プラナリアSchmidtea メディテラネアは、幹細胞と組織再生を研究するための優れたモデルです。この文書では、化学のアジに動物を公開することによって 1 つの器官、咽頭を選択的に削除する方法について説明します。このプロトコルはまた咽頭再生を監視する方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
プラナリアは、扁形動物の非常に効率的な再生です。彼らは、任意のタイプの傷害に即応できる幹細胞の数が多いこの能力を借りています。これらの動物の共通の傷害モデルは、複数の臓器に損傷組織の大量を削除します。この広範な組織の損傷を克服するために我々 はSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭、一つの臓器を選択的に削除する方法をここで説明します。我々 はチトクロム酸化酵素阻害剤アジ化ナトリウムを含む溶液に浸漬の動物によってこれを達成します。アジ化ナトリウムを簡単に暴露により咽頭の押出成形、「化学的切断」と呼ばれる動物から化学切断全体の咽頭を削除し、咽頭が腸へアタッチ小さな傷を生成します。広範な洗浄後は、すべての切断された動物は、約 1 週間で咽頭が完全に機能を再生成します。体の残りの部分の幹細胞は、新しい咽頭の再生を駆動します。ここで、詳細な提供化学切断のプロトコルおよび成功の切断と再生を評価する組織と行動の両方の方法について説明します。
概要
再生は、再生能力ある無脊椎動物の完全なボディ再生から脊椎動物1のより制限された能力に至るまで動物界全体が発生する現象です。機能的な組織の交換は複雑なプロセスであり、種類の細胞の同時復元をしばしば伴います。たとえば、サンショウウオの四肢、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞、筋肉とする上皮細胞に必要なを再生成するには、2を置き換えられます。これらの細胞が新たに生成された型はまた新しい下肢の機能を容易にするために適切に編成する必要があります。これらの複雑なプロセスを理解すると、特定の細胞のタイプおよび器官への統合の再生に焦点を当てる技術が必要です。
再生反応に関する研究を簡素化する採用戦略は、いずれかの特定の細胞型のターゲットの切除や組織の大規模な収集があります。たとえば、ゼブラフィッシュ、特定の細胞型でニトロの式はメトロニダゾールの3、4を適用した後彼らの破壊に します。ショウジョウバエ幼虫の組織特異的発現プロモーター下プロ アポトーシス遺伝子を表現するには成虫ディスク5,6の特定の領域を切除できることは選択的に。両方これらの戦略の急速な制御....
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プロトコル
1. 準備
-
プラナリア水の準備17
- 1 X Montjuïc 塩溶液でプラナリアを維持します。水をプラナリアを準備するには、個々 の在庫ソリューション 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2の 1 M の KCl と純水で 5 M の NaCl を確認します。0.2 μ m ボトル上部フィルターの長期的なストレージを持つフィルター滅菌します。
注:モンジュイックに塩を準備する (18.2 MΩ 25 ° C での電気抵抗) と超高純度の脱イオン水だけを使用します。 - 5 X 塩溶液の 1 L 在庫を準備、1 M CaCl2、1 M MgSO4MgCl2、1.6 mL 900 mL 純水に食塩を 5 M の KCl の 0.5 mL の 0.5 mL の 5 mL の 5 mL を組み合わせます。このソリューションに 0.504 NaHCO3 g を加えて混ぜ合わせます。塩酸と 7.0 に pH を調整します。
- 希釈原液を大容量カーボイなど滅菌コンテナーにおける超純水の使用濃度 X 1 X この 5 (材料の表を参照してくださ....
- 1 X Montjuïc 塩溶液でプラナリアを維持します。水をプラナリアを準備するには、個々 の在庫ソリューション 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2の 1 M の KCl と純水で 5 M の NaCl を確認します。0.2 μ m ボトル上部フィルターの長期的なストレージを持つフィルター滅菌します。
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結果
アジ化ナトリウムへの暴露は、プラナリア、原因を伸ばし、身をよじる動物の通常の運動を混乱させます。これらの動きを強制的に咽頭、動物の腹部の側面から出てくるとアジ化ナトリウム溶液で約 6 分後、咽頭の白の先端を見ることができる(図 1 bの左側のパネル)。数分後、動物は積極的に契約し、強制的にボディからそれを押すことによって咽頭までのばします。(図 1 bの中央のパネル)。約アジ化暴露後 11 分、動物および咽頭おくつろぎください。この段階で、咽頭の特徴的なベル形がはっきりと見える(図 1 bの右側のパネル)。簡単切断、リラックスして咽頭を待機する重要です。
咽頭が、大きいので削.......
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ディスカッション
このプロトコルでは、アジ化ナトリウムを使用して咽頭の選択的アブレーションの方法について説明します。プラナリアの他のアブレーションの対象となる研究は、視細胞21または22ドーパミン作動性ニューロンをアブレーションするのに薬物治療を削除するのに修正手術を使用しています。既存の方法と比べて化学切断の 1 つの重要な利点は、手術が必要ないことです。プラナリアの体の残りの部分に比べ、咽頭の堅い構造くらい柔らかい bodied である動物からの完全な除去が容易になります。また、咽頭は咽頭や大きな手術ツールによって引き起こされたものよりもより再現可能な傷を生成する腸に参加する微小ジョセフソン接合 (食道)30動物からデタッチします。物性および動物の残りの部分に小さな解剖学的連携に基づく、咽頭の除去は、したがって他の外科的切断よりもより均一な傷を生成します。
アジ化ナトリウムへの露出の長さもこの手法の成功のために重要です。ただし、アジ化ナトリウムを簡単に暴.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
初期の最適化と本手法の開発を支えたアレハンドロ ・ サンチェス アルバラドに感謝したいと思います。キャロリン ・ アドラー研究所での仕事は、コーネル大学スタートアップ資金によってサポートされます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 塩化カルシウム二水和物(CaCl2) | フィッシャーケミカル | C79-3 | モンジュïc 塩溶液 |
| 硫酸マグネシウム無水 (MgSO4) | フィッシャーケミカル | M65-3 | モンジュイウム;c塩溶液 |
| 塩化マグネシウム六水和物(MgCl2) | Acros / VWR | 41341-5000 | Montjuïc塩溶液 |
| 塩化カリウム(KCl) | Acros Organics / VWR | 196770010 | Montjuïc 塩溶液 |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc 塩溶液 |
| 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc 塩溶液 |
| Nalgene オートクレーブ可能なポリプロピレン共重合体 ローボーイ スピゴット付き | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | プラナリア水の保存 |
| インスタント オーシャン 海 塩 | スペクトル ブランド | アマゾン | プラナリア水 |
| ゲンタマイシン硫酸塩 | ジェミニ バイオ製品 | 400-100P | プラナリア水 |
| カミソリの刃 | 電子顕微鏡 科学 | 71970 | レバーをミンチにする |
| 使い捨てペストリーバッグ-16インチ、12パック | ウィルトン | アマゾン | 肝臓アリコート |
| 5mLシリンジ | / VWR | 309647 | 肝臓アリコート |
| トリ皿-35mm / 60mm | グライナーバイオワン/ VWR | 82050-536 / 82050-544 | |
| プラスチック容器(さまざまなサイズ) | ジップロック | アマゾン | 静的培養のプラナリア |
| シグマ | S2002 | ||
| トランスファーピペット | Globe Scientific | 138030 | |
| 鉗子 - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| トリトン X-100 | シグマ | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| ストレプトアビジン、Alexa Fluor 488 コンジュゲート | ThermoFisher | S11223 | |
| グリセロール | フィッシャーバイオ試薬 | BP229-1 |
参考文献
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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再版と許可
