
- Utilizar el fibrina thombin hidrogel compuesto a temperatura ambiente. Como en el paso 1.2, cada ratón recibirá equivalentes del islote de 450 – 500 (IEQ) por trasplante. Coloque los islotes en un tubo de 1,5 mL estéril snap-top con 100 μl de medio CMRL 1066. Inmediatamente antes del trasplante, aspirar los islotes en un tubo estéril de PE50 para una longitud de 10 cm y centrifugar suavemente (30 s a 200 x g) para formar un pellet suelto.
- Preparar el animal como se indicó anteriormente (pasos 1.5-1.8) con el epiplón repartido. Mezclar los componentes de hidrogel (10 μl/cada uno) y en el epiplón. (Figura 3D)
- Expulsar inmediatamente a los islotes de la tubería en el hidrogel. El hidrogel forma un coágulo alrededor de los islotes. (Figura 3E)
- Doblar el epiplón sobre el hidrogel y los islotes para formar una bolsa. (Figura 3F) Continuar con medidas de 1.13 a 1.18.
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Representative Results
Post-Digestive estado del páncreas se muestra en la figura 1A. Purificada islotes se muestran en la figura 1B. Tinción de ditizona y pruebas de viabilidad de los islotes se muestran en la figura 2. Los pasos principales del trasplante de islotes pancreáticos en el epiplón se muestran en la figura 3. Los niveles de glucosa de la sangre de los recipientes después del trasplante omental se muestran en la figura 4. El análisis histológico de los injertos se muestra en la figura 5.
Figura 1 : Aislamiento de digestión y de islotes de páncreas. (A) del páncreas en la digestión. Tenga en cuenta las partículas tamaño arena en suspensión. (B) imagen de la microscopia ligera de los islotes después de aislamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Tintes de viabilidad de ditizona coloración y fluorescencia de islote. (A) islotes se tiñen en rojo por ditizona. (B) la microscopia ligera. (C) roja de fluorescencia de propidio tinción (células muertas). (D) calceína-AM verde tinción (células viables). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Trasplante en el epiplón. (A) después de la laparotomía del destinataria, se expone el estómago y el epiplón situado. Islotes (B) se mezclan en hidrogel y coloca lentamente en el tejido omental. (C) islote del injerto en mayor aumento. El hidrogel es un estado semi solidificado. (D) método alternativo. Hidrogel se coloca en el epiplón sin islotes. Islotes (E) se colocan sobre el hidrogel. (F) el epiplón se dobla alrededor de los islotes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Trasplante posterior de niveles de glucosa de sangre. Niveles de glucosa de la sangre no ayuno de destinatarios (n = 7) hasta 35 días después del trasplante. Los receptores de injerto no todos recibieron el mismo lote de islotes por lo que existen diferencias en la calidad y la función dando lugar a grandes fluctuaciones en el nivel de glucosa en sangre.
Figura 5 : Histología. Secciones del injerto (injerto recuperación de 14 días después del trasplante) fueron teñidas con DAPI (núcleos), anticuerpos de anti-ratón insulina y hematoxilina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El trasplante de islote al hígado vía la vena porta es el más de uso general método de trasplante de islotes pancreáticos en humanos, pero todavía hay preocupaciones de eficacia y seguridad como vena porta trombosis y hígado esteatosis17. Estudios recientes muestran que el epiplón puede ser una alternativa adecuada para el hígado, pero necesita más investigación para llevarse a cabo antes de la traducción clínica12,14,18,19.
El ratón es un modelo conveniente para probar el epiplón como un sitio para el trasplante de islotes pancreáticos. En el ratón, el epiplón se encuentra en la pared del estómago y se dobla generalmente. Sin embargo, el tamaño del epiplón en ratones es pequeño y difícil acceso. Con el fin de usarlo para el trasplante, es necesario suavemente extendió a su tamaño completo después plegar después se deposita la mezcla de islotes/hidrogel. En un animal más grande, el tejido omental es más extenso y puede ser suturado para construir una o más bolsas en las que se depositan los islotes. El epiplón de ratón es frágil y no acepta fácilmente las suturas sin romperse. Por esta razón, un hidrogel se utiliza para hacer la bolsa sin suturas.
En el primer método (pasos 1.1 – 1,18), el hidrogel utilizado es una matriz de la membrana basal y se compone de laminina, colágeno IV y factores de crecimiento. Se solidifica como calienta a la temperatura corporal. En el segundo método (pasos 2.1 – 2.4), se utiliza un hidrogel diferentes compuesto de 50U/mL trombina y fibrinógeno 10 mg/mL. Dos diferentes hidrogeles se usan para mostrar la versatilidad de esta técnica. Se puede adaptar para adaptarse a muchas circunstancias y para establecer la prueba del principio. Para aplicaciones clínicas, si se utiliza una bolsa suturada o un hidrogel grado clínico, la técnica puede ser combinada con un acercamiento como mínimo invasor, (por ej., un método endoscópico de entrega del epiplón). Para ello, se requieren estudios adicionales utilizando modelos preclínicos de mamíferos más grandes.
El tiempo para normalizar los niveles de glucosa de la sangre en los recipientes del ratón después del trasplante en el epiplón en los nuestros, así como otros estudios sugieren que los islotes en el epiplón requieren un poco más tiempo para lograr la producción suficiente de insulina. Eficacia de la revascularización parece ser un factor importante, como se indica en el estudio. Si la presencia de un hidrogel afecta la velocidad de la revascularización del islote y rendimiento, queda por determinarse.
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Disclosures
Los autores no divulgan conflictos de interés.
Acknowledgments
Algunos de los autores de este trabajo fueron apoyadas en parte por subvenciones de nacional clave de R & D programa de China (2017YFC1103704), proyecto de Sanming de medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el alto nivel médico disciplina construcción de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fundación de ciencia y tecnología (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fundación de Shenzhen de la Comisión de salud y planificación familiar (SZXJ2017021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200 μL Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5 mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
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